一種預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花抗蟲性強(qiáng)度的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花抗蟲性強(qiáng)度的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。包括：棉籽浸種、取種胚，利用Cry1Ab/Ac的ELISA試劑盒進(jìn)行Bt毒蛋白的提取，毒蛋白含量測(cè)定，采用測(cè)定的毒蛋白含量劃分其抗性等級(jí)。本發(fā)明提供了一種抗蟲棉抗性強(qiáng)度的早期預(yù)測(cè)方法，即通過(guò)檢測(cè)棉種胚的毒蛋白含量水平來(lái)早期預(yù)測(cè)抗蟲棉株未來(lái)整體抗蟲性的強(qiáng)弱。該方法只需少量棉種，通過(guò)利用其種胚在室內(nèi)檢測(cè)其毒蛋白含量，即可對(duì)棉種的抗蟲性進(jìn)行快速評(píng)判，為提升轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的育種效率提供技術(shù)支持。
【專利說(shuō)明】一種預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花抗蟲性強(qiáng)度的方法
[0001]一、【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及利用棉種胚預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花抗蟲性強(qiáng)度的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]二、【背景技術(shù)】
轉(zhuǎn)基因抗蟲棉表達(dá)的抗蟲性強(qiáng)度是維持品種對(duì)棉鈴蟲持久抗性的重要保障。因此，檢測(cè)抗蟲棉的抗蟲性強(qiáng)度也就成了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉安全性評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。一個(gè)可以在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的抗蟲棉品種，其綜合抗蟲性強(qiáng)度一般要達(dá)抗級(jí)水平。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有檢測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉抗蟲性主要有以下2種方法:
1、葉片毒蛋白表達(dá)量檢測(cè):在蕾期，取抗株棉花頂端葉片，按ELISA方法測(cè)定Bt毒蛋白定量含量，確定Bt表達(dá)量水平(全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心.中國(guó)棉花新品種動(dòng)態(tài).中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2013年版，P139)。其中:不表達(dá)，Bt蛋白≤5ng/g鮮重；低表達(dá)，5ng/g< Bt蛋白< 150ng/g鮮重；中表達(dá)，150ng/g < Bt蛋白< 300ng/g鮮重；中高表達(dá)，300ng/g < Bt蛋白≤450ng/g鮮重；高表達(dá)，Bt蛋白> 450ng/g鮮重。
[0003]2、綜合生物學(xué)抗蟲性檢測(cè):包括(I)苗期抗蟲性鑒定，采取室內(nèi)棉苗葉片接蟲法；(2)蕾鈴期抗蟲性鑒定，采用田間罩籠接蛾法。而后根據(jù)室內(nèi)、室外抗性鑒定進(jìn)行量化，按單次高抗的賦值4，抗的賦值3，低抗的賦值2，不抗的賦值1，累計(jì)各項(xiàng)次鑒定結(jié)果的抗性值，得到該品種綜合抗性值(K)、平均抗性值(PK)?？剐缘燃?jí)的綜合評(píng)判根據(jù)PK值的大小進(jìn)行量化。其抗級(jí)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為:PK值小于等于1.5為不抗，PK值大于1.5小于等于2.5為低抗，PK值大于2.5小于等于3.5為抗，PK值大于等于3.5為高抗(柏立新，束春娥，張龍娃，等.棉花新品種(系)抗棉鈴蟲鑒定與綜合量化評(píng)估.中國(guó)棉花，2004，31 (1):19-22)。
[0004]上述兩種方法用于已經(jīng)定型的少量品系檢測(cè)有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值；但對(duì)于大量早期育種材料——比如單株、株行等的鑒定，以上兩種方法具有明顯的局限性:(1)時(shí)效性較差:必須在蕾期以后才能取組織樣品來(lái)檢測(cè)品種的抗蟲性；(2)耗財(cái)費(fèi)力:需將檢測(cè)材料進(jìn)行播種出苗，而后移栽到大田，待棉株長(zhǎng)到現(xiàn)蕾期才能取樣檢測(cè)，需大量人力、物力的投入。
[0005]對(duì)于棉花育種者來(lái)說(shuō)，尋找一種早期快速檢測(cè)抗蟲棉抗性的技術(shù)至關(guān)重要。這樣可以大大節(jié)省育種人力、物力的投入，提高抗蟲棉育種的目的性與選擇效率。
[0006]一般說(shuō)來(lái)，抗蟲棉的整體抗性強(qiáng)度與Bt毒蛋白的整體組成型表達(dá)量密切相關(guān)。由于在棉株在發(fā)育過(guò)程中，Bt毒蛋白的表達(dá)具有一定的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化(陳松，吳敬音，何小蘭，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉組織中Bt毒蛋白表達(dá)量的ELISA測(cè)定，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1997，13 (3):154-156)，能否通過(guò)棉種早期器官的毒蛋白含量測(cè)定來(lái)比較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)后來(lái)棉株整體的抗性水平，乃是本發(fā)明重點(diǎn)要解決的問(wèn)題所在。
[0007]不同棉種的籽指大小存在一定差異，對(duì)應(yīng)其種仁大小也存在一定差異。已知棉種的種仁=子葉+種胚(胚芽+胚軸+胚根)(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所主編.中國(guó)棉花栽培學(xué).上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，Ρ115-116)。其中子葉約占整個(gè)種仁的95%的比重，種胚約占5%左右。與子葉相比，單個(gè)種胚在不同品種間，其重量差異相對(duì)較小，具有相互比較的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)棉花長(zhǎng)出5-6片真葉后，子葉完成其生命周期自行脫落。去除子葉后，構(gòu)建后來(lái)棉株整體的其實(shí)就是種胚(即:胚芽+胚軸+胚根)。棉種胚盡管占的比重很少，但卻是形成棉花未來(lái)成體的“微型植株”，是棉株未來(lái)整體在早期的縮影，是后來(lái)棉株整體的“微縮版”。它們的生化物質(zhì)構(gòu)成特點(diǎn)基本可以反映出未來(lái)成株組成型生化物質(zhì)的基本構(gòu)成特點(diǎn)。基于以上認(rèn)知，本發(fā)明擬采用棉種胚的毒蛋白表達(dá)量來(lái)預(yù)測(cè)后來(lái)棉株整體的毒蛋白表達(dá)水平，即通過(guò)對(duì)種胚毒蛋白含量的定量檢測(cè)來(lái)早期預(yù)測(cè)抗蟲棉株未來(lái)整體的抗性水平。
[0008]三、
【發(fā)明內(nèi)容】
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明目的是擬提供一種可在早期進(jìn)行快速檢測(cè)的技術(shù)，一種抗蟲棉抗性強(qiáng)度的早期預(yù)測(cè)方法，即通過(guò)檢測(cè)棉種胚的毒蛋白含量水平來(lái)早期預(yù)測(cè)抗蟲棉株未來(lái)整體抗蟲性的強(qiáng)弱。該方法只需少量棉種，通過(guò)利用其種胚在室內(nèi)檢測(cè)其毒蛋白含量，即可對(duì)棉種的抗蟲性進(jìn)行快速評(píng)判，為提升轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的育種效率提供技術(shù)支持。
[0009]技術(shù)方案
利用棉種胚預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花抗蟲性的方法，包括: 1、棉種在25°C的溫室浸種20-28小時(shí)，取浸種后的種子20粒，用手按棉種，在珠孔端擠出完整種胚或剝出種胚；
2、每個(gè)材料稱取0.10-0.15g種胚或數(shù)15個(gè)種胚，加0.25-0.5ml CrylAb/Ac的ELISA試劑盒樣品提取液，用組織研磨器勻衆(zhòng)3min,轉(zhuǎn)入1.5ml離心管,6000轉(zhuǎn)/min,離心10 min,取上清液待檢，殘禮:棄去；
3、加標(biāo)樣及待測(cè)樣:將Bt標(biāo)樣(由CrylAb/Ac的ELISA試劑盒提供)用樣品稀釋液配成45、15、5、1.7 ng/ml ο將系列標(biāo)準(zhǔn)樣加入96孔的CrylAb/Ac的酶標(biāo)板的前兩列,每個(gè)濃度加2孔，每孔50 μ I。其余孔加待測(cè)樣，每個(gè)樣本依次2倍稀釋2個(gè)濃度。(按預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，若某樣品測(cè)得的OD值超閾值，則補(bǔ)做更高濃度稀釋，直到該樣品的OD在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi))。每孔均加50 μ I。
[0010]4、加抗體:用樣品稀釋液1:1000稀釋Bt毒蛋白抗體，混勻后每孔加50 μ 1，然后將酶標(biāo)板加入濕盒內(nèi)開(kāi)始反應(yīng)，37°C條件下90 min ；
5、洗板:將反應(yīng)液甩干并在紙上拍凈用洗板機(jī)洗滌四次；
6、顯色:在每孔中加100μ I TMB, 37°C 15 min，每孔加入100 μ I鹽酸終止反應(yīng)；
7、比色:在酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)上依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物各濃度和各樣品450nm處的OD值；
8、結(jié)果計(jì)算
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品2次測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)Z為各濃度顯色OD45tl值表示，縱坐標(biāo)7為蛋白標(biāo)樣各濃度值(ng/ml)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
[0011]待測(cè)樣品毒蛋白含量計(jì)算:根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程，從顯色OD45tl值，計(jì)算出被測(cè)樣品的蛋白濃度(ng/ml);而后乘稀釋倍數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣品的平均毒蛋白含量(ng/ml)。最后依據(jù)公式:樣品平均毒蛋白濃度(ng/ml) X樣品原體積/樣品胚重量，即得樣品每克種胚鮮重的毒蛋白含量(ng/g)。
[0012]9、按毒蛋白劃分抗性等級(jí)
采用測(cè)定的毒蛋白含量劃分其抗性等級(jí)，具體標(biāo)準(zhǔn)如下:
不抗-Bt蛋白< 5ng/g鮮重；
低抗-5ng/g < Bt蛋白≤150ng/g鮮重；
中抗-150ng/g < Bt 蛋白 < 300ng/g 鮮重； 中高抗-300ng/g < Bt蛋白< 450ng/g鮮重；
高抗-Bt蛋白> 450ng/g鮮重。
[0013]有益效果
本發(fā)明提供了一種抗蟲棉抗性強(qiáng)度的早期預(yù)測(cè)方法，即通過(guò)檢測(cè)棉種胚的毒蛋白含量水平來(lái)早期預(yù)測(cè)抗蟲棉株未來(lái)整體抗蟲性的強(qiáng)弱。該方法只需少量棉種，通過(guò)利用其種胚在室內(nèi)檢測(cè)其毒蛋白含量，即可對(duì)棉種的抗蟲性進(jìn)行快速評(píng)判，為提升轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的育種效率提供技術(shù)支持。試驗(yàn)證明，根據(jù)胚組織與葉組織的抗性級(jí)別量化值，兩者進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示:兩者抗性級(jí)別的相關(guān)系數(shù)R=0.783**，達(dá)極顯著相關(guān)水平，表明可以利用種胚的毒蛋白表達(dá)量來(lái)早期預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的抗蟲性強(qiáng)度。利用種胚毒蛋白預(yù)測(cè)抗性與生物學(xué)綜合抗蟲鑒定結(jié)果列于表3。在測(cè)定的9個(gè)品系中，兩者抗性級(jí)別的吻合度高達(dá)88.9%。該研究結(jié)果顯示:測(cè)定種胚毒蛋白表達(dá)量也可以在早期快速預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的生物學(xué)抗蟲性級(jí)別。
[0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015]一、利用棉種胚預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花抗蟲性的方法，包括:
(一)棉籽浸種
棉種(非脫絨毛子、脫絨光子皆可)，在25°C的溫室浸種24小時(shí)左右。通過(guò)浸種有利于種胚的快速擠出。
[0016](二)取種胚
取浸種后的種子20粒，用手按棉種，在珠孔端擠出完整種胚(或剝出種胚)。每個(gè)材料稱種胚0.1克,約合15個(gè)種胚。
[0017](三)Bt毒蛋白ELISA檢測(cè) 1.實(shí)驗(yàn)器材
組織碾磨機(jī)，冷凍離心機(jī)，酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)，吸水紙，恒溫箱，冰箱，酶標(biāo)板，可調(diào)微量液體加樣器(10μ 1,40 μ 1,200 μ 1,1000 μ I)。
[0018]2.試劑
(1)CrylAb/Ac的ELISA試劑盒(由上海佑隆生物技術(shù)有限公司提供)
(2)磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4.12H20，用蒸懼水定容至I 000 ml (pH 7.5)。
[0019](3)洗滌液:PBS，0.05% Tween 20
(4)樣品提取液:專用Bt毒蛋白提取液(由CrylAb/Ac的ELISA試劑盒提供)
(5)稀釋液:PBST-1%BSA
(6)TMB顯色液:試劑盒提供
(7)終止液:1MHCL 3.Bt毒蛋白的提取
(1)稱取0.1g種胚,加0.5ml樣品提取液,用組織研磨器勻衆(zhòng)3min,轉(zhuǎn)入1.5ml離心管,6000 轉(zhuǎn)/min,離心 10 min,
(2)取上清液待檢，殘?jiān)鼦壢?。[0020]4.毒蛋白含量測(cè)定
(I)加標(biāo)樣及待測(cè)樣:將Bt標(biāo)樣(由Cry lAb/Ac的ELISA試劑盒提供)用樣品稀釋液配成45、15、5、1.7 ng/ml ο將系列標(biāo)準(zhǔn)樣加入96孔的Cry lAb/Ac的酶標(biāo)板的前兩列,每個(gè)濃度加2孔，每孔50 μ I。其余孔加待測(cè)樣:按預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，依次做2個(gè)濃度稀釋，保證各樣品的OD值均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，每孔加樣50 μ I。
[0021](2)加抗體:用樣品稀釋液1:1000稀釋抗體(由Cry lAb/Ac的ELISA試劑盒提供)，混勻后每孔加50 μ 1，然后將酶標(biāo)板加入濕盒內(nèi)開(kāi)始反應(yīng)，37°C條件下90 min。
[0022](3)洗板:將反應(yīng)液甩干并在紙上拍凈用洗板機(jī)洗滌四次。
[0023](4)顯色:在每孔中加100μ I TMB，37°C 15 min，每孔加入100 μ I鹽酸終止反應(yīng)。
[0024](5)比色:在酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)上依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物各濃度和各樣品450nm處的OD值。
[0025](四)結(jié)果計(jì)算
1、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)Z為各濃度顯色OD45tl值表示，縱坐標(biāo)7為蛋白標(biāo)樣各濃度值(ng/ml)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:7 = 0.6339J 2 + 19.275J - 1.3305(R2=0.9998)。
[0026]2、待測(cè)樣品毒蛋白含量計(jì)算:根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程，從顯色OD450值，計(jì)算出被測(cè)樣品的蛋白濃度(ng/ml);而后乘稀釋倍數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣品的平均毒蛋白含量(ng/ml)。最后依據(jù)公式:樣品平均毒蛋白濃度(ng/ml)X樣品原體積(0.5ml)/樣品胚重量(0.1g),得樣品每克種胚鮮重的毒蛋白含量(ng/g)。
[0027](五)按毒蛋白劃分抗性等級(jí)
采用測(cè)定的毒蛋白含量劃分其抗性等級(jí)。具體標(biāo)準(zhǔn)如下:
不抗-Bt蛋白≤ 5ng/g鮮重；
低抗-5ng/g < Bt蛋白≤150ng/g鮮重；
中抗-150ng/g < Bt 蛋白 ≤ 300ng/g 鮮重；
中高抗-300ng/g < Bt蛋白≤50ng/g鮮重；
高抗-Bt蛋白> 450ng/g鮮重。
[0028]二、種胚預(yù)測(cè)抗性級(jí)別與葉片檢測(cè)抗性級(jí)別之間的相關(guān)性
試驗(yàn)材料:(1) 2013年5月8號(hào)將9個(gè)材料的棉種在25°C條件下做浸種24小時(shí)，5月9號(hào)擠出種胚，取樣測(cè)定。(2) 2013年7月8號(hào)在大田取9個(gè)材料的倒1_2嫩葉，測(cè)定葉片毒蛋白。
[0029]利用Bt毒蛋白試紙盒(即Cry lAb/Ac的ELISA試劑盒)測(cè)定各材料的毒蛋白表達(dá)量結(jié)果，并按標(biāo)準(zhǔn)確定各材料的抗性級(jí)別(見(jiàn)表1)。由表可見(jiàn):按種胚毒蛋白測(cè)定結(jié)果確定的抗性級(jí)別與測(cè)定葉片毒蛋白確定的抗性抗性級(jí)別——9個(gè)材料中有6個(gè)材料確定的抗性
級(jí)別完全一致。
[0030]同時(shí)對(duì)胚組織與葉組織的檢測(cè)結(jié)果，按毒蛋白含量進(jìn)行抗性等級(jí)量化賦值，其標(biāo)準(zhǔn)如下:
0-不抗(Bt蛋白≤ 5ng/g鮮重)；
1-低抗(5ng/g < Bt 蛋白≤150ng/g 鮮重)；
2-中抗(150ng/g < Bt 蛋白≤ 300ng/g 鮮重)；3-中高抗(300ng/g < Bt蛋白≤450ng/g鮮重)；
4-高抗(Bt蛋白> 450ng/g鮮重)。
[0031]根據(jù)胚組織與葉組織的抗性級(jí)別量化值，兩者進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示:兩者抗性級(jí)別的相關(guān)系數(shù)R=0.783**，達(dá)極顯著相關(guān)水平。該研究表明:可以利用種胚的毒蛋白表達(dá)量來(lái)早期預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的抗蟲性強(qiáng)度。
[0032]表1、轉(zhuǎn)基因棉花的種胚與頂葉的毒蛋白含量及抗性級(jí)別
【權(quán)利要求】
1.利用棉種胚預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花抗蟲性的方法，包括: 1)棉種在25°C條件下浸種20-28小時(shí)，取浸種后的種子20粒，用手按棉種，在珠孔端擠出完整種胚或剝出種胚； 2)稱取0.10-0.15g種胚或數(shù)15個(gè)種胚，加0.25-0.5ml CrylAb/Ac的ELISA試劑盒樣品提取液，用組織研磨器勻衆(zhòng)3min,轉(zhuǎn)入1.5ml離心管,6000轉(zhuǎn)/min,離心10 min,取上清液待檢，殘?jiān)鼦壢ィ? 3)加標(biāo)樣及待測(cè)樣:將Bt標(biāo)樣用樣品稀釋液配成45、15、5、1.7ng/ml ;將系列標(biāo)準(zhǔn)樣加入96孔的CrylAb/Ac的酶標(biāo)板的前兩列，每個(gè)濃度加2孔，每孔50 μ I ;其余孔加待測(cè)樣:按預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，依次2倍做2個(gè)濃度稀釋，保證各樣品的OD值均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，每孔加樣 50 μ I ; 4)加抗體:用樣品稀釋液1:1000稀釋Bt毒蛋白抗體，混勻后每孔加50μ 1，然后將酶標(biāo)板加入濕盒內(nèi)開(kāi)始反應(yīng)，37°C條件下90 min ； 5)洗板:將反應(yīng)液甩干并在紙上拍凈用洗板機(jī)洗滌四次； 6)顯色:在每孔中加100μ I TMB, 37°C 15 min，每孔加入100 μ I鹽酸終止反應(yīng)； 7)比色:在酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)上依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物各濃度和各樣品450nm處的OD值； 8)結(jié)果計(jì)算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品2次測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 其中橫坐標(biāo)Z為各濃度顯色OD45tl值表示，縱坐標(biāo)7為蛋白標(biāo)樣各濃度值ng/ml，擬合曲線得出標(biāo)準(zhǔn)方程； 待測(cè)樣品毒蛋白含量計(jì)算:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，從顯色OD45tl值，計(jì)算出被測(cè)樣品的蛋白濃度ng/ml ;而后乘稀釋倍數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣品的平均毒蛋白含量ng/ml，最后依據(jù)公式:樣品平均毒蛋白濃度ng/mlX樣品原體積/樣品胚重量，得樣品每克種胚鮮重的毒蛋白含量ng/g ； 9)按毒蛋白劃分抗性等級(jí) 采用測(cè)定的毒蛋白含量劃分其抗性等級(jí)，具體標(biāo)準(zhǔn)如下: 不抗-Bt蛋白≤ 5ng/g鮮重； 低抗-5ng/g < Bt蛋白≤150ng/g鮮重； 中抗-150ng/g < Bt 蛋白 ≤ 300ng/g 鮮重； 中高抗-300ng/g < Bt蛋白≤450ng/g鮮重； 高抗-Bt蛋白> 450ng/g鮮重。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103884848SQ201410130084
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】陳旭升, 狄佳春, 趙亮 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院