一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法
【專利摘要】一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。其特征在于包括以下步驟：1）稱取喜樹堿原藥、氫氧化鈉、水配制喜樹堿溶液；2）將喜樹堿溶液稀釋處理昆蟲，最后365-430nm波長下置于熒光顯微鏡下觀察喜樹堿的沉積部位，然后將該部位的大量細胞置于冰箱中冷凍，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理，使其釋出蛋白質(zhì)等細胞液，再將細胞液離心、過濾，保留上清液；3）將上清液通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈－水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，即可精準定位出喜樹堿與蟲體細胞相結(jié)合的靶蛋白。該喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，可快速、準確測定生物堿類在細胞中的沉積部位，精確度高，穩(wěn)定性好。
【專利說明】一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物是生物活性化合物的天然寶庫，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過40萬種，其中的大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)如萜烯類、生物堿、類黃酮、留體、酚類、獨特的氨基酸和多糖等均具有殺蟲活性。喜樹(Camptothecia acuminata Decaisne)別名:旱蓮木、水桐樹，是我國特有樹種，分布于浙江、福建、江西、四川、云南等省區(qū)，在四川西部成都平原和江西東南部均較常見，
屬山茱萸目珙桐科。其所含有抗腫瘤作用的生物堿-喜樹堿(CPT)分子式SC2OH16N2O4,
相對分子質(zhì)量348.34，具有抗癌、清熱殺蟲的功能。
[0003]喜樹堿沒有明顯的堿性，屬于中性生物堿，不溶于酸，與酸不易成鹽，所以不能用生物堿常規(guī)的提取方法分離。研究發(fā)現(xiàn)CPT能夠阻斷拓樸異構(gòu)酶I的合成，CPT阻斷這種酶的產(chǎn)生即可阻止癌細胞的生長，臨床研究表明，CPT對各種移植的動物腫瘤及移植于裸鼠身上的胃癌和大腸癌均有顯著療效。目前張立欽等研究發(fā)現(xiàn)CPT對蚜蟲、小綠葉蟬、水稻二化螟和稻飛虱等均具有較高的殺蟲活性。但是由于化合物的不同光學(xué)異構(gòu)體在生物活性和作用靶點上都有可能不同。早期的研究表明喜樹堿作為一種拓樸異構(gòu)酶I抑制劑，能夠阻斷這種酶的產(chǎn)生，同時抑制腫瘤細胞的正常運轉(zhuǎn)，而關(guān)于植物源農(nóng)藥其在害蟲體內(nèi)如何發(fā)揮殺蟲活性的作用機理卻未見相關(guān)報道。
[0004]張立欽等前期室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)喜樹堿可以干擾試蟲的正常生長發(fā)育，田間試驗過程中亦觀察到喜樹堿藥劑可使害蟲出現(xiàn)搖頭、麻痹、最終死亡的現(xiàn)象。本發(fā)明可以精準定位出喜樹堿作用的蟲體細胞靶蛋白，從而為研究生物農(nóng)藥對害蟲的致毒機理提供了可能，通過精準定位生物堿作用的具體部位，可為植物源藥劑毒理學(xué)研究和新藥的開發(fā)提供理論和技術(shù)支持。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法的技術(shù)方案，以植物體內(nèi)天然存在的物質(zhì)喜樹堿為研究對象，利用喜樹堿的熒光性，構(gòu)建測定喜樹堿與蟲體細胞蛋白結(jié)合部位的定位方法；其建立的技術(shù)可快速、準確測定生物堿類在細胞中的沉積部位，具有精確度高，穩(wěn)定性好等特點，解決了目前植物源農(nóng)藥活性成分作用機理研究中不能快速找到受體蛋白的問題，可為生物農(nóng)藥的機理研究提供一定參考，為植物源藥劑毒理學(xué)研究和新藥的開發(fā)提供理論和技術(shù)支持。
[0007]所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于包括以下步驟: I)按重量百分比稱取喜樹堿原藥0.1-1.5%，氫氧化鈉2-9%，水89-98%，反應(yīng)溫度控制在45-65°C下不斷攪拌至完全溶解，配制成喜樹堿溶液，備用；
2)將步驟I)中的喜樹堿溶液稀釋至900-1200倍，取1-5 μ L噴霧或飼喂處理昆蟲，每隔10-15h處理一次，共處理3-7天至蟲體出現(xiàn)慢性中毒癥狀直至瀕臨死亡為止，再用2-8 μ L濃度為1.2-1.5%的鹽酸溶液噴霧或浸潰昆蟲2-5min，使其充分浸潤，最后365_430nm波長下置于熒光顯微鏡下觀察，熒光區(qū)域即為喜樹堿的沉積部位，解剖分離喜樹堿沉積部位，然后將該部位的大量細胞迅速置于_70°C冰箱中冷凍30-50min，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理7-15min，使其充分釋出蛋白質(zhì)等細胞液，再將細胞液9000-12000rpm、2-9°C離心ll_19min,過濾棄沉淀,保留上清液,備用；
3)將處理后的上清液，通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈一水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫2-5次，即可精準定位出喜樹堿與蟲體細胞相結(jié)合的靶蛋白。
[0008]所述的喜樹堿原藥可以由四川鍶全天然產(chǎn)物有限公司購得。
[0009]所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于所述的喜樹堿原藥含量為0.3-1.2%，優(yōu)選0.5-1.0%，更優(yōu)選0.7-0.9%。
[0010]所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于所述氫氧化鈉的含量為4-8%，優(yōu)選5-6%。
[0011]所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于水含量為90-95%。
[0012]所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于步驟I)中:喜樹堿水劑配制溫度為50-60°C，優(yōu)選55-58°C。
[0013]所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于步驟2)中:喜樹堿溶液稀釋倍數(shù)為950-1150倍，優(yōu)選1000-1100倍；細胞冷凍時間為35_45h，優(yōu)選38-42h ;離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選10000-1 IOOOrpm,離心溫度優(yōu)選3_7°C,離心時間優(yōu)選12_17min,波長為 380-400nm。
[0014]所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法在生物堿與昆蟲蛋白作用關(guān)系分析及基于喜樹堿作用機理研究上的應(yīng)用。
[0015]上述一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，以植物體內(nèi)天然存在的物質(zhì)喜樹堿為研究對象，利用喜樹堿的熒光性，構(gòu)建測定喜樹堿與蟲體細胞蛋白結(jié)合部位的定位方法；其建立的技術(shù)可快速、準確測定生物堿類在細胞中的沉積部位，具有精確度高，穩(wěn)定性好等特點，解決了目前植物源農(nóng)藥活性成分作用機理研究中不能快速找到受體蛋白的問題，可為生物農(nóng)藥的機理研究提供一定參考，為植物源藥劑毒理學(xué)研究和新藥的開發(fā)提供理論和技術(shù)支持。具有操作方便，精確度高、快速高效等優(yōu)點。
[0016]本申請文件中涉及的百分含量除另有說明外，其它的均為純物質(zhì)的重量百分含量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為4個樣品的HPLC色譜圖；
其中峰序號:1_喜樹次堿、2-喜樹堿、3-10-羥基喜樹堿、4-甲氧基喜樹堿；
圖2-7分別為實施例1-6喜樹堿分子在蟲體細胞中的熒光表達。【具體實施方式】
[0018]以下結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進一步說明。
[0019]實施例1
在60°C下,將0.1g喜樹堿原藥,1.45g氫氧化鈉,48.45g水投入反應(yīng)爸中，不斷攪拌混合至完全溶解，配制成喜樹堿水劑。然后將喜樹堿溶液稀釋至1000倍，取2.5 μ L噴霧處理昆蟲，每隔14h處理一次，共處理3天至蟲體出現(xiàn)慢性中毒癥狀直至瀕臨死亡為止，再用7 μ L質(zhì)量分數(shù)為1.5%的鹽酸溶液浸潰昆蟲3.5min，使其充分浸潤，最后365nm波長下置于熒光顯微鏡下觀察，熒光區(qū)域即為喜樹堿的沉積部位，解剖分離喜樹堿沉積部位，然后將該部位的大量細胞迅速置于_70°C冰箱中冷凍38.5h，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理7min，使其充分釋出蛋白質(zhì)等細胞液，再將細胞液10700rpm、7°C離心16min，過濾棄沉淀，保留上清液，最后將處理后的上清液通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈一水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫2次，即可。
[0020]實施例2
在50°C下，將0.45g喜樹堿原藥，3.8g氫氧化鈉，45.75g水投入反應(yīng)釜中，不斷攪拌混合至完全溶解，配制成喜樹堿水劑。然后將喜樹堿溶液稀釋至1100倍，取4 μ L飼喂處理昆蟲，每隔13h處理一次，共處理7天至蟲體出現(xiàn)慢性中毒癥狀直至瀕臨死亡為止，再用5μ L質(zhì)量分數(shù)為1.5%的鹽酸溶液噴霧昆蟲2.5min,使其充分浸潤,最后430nm波長下置于突光顯微鏡下觀察，熒光區(qū)域即為喜樹堿的沉積部位，解剖分離喜樹堿沉積部位，然后將該部位的大量細胞迅速置于_70°C冰箱中冷凍41h，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理15min，使其充分釋出蛋白質(zhì)等細胞液，再將細胞液10400rpm、3°C離心15min，過濾棄沉淀，保留上清液，最后將處理后的上清液通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈一水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫5次，即可。
[0021]實施例3
在52°C下，將0.6g喜樹堿原藥，1.75g氫氧化鈉，47.65g水投入反應(yīng)釜中，不斷攪拌混合至完全溶解，配制成喜樹堿水劑。然后將喜樹堿溶液稀釋至1050倍，取3 μ L飼喂處理昆蟲，每隔12h處理一次，共處理4天至蟲體出現(xiàn)慢性中毒癥狀直至瀕臨死亡為止，再用4 μ L質(zhì)量分數(shù)為1.5%的鹽酸溶液噴霧昆蟲4min,使其充分浸潤，最后380nm波長下置于突光顯微鏡下觀察，熒光區(qū)域即為喜樹堿的沉積部位，解剖分離喜樹堿沉積部位，然后將該部位的大量細胞迅速置于_70°C冰箱中冷凍40h，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理8min，使其充分釋出蛋白質(zhì)等細胞液，再將細胞液10800rpm、4°C離心14min，過濾棄沉淀，保留上清液，最后將處理后的上清液通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈一水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫3次，即可。
[0022]實施例4
在55°C下，將0.73g喜樹堿原藥，2.1g氫氧化鈉，47.17g水投入反應(yīng)釜中，不斷攪拌混合至完全溶解，配制成喜樹堿水劑。然后將喜樹堿溶液稀釋至1020倍，取2 μ L噴霧處理昆蟲，每隔Ilh處理一次，共處理5天至蟲體出現(xiàn)慢性中毒癥狀直至瀕臨死亡為止，再用3μ L質(zhì)量分數(shù)為1.5%的鹽酸溶液浸潰昆蟲3min，使其充分浸潤，最后400nm波長下置于熒光顯微鏡下觀察，熒光區(qū)域即為喜樹堿的沉積部位，解剖分離喜樹堿沉積部位，然后將該部位的大量細胞迅速置于_70°C冰箱中冷凍39h，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理lOmin，使其充分釋出蛋白質(zhì)等細胞液，再將細胞液10500rpm、5°C離心13min，過濾棄沉淀，保留上清液，最后將處理后的上清液通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈一水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫4次，即可。
[0023]實施例5
在57°C下，將0.86g喜樹堿原藥，2.9g氫氧化鈉，46.24g水投入反應(yīng)釜中，不斷攪拌混合至完全溶解，配制成喜樹堿水劑。然后將喜樹堿溶液稀釋至1060倍，取5 μ L噴霧處理昆蟲，每隔15h處理一次，共處理6天至蟲體出現(xiàn)慢性中毒癥狀直至瀕臨死亡為止，再用2μ L質(zhì)量分數(shù)為1.5%的鹽酸溶液浸潰昆蟲5min，使其充分浸潤，最后370nm波長下置于熒光顯微鏡下觀察，熒光區(qū)域即為喜樹堿的沉積部位，解剖分離喜樹堿沉積部位，然后將該部位的大量細胞迅速置于_70°C冰箱中冷凍42h，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理llmin，使其充分釋出蛋白質(zhì)等細胞液，再將細胞液11000rpm、6°C離心17min，過濾棄沉淀，保留上清液，最后將處理后的上清液通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈一水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫2次，即可。
[0024]實施例6
在59°C下，將0.92g喜樹堿原藥，3.24g氫氧化鈉，45.84g水投入反應(yīng)釜中，不斷攪拌混合至完全溶解，配制成喜樹堿水劑。然后將喜樹堿溶液稀釋至1080倍，取I μ L飼喂處理昆蟲，每隔IOh處理一次，共處理4天至蟲體出現(xiàn)慢性中毒癥狀直至瀕臨死亡為止，再用8 μ L質(zhì)量分數(shù)為1.5%的鹽酸溶液噴霧昆蟲2min,使其充分浸潤，最后410nm波長下置于突光顯微鏡下觀察，熒光區(qū)域即為喜樹堿的沉積部位，解剖分離喜樹堿沉積部位，然后將該部位的大量細胞迅速置于_70°C冰箱中冷凍38h，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理13min，使其充分釋出蛋白質(zhì)等細胞液，再將細胞液10000rpm、4°C離心12min，過濾棄沉淀，保留上清液，最后將處理后的上清液通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈一水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫3次，即可。
[0025]以下通過試驗進一步說明本發(fā)明的有益效果。
[0026]喜樹堿檢測波長的選擇試驗一:
喜樹堿和喜樹堿衍生物類生物堿是喜樹中的主要有效成分，其中喜樹堿在紫外光譜中，在365-430nm附近有最大的熒光激發(fā)和發(fā)射峰；而喜樹堿衍生物類生物堿的紫外光譜顯示在259nm-389nm之間有其特征性的類似吸收。通過對喜樹堿樣品在236_430nm的最大吸收波長的分析，再對不同波長下檢測的色譜圖進行比較，發(fā)現(xiàn)375nm波長下檢測的色圖譜將能最大程度地反映出喜樹藥材中所含的主要有效成分的化學(xué)信息，見圖1 ;因此，最后選擇375nm作為指紋圖譜檢測波長。采用365_430nm中的其他波長也能達到本發(fā)明所述的技術(shù)效果。
[0027]試驗二:將實施例1-6樣品進行試驗，觀察樹堿分子在蟲體細胞中的熒光表達。結(jié)果顯示如圖2。圖2表明:實施例1-6中喜樹堿均可精準定位出藥劑結(jié)合位點。其中實施例2優(yōu)于實施例1，實施例3優(yōu)于實施例4,實施例6優(yōu)于實施例5。
【權(quán)利要求】
1.一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于包括以下步驟: I)按重量百分比稱取喜樹堿原藥0.1-1.5%，氫氧化鈉2-9%，水89-98%，反應(yīng)溫度控制在45-65°C下不斷攪拌至完全溶解，配制成喜樹堿溶液，備用； 2 )將步驟I)中的喜樹堿溶液稀釋至900-1200倍，取1-5 μ L噴霧或飼喂處理昆蟲，每隔10-15h處理一次，共處理3-7天至蟲體出現(xiàn)慢性中毒癥狀直至瀕臨死亡為止，再用2-8 μ L濃度為1.2-1.5%的鹽酸溶液噴霧或浸潰昆蟲2-5min，使其充分浸潤，最后365_430nm波長下置于熒光顯微鏡下觀察，熒光區(qū)域即為喜樹堿的沉積部位，解剖分離喜樹堿沉積部位，然后將該部位的大量細胞迅速置于_70°C冰箱中冷凍30-50min，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理7-15min，使其充分釋出蛋白質(zhì)等細胞液，再將細胞液9000-12000rpm、2-9°C離心ll_19min,過濾棄沉淀,保留上清液,備用； 3)將處理后的上清液，通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈一水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫2-5次，即可精準定位出喜樹堿與蟲體細胞相結(jié)合的靶蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于所述的喜樹堿原藥含量為0.3-1.2%，優(yōu)選0.5-1.0%，更優(yōu)選0.7-0.9%。
3.如權(quán)利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于所述氫氧化鈉的含量為4_8%，優(yōu)選5_6%。
4.如權(quán)利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于水含量為90-95%。
5.如權(quán)利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于步驟I)中:喜樹堿水劑配制溫度為50-60°C，優(yōu)選55-58°C。
6.如權(quán)利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于步驟2)中:喜樹堿溶液稀釋倍數(shù)為950-1150倍，優(yōu)選1000-1100倍；細胞冷凍時間為35-45h，優(yōu)選38-42h ;離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選10000-1 lOOOrpm，離心溫度優(yōu)選3_7°C，離心時間優(yōu)選12-17min，波長為 380_400nm。
【文檔編號】G01N21/64GK103940795SQ201410162213
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】張立欽, 童森淼, 陳安良, 胡加付, 馬建義, 王勇軍, 毛勝鳳, 劉洪波, 張紹勇 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)