用于牛羊早期妊娠診斷的isg15膠體金試紙條及其制作方法
【專(zhuān)利摘要】公開(kāi)了一種用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條，由含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜樣品墊和吸水墊組成，含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜樣品墊和吸水墊粘貼在PVC底板上，玻璃纖維膜樣品墊和含有金標(biāo)ISG15抗體的金標(biāo)墊與硝酸纖維素膜首尾相接，硝酸纖維素膜與吸水墊尾首相接；在硝酸纖維素膜上有ISG15抗體檢測(cè)線和羊抗鼠二抗對(duì)照線，ISG15抗體檢測(cè)線靠近含有金標(biāo)ISG15抗體的金標(biāo)墊一側(cè)。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果清晰、可通過(guò)肉眼判定結(jié)果、無(wú)需復(fù)雜操作技巧和特殊設(shè)備、靈敏度高、無(wú)污染且攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條及其制作方

法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條及其制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]提高牛羊的繁殖率，盡量縮短空懷期是牛羊飼養(yǎng)管理的目標(biāo)之一。因此牛羊早期妊娠診斷是促進(jìn)牛羊發(fā)展的重要措施。簡(jiǎn)便而有效的牛羊早期妊娠診斷方法，是牛羊生產(chǎn)者及畜牧工作者長(zhǎng)期以來(lái)急待解決的問(wèn)題。因?yàn)榕Ｑ蛟缙谌焉镌\斷是改善牛羊飼養(yǎng)管理，提高繁殖率的一項(xiàng)重要措施。如果牛羊配種后不能及時(shí)診斷是否妊娠，就可導(dǎo)致產(chǎn)犢(羔)間隔延長(zhǎng)、繁殖率降低，飼養(yǎng)管理成本增高，大大影響經(jīng)濟(jì)效益。目前我國(guó)牛羊的第一情期受孕率僅40-60%，多數(shù)牛羊需配種(或人工授精)2-3次才能受孕，以延誤1-2個(gè)發(fā)情周期計(jì)算，就相當(dāng)于每頭/只繁殖牛羊多飼養(yǎng)20-40多天，增加了飼養(yǎng)成本。可見(jiàn)，牛羊早期妊娠診斷技術(shù)的研究，對(duì)縮短空懷期，提高繁殖率，進(jìn)一步促進(jìn)牛羊業(yè)的發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。
[0003]目前在牛羊早期妊娠診斷中常用的幾種方法有:直腸診斷法(牛)，超聲波診斷法(牛羊)，孕酮的放射免疫法(牛羊)、孕酮的酶標(biāo)免疫法(牛羊)和外部觀察法(牛羊)。其中直腸診斷法要求操作者必須具有一定的臨床經(jīng)驗(yàn)，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，有時(shí)還會(huì)引起疾病傳染或流產(chǎn)，而且40多天以后才能檢測(cè)出懷孕的征象，做出正確的診斷。超聲波診斷法由于儀器昂貴和需專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作，使其廣泛應(yīng)用受限，而且需要胎兒較大時(shí)，才能檢測(cè)出來(lái)，不適合早期妊娠診斷。牛羊的外部觀察法進(jìn)行妊娠早期診斷極不準(zhǔn)確，資料報(bào)道，羊在妊娠后，有30%會(huì)出現(xiàn)發(fā)情表現(xiàn)。孕酮的放射免疫法(牛羊)和孕酮的酶標(biāo)免疫法(牛羊)，可以直接檢測(cè)牛羊血液或奶中的孕酮含量，但是需要在牛羊發(fā)情周期的發(fā)情期進(jìn)行檢測(cè)，由于牛羊發(fā)情周期不同(朱士恩，家畜繁殖學(xué)，2009)，黃牛和奶牛平均21天(18-24)，綿羊平均16-17天(14-19)，山羊平均20天(18-22)。并且不同牛羊個(gè)體之間發(fā)情周期還存在差異。另外，由于持久黃體和黃體囊腫也會(huì)持續(xù)分泌孕酮。這樣檢測(cè)孕酮含量并不能非常準(zhǔn)確確定牛羊妊娠與否。
[0004]因此，研究一種使用簡(jiǎn)便的用于牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條及其制作方法，是目前需要解決的技術(shù)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題提供一種用于牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條及該用于牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條的制作方法。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是:
用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條，由含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜樣品墊和吸水墊組成，含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜樣品墊和吸水墊粘貼在PVC底板上，玻璃纖維膜樣品墊和含有金標(biāo)ISG15抗體的金標(biāo)墊與硝酸纖維素膜首尾相接，硝酸纖維素膜與吸水墊尾首相接；在硝酸纖維素膜上有ISG15抗體檢測(cè)線和羊抗鼠二抗對(duì)照線，ISG15抗體檢測(cè)線靠近含有金標(biāo)ISG15抗體的金標(biāo)墊一側(cè)。
[0007]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，羊抗鼠二抗對(duì)照線距吸水墊近端0.3-0.6cm, ISG15抗體檢測(cè)線與吸水墊近端相距0.8-1.3cm。
[0008]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，羊抗鼠二抗對(duì)照線的羊抗鼠二抗的噴涂濃度為
0.2-2mg/mL, ISG15抗體檢測(cè)線的ISG15抗體的噴涂濃度為5-10 μ g/mL。
[0009]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，試紙條大小為6_8cmX 0.3-0.6cm,吸水墊長(zhǎng)
1.8-2.2cm、樣品墊長(zhǎng)1.8-2.2cm、含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊長(zhǎng)0.6-1.0cm、硝酸纖維素膜長(zhǎng)2-3cm ;硝酸纖維素膜貼在底板上，硝酸纖維素膜與底板吸水端邊緣相距1.3-1.8cm ;吸水墊與硝酸纖維素膜(3)交疊貼于底板吸水端，樣品墊、含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊與硝酸纖維素膜由上而下依次交疊，含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊位于樣品墊和硝酸纖維素膜之間，含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊與硝酸纖維素膜的交疊長(zhǎng)度為0.8-1.0mm。
[0010]用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條的制備方法，具體制備步驟如下:
第一步，制備膠體金:將0.01% HAuCl4水溶液IOOmL加熱至沸騰，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液ImL,加熱至透明紅色,制得膠體金顆粒大小40nm ；
第二步，制備純化ISG15單克隆抗體:重組牛ISG15免疫Balb/c小鼠；骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合；采用陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞制備腹水；ISG15單克隆抗體的提純；
第二步的具體操作為:
1.動(dòng)物免疫:重組牛ISG15免疫Balb/c小鼠，采用四次免疫的方法，第一次采用弗氏完全佐劑(FCA) 0.2mL+0.2mg重組牛ISG15，第二次采用弗氏不完全佐劑(FIA) 0.2mL+0.2mg重組牛ISG15，第三次采用FIA 0.2mL +0.2mg重組牛ISG15，第四次單獨(dú)采用重組牛ISG15，劑量加倍腹腔注射。
[0011]2.骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的準(zhǔn)備和細(xì)胞融合:細(xì)胞融合前一周復(fù)蘇凍存于液氮中的SP2/0，在含20%胎牛血清和1% HT的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0012]3.陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選與腹水單克隆抗體的制備:采用間接ELISA方法對(duì)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，用6 Pg/mL的重組牛ISG15進(jìn)行包被。對(duì)檢測(cè)為陽(yáng)性的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行2次亞克隆，取形態(tài)良好、生長(zhǎng)旺盛的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備腹水。
[0013]4.單克隆抗體的鑒定:用重組牛ISG15對(duì)制備的腹水單克隆抗體(I: 10 000稀釋)進(jìn)行免疫印跡分析，進(jìn)行DAB顯色和化學(xué)發(fā)光顯色。同時(shí)進(jìn)行ISG15在綿羊組織中的免疫印跡分析和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，進(jìn)一步對(duì)單克隆抗體進(jìn)行鑒定。
[0014]第三步，制備金標(biāo)抗體:將抗體溶液去鹽，膠體金pH值在9-9.5之間時(shí)與抗體吸附，采用離心法純化；
第三步的具體操作為: 1.取0.01%的HAuCl4溶液IOOmL，加熱至沸騰，根據(jù)需要迅速加入I %枸櫞酸三鈉水溶液lmL，同時(shí)不斷攪拌，待金黃色的HAuCl4水溶液在2 min內(nèi)變?yōu)榧t色，中速攪拌，煮沸5min,直至顏色穩(wěn)定不變，冷卻后用超純水恢復(fù)到原體積，加入0.02%的Na2N3,經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，裝入潔凈的經(jīng)硅化的棕色瓶中4°C保存。
[0015]2.取所需量抗體在磁力攪拌下與膠體金溶液混合,緩慢逐滴加ISG15單克隆抗體，I mg的抗體大約5min加完，標(biāo)記30min ;緩慢滴加5% BSA至終濃度為1%，作為穩(wěn)定劑，制備金標(biāo)抗體。抗體的最終濃度為1-10 μ g/mL。把抗體標(biāo)記的膠體金液，吸附在纖維材料上，干燥后備用。
[0016]第四步，膠體金試紙條的制備:將金標(biāo)抗體灌注在已處理好的硝酸纖維素膜上，干燥；在硝酸纖維膜上用點(diǎn)膜機(jī)將ISG15抗體和羊抗鼠二抗噴成2條線，分別為檢測(cè)線和對(duì)照線，再真空干燥；將樣品墊、金標(biāo)墊與硝酸纖維素膜首尾相接粘貼在底板上，吸水墊貼在硝酸纖維素膜的另一側(cè)，組裝制成檢測(cè)ISG15膠體金試紙條。
[0017]第四步中的硝酸纖維素膜制備，使用制膜機(jī)制膜:采用硝酸纖維素膜制作免疫層析試紙，檢測(cè)線應(yīng)用ISG15抗體制作，硝酸纖維素膜對(duì)照線由羊抗鼠二抗制成。
[0018]樣品墊由三層材料疊加組成，第一層為一定規(guī)格無(wú)紡布層、第二層為玻璃纖維層、第三層為一定規(guī)格無(wú)紡布層，上述物質(zhì)均需經(jīng)過(guò)表面活性劑緩沖液浸泡處理，干燥后備用。
[0019]作為用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條的制備方法的優(yōu)選方案，制備膠體金時(shí)，用微波爐加熱0.01 %的HAuCl4溶液IOOmL,加熱至沸騰，一次性加入1%的枸櫞酸三鈉水溶液lmL。
[0020]作為用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條的制備方法的優(yōu)選方案，制備ISG15單克隆抗體時(shí)，采用重組牛ISG15免疫Balb/c小鼠，骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合方法獲得ISG15單克隆抗體,純化后抗體濃度為l-3mg/mL。
[0021]本發(fā)明的原理:
干擾素-tau是反芻動(dòng)物胚胎向母體發(fā)出的最初妊娠信號(hào)，它是在胚胎附植前，由囊胚滋養(yǎng)層產(chǎn)生的一種I型干擾素，牛干擾素-tau的mRNA表達(dá)高峰出現(xiàn)在妊娠后第17天，在胚胎滋養(yǎng)層表達(dá)消失的時(shí)間是第25天(Roberts等，2008)。在綿羊上，干擾素_tau mRNA的表達(dá)高峰出現(xiàn)在妊娠后第16天(Godkin等，1982)，表達(dá)消失的時(shí)間是第20天。在妊娠早期，來(lái)源于孕體的干擾素-tau，可誘導(dǎo)牛羊子宮內(nèi)膜表達(dá)ISG15。近期研究發(fā)現(xiàn)，在牛羊妊娠早期，其它組織也表達(dá)ISG15。Oliveira等(2008)報(bào)道，在妊娠早期，來(lái)源于孕體的干擾素_tau，可誘導(dǎo)綿羊外周血液細(xì)胞和黃體表達(dá)ISG15。我們前期的研究也表明(Yang等，2010)，在牛妊娠早期，黃體的ISG15蛋白也上調(diào)表達(dá)，這是由于牛外周血液細(xì)胞表達(dá)ISG15引起的。
[0022]妊娠早期牛羊外周血液細(xì)胞表達(dá)ISG15也是一個(gè)非常重要的妊娠指標(biāo)。由于牛羊在受到來(lái)自早期胎兒分泌的干擾素-tau的刺激后，外周血液細(xì)胞會(huì)表達(dá)ISG15。因此，檢測(cè)外周血液細(xì)胞ISG15表達(dá)與否，可以十分準(zhǔn)確地獲悉妊娠與否。采集20-25天的牛羊外周血液，檢測(cè)血細(xì)胞ISG15的表達(dá)情況，對(duì)牛羊早孕診斷是切實(shí)可行的。
[0023]本發(fā)明的使用方法:牛羊孕情檢測(cè)。取母牛或母羊外周血液5mL作為待測(cè)樣本，經(jīng)過(guò)離心處理，獲得外周血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白樣品，使用樣品墊直接蘸取或加樣至樣品墊，5min后，觀察結(jié)果。[0024]結(jié)果判斷:利用雙抗夾心法制成的檢測(cè)試紙的檢測(cè)線和對(duì)照線顯示為彩帶，即顯色區(qū)為兩條線時(shí)為陽(yáng)性，即妊娠；只有一條對(duì)照線顯色時(shí)為陰性，即未妊娠。如果對(duì)照線也不顯色，即檢測(cè)試紙失效。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，使用本發(fā)明檢測(cè)牛羊早期妊娠，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果清晰、可通過(guò)肉眼判定結(jié)果、無(wú)需復(fù)雜操作技巧和特殊設(shè)備、靈敏度高、無(wú)污染且攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條，由含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊6、硝酸纖維素膜3、玻璃纖維膜樣品墊8和吸水墊4組成，含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊6、硝酸纖維素膜3、玻璃纖維膜樣品墊8和吸水墊4粘貼在PVC底板I上，玻璃纖維膜樣品墊8和含有金標(biāo)ISG15抗體的金標(biāo)墊6與硝酸纖維素膜3首尾相接，硝酸纖維素膜3與吸水墊4尾首相接；在硝酸纖維素膜3上有ISG15抗體檢測(cè)線2和羊抗鼠二抗對(duì)照線5，ISG15抗體檢測(cè)線2靠近含有金標(biāo)ISG15抗體的金標(biāo)墊一側(cè)。
[0028]羊抗鼠二抗對(duì)照線5距吸水墊近端0.3-0.6cm, ISG15抗體檢測(cè)線2與吸水墊近端相距 0.8-1.3cm。
[0029]3.按照權(quán)利要求1或2所述的用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條，其特征是，羊抗鼠二抗對(duì)照線5的羊抗鼠二抗的噴涂濃度為0.2-2mg/mL, ISG15抗體檢測(cè)線2的ISG15抗體的噴涂濃度為5-10 μ g/mL。
[0030]試紙條大小為6-8cmX 0.3-0.6cm,吸水墊 4 長(zhǎng) 1.8-2.2cm、樣品墊 8 長(zhǎng) 1.8-2.2cm、含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊6長(zhǎng)0.6-1.0cm、硝酸纖維素膜長(zhǎng)2_3cm ;硝酸纖維素膜3貼在底板上，硝酸纖維素膜3與底板吸水端邊緣相距1.3-1.8cm ;吸水墊4與硝酸纖維素膜3交疊貼于底板吸水端，樣品墊8、含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊6與硝酸纖維素膜3由上而下依次交疊，含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊6位于樣品墊8和硝酸纖維素膜3之間，含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊6與硝酸纖維素膜3的交疊長(zhǎng)度為
0.8-1.0mm。
[0031]用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條的制備方法，具體制備步驟如下:
第一步，制備膠體金:將0.01% HAuCl4水溶液IOOmL加熱至沸騰，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液ImL,加熱至透明紅色,制得膠體金顆粒大小40nm ；
第二步，制備純化ISG15單克隆抗體:重組牛ISG15免疫Balb/c小鼠；骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合；采用陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞制備腹水；ISG15單克隆抗體的提純；
第三步，制備金標(biāo)抗體:將抗體溶液去鹽，膠體金pH值在9-9.5之間時(shí)與抗體吸附，采用離心法純化；
第四步，膠體金試紙條的制備:將金標(biāo)抗體灌注在已處理好的硝酸纖維素膜上，干燥；在硝酸纖維膜上用點(diǎn)膜機(jī)將ISG15抗體和羊抗鼠二抗噴成2條線，分別為檢測(cè)線和對(duì)照線，再真空干燥；將樣品墊、金標(biāo)墊與硝酸纖維素膜首尾相接粘貼在底板上，吸水墊貼在硝酸纖維素膜的另一側(cè)，組裝制成檢測(cè)ISG15膠體金試紙條。
[0032]制備膠體金時(shí)，用微波爐加熱0.01 %的HAuCl4溶液IOOmL,加熱至沸騰，一次性加入1%的枸櫞酸三鈉水溶液lmL。
[0033]制備ISG15單克隆抗體時(shí)，采用重組牛ISG15免疫Balb/c小鼠，骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合方法獲得ISG15單克隆抗體,純化后抗體濃度為l-3mg/mL。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條，由含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊(6)、硝酸纖維素膜(3)、玻璃纖維膜樣品墊(8)和吸水墊(4)組成，其特征是，含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊(6 )、硝酸纖維素膜(3 )、玻璃纖維膜樣品墊(8 )和吸水墊(4)粘貼在PVC底板(I)上，玻璃纖維膜樣品墊(8)和含有金標(biāo)ISG15抗體的金標(biāo)墊(6)與硝酸纖維素膜(3)首尾相接，硝酸纖維素膜(3)與吸水墊(4)尾首相接；在硝酸纖維素膜(3)上有ISG15抗體檢測(cè)線(2)和羊抗鼠二抗對(duì)照線(5)，ISG15抗體檢測(cè)線(2)靠近含有金標(biāo)ISG15抗體的金標(biāo)墊一側(cè)。
2.按照權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條，其特征是，羊抗鼠二抗對(duì)照線(5)距吸水墊近端0.3-0.6cm, ISG15抗體檢測(cè)線(2)與吸水墊近端相距 0.8-1.3cm。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條，其特征是，羊抗鼠二抗對(duì)照線(5)的羊抗鼠二抗的噴涂濃度為0.2-2mg/mL，ISG15抗體檢測(cè)線(2)的ISG15抗體的噴涂濃度為5-10 μ g/mL。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條，其特征是，試紙條大小為6-8cmX0.3-0.6cm,吸水墊(4)長(zhǎng)1.8-2.2cm、樣品墊(8)長(zhǎng)1.8-2.2cm、含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊(6)長(zhǎng)0.6-1.0cm、硝酸纖維素膜長(zhǎng)(3)2-3cm;硝酸纖維素膜(3)貼在底板上，硝酸纖維素膜(3)與底板吸水端邊緣相距1.3-1.8cm;吸水墊(4)與硝酸纖維素膜(3)交疊貼于底板吸水端，樣品墊(8)、含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊(6)與硝酸纖維素膜(3)由上而下依次交疊，含有金標(biāo)ISG15抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊(6)位于樣品墊(8 )和硝酸纖維素膜(3)之間，含有金標(biāo)ISGl5抗體復(fù)合物的金標(biāo)墊(6)與硝酸纖維素膜(3)的交疊長(zhǎng)度為0.8-1.0mm。
5.用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條的制備方法，其具體制備步驟如下: 第一步，制備膠體金:將0.01% HAuCl4水溶液IOOmL加熱至沸騰，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液ImL,加熱至透明紅色,制得膠體金顆粒大小40nm ； 第二步，制備純化ISG15單克隆抗體:重組牛ISG15免疫Balb/c小鼠；骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合；采用陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞制備腹水；ISG15單克隆抗體的提純； 第三步，制備金標(biāo)抗體:將抗體溶液去鹽，膠體金pH值在9-9.5之間時(shí)與抗體吸附，采用離心法純化； 第四步，膠體金試紙條的制備:將金標(biāo)抗體灌注在已處理好的硝酸纖維素膜上，干燥；在硝酸纖維膜上用點(diǎn)膜機(jī)將ISG15抗體和羊抗鼠二抗噴成2條線，分別為檢測(cè)線和對(duì)照線，再真空干燥；將樣品墊、金標(biāo)墊與硝酸纖維素膜首尾相接粘貼在底板上，吸水墊貼在硝酸纖維素膜的另一側(cè)，組裝制成檢測(cè)ISG15膠體金試紙條。
6.按照權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條的制備方法，其特征是:制備膠體金時(shí)，用微波爐加熱0.01 %的HAuCl4溶液IOOmL,加熱至沸騰，一次性加入1%的枸櫞酸三鈉水溶液lmL。
7.按照權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)牛羊早期妊娠診斷的ISG15膠體金試紙條的制備方法，其特征是:制備ISG15單克隆抗體時(shí)，采用重組牛ISG15免疫Balb/c小鼠，骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合方法獲得ISG15單克隆抗體，純化后抗體濃度為l-3mg/mL。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103941009SQ201410147731
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】楊凌, 閆現(xiàn)喜, 段保寧, 張樂(lè)穎, 董瑞玲 申請(qǐng)人:河北工程大學(xué)