一種過敏原陽性血清的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種過敏原陽性血清的制備方法，包括依次進行的如下步驟：步驟1、用自身免疫抗原對健康動物進行多次免疫，每次免疫之前，對健康動物進行取血測定OD值，當OD值穩(wěn)定后，免疫結束，進行取血，獲得抗血清；步驟2、對步驟1所得的抗血清進行親和純化得到IgG抗體；步驟3、將步驟2所得的IgG抗體和人IgE抗體按質(zhì)量比為1:1~2偶聯(lián)后，經(jīng)分離純化獲得IgG-IgE連接物濃溶液，將IgG-IgE連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5~1μg/ml，即得陽性血清。本發(fā)明方法可批量制備各種過敏原的陽性血清，解決了檢測試劑盒制備過程中的陽性質(zhì)控問題，也可以作為校準品的生產(chǎn)原料，并且本制備方法簡單易行。
【專利說明】一種過敏原陽性血清的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于體外診斷【技術領域】，具體涉及一種過敏原陽性血清的制備方法。
【背景技術】
[0002]過敏是一種機體的變態(tài)反應，是人對正常物質(zhì)(過敏原)的一種不正常的反應，當過敏原接觸到過敏體質(zhì)的人群才會發(fā)生過敏，過敏原有花粉、粉塵、異體蛋白、化學物質(zhì)、紫外線等幾百種。在過敏反應的發(fā)生過程中，過敏介質(zhì)起著直接的作用，過敏原是過敏病癥發(fā)生的外因，而機體免疫能力低下，大量自由基對肥大細胞和嗜堿粒細胞的氧化破壞是過敏發(fā)生的內(nèi)因。一般來講，當過敏原第一次進入機體時，與肥大細胞或者是嗜堿性粒細胞結合，產(chǎn)生白三烯，前列腺素等等的過敏因子，但并不會立即產(chǎn)生過敏，此特性有些將維持2?3天，有的數(shù)月。當機體第二次接受這種過敏原時，肥大細胞才會變形，產(chǎn)生過敏因子，也就產(chǎn)生了 一系列的過敏現(xiàn)象。
[0003]過敏可以是體液(抗體)或者是細胞免疫機制介導的。在大多數(shù)情況下，可產(chǎn)生過敏反應的抗體屬于IgE類，這些個體可以歸類于患有IgE-介導的過敏反應。然而，并非所有的特異反應性個體都會發(fā)生與IgE相關的過敏反應；在非-1gE-介導的過敏反應中，抗體也可以屬于IgG—類，例如:包含右旋糖苷的免疫復合物導致的過敏性休克和和現(xiàn)在罕見的血清病，它們以前被歸于三型過敏反應。在患有過敏性支氣管肺曲霉菌病(ABPA)病人中，IgE和IgG抗體都可以被檢出。接觸性過敏性皮炎是以淋巴細胞為介導的過敏性疾病的代表。IgE檢測仍是公認的過敏檢測的主流產(chǎn)品，由于點刺注冊問題和體外檢測技術的提高，體外檢測今后將是過敏檢測主流趨勢；但是目前IgE檢測學術進展遲緩，基本沒有新的發(fā)展，因此提高檢測質(zhì)量和降低檢測成本是主要開發(fā)方向。
[0004]但是，由于過敏診斷試劑的發(fā)展緩慢以及前期人們的重視度有限，除了部分過敏原可以購買到商業(yè)血清，大部分過敏原的陽性血清還是很難查詢到的，臨床收集少量可行，大量或者高濃度的血清基本不能收集到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種可批量生產(chǎn)的過敏原陽性血清的制備方法。
[0006]為解決以上技術問題，本發(fā)明采取如下技術方案:
[0007]一種過敏原陽性血清的制備方法，包括依次進行的如下步驟:
[0008]步驟1、用自身免疫抗原對健康動物進行多次免疫，每次所述免疫之前，對所述健康動物進行取血測定OD值，當OD值穩(wěn)定后，免疫結束，進行取血，獲得抗血清；
[0009]步驟2、對步驟I所得的抗血清進行親和純化得到IgG抗體；
[0010]步驟3、將步驟2所得的IgG抗體和人IgE抗體按質(zhì)量比為1:1?2偶聯(lián)后，經(jīng)分離純化獲得IgG-1gE連接物濃溶液，將所述的IgG-1gE連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5?
Iμ g/ml，即得所述的陽性血清。[0011]優(yōu)選地,所述的健康動物為兔子。
[0012]優(yōu)選地，步驟I中，每次免疫時所采用的所述的過敏原的質(zhì)量為2?60mg。
[0013]優(yōu)選地，步驟I中，先將所述的過敏原配置成濃度為4?8mg/ml的過敏原溶液，按所述的過敏原溶液與弗氏完全佐劑的體積比為I?1.5:1配置成乳液進行首次免疫；按所述的過敏原溶液與弗式不完全佐劑的體積比為I?1.5:1配置成乳液進行后續(xù)免疫。
[0014]優(yōu)選地，所述的免疫次數(shù)為6?8次，每兩次免疫的間隔時間為12?36天。
[0015]優(yōu)選地，步驟I中，取血時采用耳緣靜脈取血。
[0016]優(yōu)選地，采用蛋白A sepharose CL-4B親和柱進行所述的親和純化。
[0017]優(yōu)選地，步驟3中，所述的IgG抗體和所述的人IgE抗體分別通過所述的2-亞胺四氫噻吩偶聯(lián)劑和4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯偶聯(lián)劑活化后，在2?8°C下進行偶聯(lián)。
[0018]優(yōu)選地,步驟3中，采用Supperdex200凝膠純化柱進行所述的分離純化。
[0019]優(yōu)選地，步驟3中，采用含質(zhì)量比為0.4?6%的牛血清白蛋白、ρΗ7.5?8.5、
0.09?0.llmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液將所述的IgG-1gE連接物濃溶液進行所述的稀釋。
[0020]由于以上技術方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點:
[0021]本發(fā)明方法可批量制備各種過敏原的陽性血清，解決了檢測試劑盒制備過程中的陽性質(zhì)控問題，也可以作為校準品的生產(chǎn)原料，并且本制備方法簡單易行。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]附圖1為經(jīng)蛋白A sepharose CL-4B親和柱純化的兔抗牛肉IgG蛋白條帶?！揪唧w實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進一步調(diào)整，未注明的實施條件為本行業(yè)中的常規(guī)條件。
[0024]實施例1
[0025](一)過敏原的免疫和兔抗血清效價測定
[0026]材料與儀器
[0027]1、過敏原:過敏原凍干粉，過敏原為牛肉；
[0028]2、佐劑:商品化的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑；
[0029]3、動物:選3只(每種過敏原免疫3只兔子)2月齡、體重1.5?2.0kg的健康新西蘭大白兔；
[0030]4、二抗:HRP標記的羊抗兔IgG ；
[0031]5、耗材:三通器、一次性注射器、移液器等。
[0032]免疫步驟
[0033]1、免疫過敏原準備:用BCA法確定凍干粉溶解后過敏原的濃度，取4mg過敏原用PBS稀釋至600ul，用三通器將過敏原與完全佐劑或不完全佐劑(過敏原V:佐劑V=6:5)乳化，直至將一滴乳液滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散則過敏原準備好。首次免疫用弗氏完全佐劑，后續(xù)免疫均用弗氏不完全佐劑。
[0034]2、動物免疫:將購買的3只新西蘭大白兔在動物房養(yǎng)殖I周，使動物適應環(huán)境；將制備好的乳液，用Iml注射器進行頸部或背部皮下免疫注射，每只新西蘭大白兔注射3點，每點注射300ul ;免疫周期為14天。
[0035]3、抗血清的制備:每只動物免疫前先于一側(cè)耳緣靜脈抽取2mL血(作為空白對照)，之后每次免疫14天后，下次免疫前進行耳緣靜脈取血用于抗血清評價；取血后取下針頭，將注射器中的血緩緩轉(zhuǎn)移至離心管中，于4°C冰箱中過夜，取上清即為血清，析出淡黃色抗血清；將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中，血凝塊以1500xg離心10min。吸出上清液合并收集到的抗血清管中；抗血清分裝保存于一 70°C。
[0036]4、抗血清效價的測定:采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA),用包被緩沖液將過敏原稀釋至10ug/ml,除陰性孔外每孔加IOOul即Iug ;陰性對照I和陰性對照2各包被Iug羊肉和花生過敏原，4°C包被過夜；空白對照1:免疫過敏原前取血；空白對照2: —抗孵育封閉液，其中不含一抗抗體；空白對照3 =HRP標記的羊抗兔IgG孵育封閉液；其余孔為按1:100、1:200倍比稀釋的抗血清，進行效價測定。每次效價測定時平行進行上次收集抗血清的效價測定，前后兩次免疫后抗血效價差異不大，則可以終止免疫殺兔取血，如果效價還有明顯提高則繼續(xù)免疫。
[0037]以牛肉免疫兔后抗血清評價結果表1:
[0038]表1
[0039]
【權利要求】
1.一種過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:包括依次進行的如下步驟: 步驟1、用自身免疫抗原對健康動物進行多次免疫,每次所述免疫之前,對所述健康動物進行取血測定OD值，當OD值穩(wěn)定后，免疫結束，進行取血，獲得抗血清； 步驟2、對步驟I所得的抗血清進行親和純化得到IgG抗體； 步驟3、將步驟2所得的IgG抗體和人IgE抗體按質(zhì)量比為1: f 2偶聯(lián)后，經(jīng)分離純化獲得IgG-1gE連接物濃溶液，將所述的IgG-1gE連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5^1 μ g/ml,即得所述的陽性血清。
2.根據(jù)權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:所述的健康動物為兔子。
3.根據(jù)權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟I中，每次免疫時所采用的所述的過敏原的質(zhì)量為2飛Omg。
4.根據(jù)權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟I中，先將所述的過敏原配置成濃度為r8mg/ml的過敏原溶液，按所述的過敏原溶液與弗氏完全佐劑的體積比為廣1.5:1配置成乳液進行首次免疫；按所述的過敏原溶液與弗式不完全佐劑的體積比為廣1.5:1配置成乳液進行后續(xù)免疫。
5.根據(jù)權利要求1或4所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:所述的免疫次數(shù)為6~8次，每兩次免疫的間隔時間為12~36天。
6.根據(jù)權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟I中，取血時采用耳緣靜脈取血。
7.根據(jù)權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:采用蛋白Asepharose CL-4B親和柱進行所述的親和純化。
8.根據(jù)權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟3中，所述的IgG抗體和所述的人IgE抗體分別通過所述的2-亞胺四氫噻吩偶聯(lián)劑和4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯偶聯(lián)劑活化后，在疒8°C下進行偶聯(lián)。
9.根據(jù)權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟3中，采用Supperdex200凝膠純化柱進行所述的分離純化。
10.根據(jù)權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟3中，采用含質(zhì)量比為0.4~6%的牛血清白蛋白、pH7.5~8.5,0.09、.llmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液將所述的IgG-1gE連接物濃溶液進行所述的稀釋。
【文檔編號】G01N33/531GK103926396SQ201410128592
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月1日 優(yōu)先權日:2014年4月1日
【發(fā)明者】孫嬋, 丁俊榮, 宋孟杰, 李永紅, 李慶春, 左云國 申請人:蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司