用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,先將生物樣品的總蛋白質(zhì)混合物全部酶切成較短的肽段混合物,使用肽段等電聚焦緩沖液復溶肽段混合物,再采用上樣杯上樣方式進行等電聚焦電泳,實現(xiàn)了復雜肽段混合物的有效分離。最后,將各個槽中預分離的多肽混合物取出脫鹽用于質(zhì)譜分析,便能獲得比傳統(tǒng)方法更多數(shù)量的多肽信號、更高的肽段覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。本發(fā)明方法精確、高效、費用低,可用于各種生物樣品總蛋白質(zhì)的多維液相色譜-質(zhì)譜鑒定技術(shù)體系,可以替代傳統(tǒng)的離子交換色譜預分離方法,實現(xiàn)了對肽段混合物的高效預分離,避免了肽段的丟失。據(jù)此,還可建立高覆蓋率的蛋白質(zhì)組表達譜信息。
【專利說明】用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學【技術(shù)領域】,尤其涉及一種用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和功能分子,是生命活動的執(zhí)行者和生命現(xiàn)象的體現(xiàn)者。蛋白質(zhì)組是指一種細胞或一種組織內(nèi)的基因在特定條件下表達的所有蛋白質(zhì),對于這些蛋白質(zhì)的分析和鑒定研究稱為蛋白質(zhì)組學。
[0003]目前,蛋白質(zhì)組學的研究方法主要有兩類,分別是雙向電泳(Two-dimensionalpolyacrylamide gel electrophoresis, 2DE)技術(shù)和多維液相色譜(Mult1-dimensionalliquid chromatography,MDLC)技術(shù)。雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)是目前廣泛應用的經(jīng)典蛋白質(zhì)研究途徑,先將復雜的蛋白質(zhì)混合物進行膠上分離,再將凝膠上的蛋白質(zhì)斑點切下,用胰蛋白酶進行膠內(nèi)酶切后,用質(zhì)譜儀測定肽質(zhì)量指紋圖譜,最后對這些肽數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)檢索而鑒定蛋白質(zhì)信息。至今因其能夠獨立地分離大量蛋白而廣泛用于蛋白質(zhì)組的定量和分離中,并能夠比較和測量出細胞中生理狀態(tài)、疾病狀態(tài)時的差異蛋白質(zhì)。然而,以2DE為基礎的蛋白組學研究方法仍有其技術(shù)上的局限性,主要表現(xiàn)在以下幾方面:
[0004](I)在雙向凝膠電泳圖譜上,并非每個蛋白點所包含的蛋白量都足以用于鑒定蛋白;
[0005](2)實驗的操作繁瑣,實驗結(jié)果的重現(xiàn)性較差;
[0006](3 )對于強酸性蛋白、強堿性蛋白、疏水性蛋白和低豐度蛋白,2D-PAGE尚不能將其很好地檢測出來
[0007](4) 2D-PAGE不能在線與質(zhì)譜連接以達到高效的蛋白分離和鑒定水平。
[0008]鑒于雙向凝膠電泳的一些不足,高效液相色譜技術(shù)作為其補充方法應運而生,特別是各種模式色譜聯(lián)用組成的多維色譜分離技術(shù)。此方法用胰蛋白酶把蛋白質(zhì)混合物樣品全部酶切成多肽,再利用多維分離技術(shù)將肽段細分成多個組分,送入電噴霧質(zhì)譜中實現(xiàn)鑒定蛋白質(zhì)的目的。這種技術(shù)具備高分辨率、高重現(xiàn)性及能夠與質(zhì)譜良好兼容等特點。
[0009]MDLC中目前較為廣泛應用的方法主要是二步正交:即第一維不固定,第二維采用反相液相色譜(RP-LC)直接耦聯(lián)質(zhì)譜(2D-LC-MS)。RP-LC因其高效的分離能力、無鹽以及便于后續(xù)處理而常作為多維分離體系中的最后一維。第一維預分離常用離子交換色譜(1n-Exchange Chromatography, IEC)、體積排阻色譜(Size Exclusion Chromatography,SEC)、親和色譜(Affinity Chromatography, AC)等模式。然而,多肽混合物在實施第一維分離時,采用這些模式,會隨著流動相的洗脫而導致部分多肽丟失,影響到低豐度蛋白質(zhì)的檢出。為了解決肽段丟失的問題,需要對第一維的預分離新方法進行探索。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便、高效的用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,可替代傳統(tǒng)的離子交換色譜預分離方法,實現(xiàn)了對肽段混合物的高效預分離,避免了肽段的丟失。
[0011]為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,先將生物樣品的總蛋白質(zhì)混合物全部酶切成較短的肽段混合物,使用肽段等電聚焦緩沖液復溶肽段混合物,再采用上樣杯上樣方式進行等電聚焦電泳。
[0012]上述用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,包括以下步驟:
[0013](I)取細胞總蛋白質(zhì)樣品100微克,使用40mM碳酸氫銨溶解,分別加入40mM 二硫蘇糖醇和IOOmM碘乙酰胺進行還原和烷基化處理后,按質(zhì)量比25:1加入4微克測序級胰蛋白酶(Trypsin),在37°C酶解12小時,將所有蛋白質(zhì)酶切成16-25個氨基酸長度的多肽,得到多肽混合物;
[0014](2)將步驟(I)所得多肽混合物在真空濃縮儀中抽干后,再加入200微升肽段等電聚焦緩沖液復溶;
[0015](3)將步驟(2)中復溶的多肽混合物用于等電聚焦電泳儀電泳,以干膠條和上樣杯組合方式上樣;
[0016](4)在等電聚焦電泳儀中進行多肽混合物電泳。
[0017]根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,其特征在于:步驟(2)中所述加肽段等電聚焦緩沖液是含有7M尿素的水溶液,并添加
0.5%pH3-10兩性電解質(zhì)緩沖液(IPG buffer)。
[0018]步驟(3)中所述上樣是以13cm pH3_10IPG膠條作為聚焦底座,用上樣杯壓蓋膠條形成獨立上樣口的杯上樣方式,膠條上不覆蓋石蠟油。
[0019]步驟(4)中電泳參數(shù)為①500v,3h ;@ 8000v,4h。
[0020]上述用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,還包括以下步驟:
[0021](5)步驟(4)的電泳程序完成后,將上樣杯內(nèi)12個槽中的液體分別取出,轉(zhuǎn)移至新離心管中;
[0022](6)步驟(5)中收集得到的12份預分離多肽溶液使用ZipTip C18脫鹽槍頭除鹽,真空濃縮儀抽干;
[0023](7)步驟(6)中抽干后的多肽使用easy-nLClOOO納升液相色譜分離,色譜柱為C18毛細管反相分離柱,再次分離后的肽段送入LTQ-Orbitrap質(zhì)譜中采集信號,進行蛋白質(zhì)鑒定
[0024]針對多維液相色譜預分離時肽段丟失的問題,發(fā)明人建立了一種用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,先通過溶液酶解方式將所有蛋白質(zhì)混合物酶解成肽段混合物,避免蛋白質(zhì)在后續(xù)處理過程中的降解,使用高效而簡化肽段等電聚焦緩沖液復溶肽段混合物,以實現(xiàn)肽段的全部溶解;再采用上樣杯上樣方式,并合理設置等電聚焦電泳參數(shù),實現(xiàn)多肽混合物根據(jù)其等電點不同在高壓電場作用下自由遷移至上樣杯的各個槽中,實現(xiàn)了復雜肽段混合物的有效分離。最后,將各個槽中預分離的多肽混合物取出脫鹽用于質(zhì)譜分析,便能獲得比傳統(tǒng)方法更多數(shù)量的多肽信號、更高的肽段覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。本發(fā)明方法精確、高效、費用低,可用于各種生物樣品總蛋白質(zhì)的多維液相色譜-質(zhì)譜鑒定技術(shù)體系,可以替代傳統(tǒng)的離子交換色譜預分離方法,實現(xiàn)了對肽段混合物的高效預分離,避免了肽段的丟失。據(jù)此,還可建立高覆蓋率的蛋白質(zhì)組表達譜信息?!緦@綀D】
【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明中上樣杯上樣方式和等電聚焦原理的示意圖,圖中:1上樣杯架,213cm干膠條(pH3-10),3上樣杯杯蓋,4高壓等電聚焦。
【具體實施方式】
[0026]實施例1
[0027]以下所用的試劑乙腈、水、甲酸都是色譜純,購自Sigma-Aldrich試劑公司;質(zhì)譜級胰蛋白酶購自Promega公司;干膠條和上樣杯購自Bio-Rad公司;質(zhì)譜儀是線性離子講一靜電場軌道講組合式質(zhì)譜儀(Thermo LTQ-Orbitrap Elite)。
[0028](I)水牛精子超聲波破碎后,加入裂解液(7M尿素、2%CHAPS、0.5%DTT和0.5%PMSF)消化提取總蛋白質(zhì),離心去除細胞碎片其他雜質(zhì),棄掉下層細胞碎片;
[0029](2)取上述提取的上清液500 μ L,加入1.5mL預冷丙酮沉淀過夜,12000rpm離心Ih,丟棄上清,將沉淀用100 μ L的40mM碳酸氫銨(NH4HCO3)復溶;
[0030](3)分別加入10yL40mM 二硫蘇糖醇(DTT)和10 μ LlOOmM碘乙酰胺(IAA)對蛋白質(zhì)進行還原和烷基化處理;
[0031](4)按1:25的比例,加入4 μ g質(zhì)譜級胰蛋白酶(Trypsin)至上述蛋白質(zhì)溶液中,37°C 酶切 12h ;
[0032](5)酶切后肽段真空抽干,使NH4HCO3完全揮發(fā);
[0033](6)在等電聚焦緩沖液(7M尿素、2%CHAPS、0.5%DTT)中按0.5%比例加入兩性電解質(zhì)(IPG Buffer pH3_10,購自 GE Healthcare 公司,貨號 17-6004-40),取 200 μ L 復溶肽段混合物;
[0034](7)使用13cm IPG膠條(pH3_10)作為聚焦底座,在膠條上蓋壓上樣杯,形成獨立的、隔離的上樣口(如圖l_a所示),膠條上不覆蓋石蠟油;
[0035](8)將步驟(6)所述的復溶肽段混合物均勻加入12個上樣口中,蓋上上樣杯蓋(如圖l_b所示),此時,肽段混合物均勻的分布于各個上樣口內(nèi);
[0036](9)執(zhí)行以下等電聚焦程序:①500v,3h ;@8000v,4h ;在高壓電場的作用下,多肽混合物會穿過底層的膠條,根據(jù)其等電點的不同,逐步遷移至其合適的上樣口內(nèi)(如圖1-c所示);
[0037](8)電泳結(jié)束后,多肽將在各個上樣口內(nèi)重新定位(如圖Ι-d所示),將各個上樣口中的液體轉(zhuǎn)移至新EP管中,用于脫鹽處理;
[0038](9)將步驟(8)所得溶液濃縮至20yL左右,用微量碳18反相色譜吸附柱(C18ZipTip, Millipore公司)脫鹽處理,去除多肽混合液的小分子無機鹽和其他雜質(zhì);
[0039](10)將步驟(9)得到的脫鹽后的12個樣品用真空濃縮儀抽干,用反相色譜的A相(2%乙腈+0.1%甲酸水溶液)復溶,用于液質(zhì)聯(lián)用分析(LC-MS);色譜柱:C18反相毛細管柱;流動相A:2%乙腈+0.1%甲酸水溶液;流動相B:98%乙腈+0.1%甲酸水溶液。
[0040](11)質(zhì)譜條件:電噴霧電壓1.5kV,采用一級模式、Orbitrap檢測全譜,掃描分辨率為60000 ;質(zhì)量掃描范圍是m/z=350-1800 ; 10個LTQ 二級質(zhì)譜用CID碰撞模式完成,二級掃描分辨率為60000 ;串聯(lián)質(zhì)譜CID碰撞能量是35%歸一化能量,數(shù)據(jù)依賴的自動化模式采集信號;采用Xcalibular軟件自動進樣。
[0041](12)所有的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過搜索引擎SEQUEST (Protein Discovery軟件)進行搜索,檢索數(shù)據(jù)庫為牛屬(Bovine)數(shù)據(jù)庫,為減少假陽性結(jié)果出現(xiàn),用以上數(shù)據(jù)庫的反庫驗證。數(shù)據(jù)庫搜索參數(shù)設置如下=Trypsin酶切;最大2個漏切位點;一級質(zhì)譜質(zhì)量范圍IOppm ;二級質(zhì)譜質(zhì)量偏差20mmu,可變修飾為:半胱氨酸碘乙酰胺化Carbamidomethyl(+57Da),甲硫氨酸氧化Oxsidation (+15.995Da)、人工確認匹配二級圖譜減少錯配率。最后鑒定得到蛋白質(zhì)數(shù)量為1148種(部分蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)如表I所示)。將該方法獲得的數(shù)據(jù)與常規(guī)方法(二維液相色譜分離結(jié)合質(zhì)譜分析方法)相比,常規(guī)方法在鑒定蛋白質(zhì)的數(shù)量為834種,平均肽段覆蓋率為36%,均低于本方法的鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量1148種和45%的平均肽段覆蓋率。
[0042]表I鑒定得到蛋白質(zhì)的部分信息
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,其特征在于:先將生物樣品的總蛋白質(zhì)混合物全部酶切成較短的肽段混合物,使用肽段等電聚焦緩沖液復溶肽段混合物,再采用上樣杯上樣方式進行等電聚焦電泳。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,其特征在于包括以下步驟: (1)取細胞總蛋白質(zhì)樣品100微克,使用40mM碳酸氫銨溶解,分別加入40mM二硫蘇糖醇和IOOmM碘乙酰胺進行還原和烷基化處理后,按質(zhì)量比25:1加入4微克測序級胰蛋白酶,在37°C酶解12小時,將所有蛋白質(zhì)酶切成16-25個氨基酸長度的多肽,得到多肽混合物; (2)將步驟(I)所得多肽混合物在真空濃縮儀中抽干后,再加入200微升肽段等電聚焦緩沖液復溶; (3)將步驟(2)中復溶的多肽混合物用于等電聚焦電泳儀電泳,以干膠條和上樣杯組合方式上樣; (4 )在等電聚焦電泳儀中進行多肽混合物電泳。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,其特征在于:步驟(2)中所述加肽段等電聚焦緩沖液是含有7M尿素的水溶液,并添加0.5%pH3-10兩性電解質(zhì)緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,其特征在于:步驟(3)中所述上樣是以13cm PH3-10IPG膠條作為聚焦底座,用上樣杯壓蓋膠條形成獨立上樣口的杯上樣方式,膠條上不覆蓋石蠟油。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,其特征在于:步驟(4)中電泳參數(shù)為①500v,3h ;@8000v,4h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學分析的多肽混合物等電聚焦分離方法,其特征在于還包括以下步驟: (5)步驟(4)的電泳程序完成后,將上樣杯內(nèi)12個槽中的液體分別取出,轉(zhuǎn)移至新離心管中; (6)步驟(5)中收集得到的12份預分離多肽溶液使用ZipTipC18脫鹽槍頭除鹽,真空濃縮儀抽干; (7)步驟(6)中抽干后的多肽使用easy-nLClOOO納升液相色譜分離,色譜柱為C18毛細管反相分離柱,再次分離后的肽段送入LTQ-Orbitrap質(zhì)譜中采集信號,進行蛋白質(zhì)鑒定。
【文檔編號】G01N27/62GK103926301SQ201410153861
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】付強, 岑衛(wèi)健, 朱平川 申請人:廣西大學