用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，包括的步驟如下：(1)抗原的制備：將半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、癌抗原-125和人附睪蛋白4基因制得所需的抗原；(2)捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體；(3)檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體；(4)捕獲抗體包被；(5)封閉和加樣。本發(fā)明的有益效果如下：最全面的檢測卵巢癌，能夠更好的判斷絕經(jīng)前或絕經(jīng)后盆腔腫塊的良惡性，更好地對婦科良性卵巢腫塊和囊腫與卵巢癌進行鑒別診斷，具有靈敏度高準確性強的特點，其靈敏度及準確性均達到96％以上。
【專利說明】用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及癌癥診斷檢測用的試劑盒領域，具體為一種用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法。
【背景技術】:
[0002]卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，是指生長在卵巢上的惡性腫瘤，其中90%~95%為卵巢原發(fā)性的癌。就診時60%~70%已為晚期，而晚期病例又療效不佳。因此，雖然卵巢癌的發(fā)病率低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌居婦科惡性腫瘤的第三位，但死亡率卻超過宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌之和，高居婦科癌癥首位，是嚴重威脅婦女健康的最大疾
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[0003]由于卵 巢的胚胎發(fā)育、組織解剖及內(nèi)分泌功能較復雜，早期癥狀不典型，術前鑒別卵巢腫瘤的組織類型及良惡性相當困難，所以卵巢癌無論在診斷和治療上確是一大難題。到目前為止，就國內(nèi)外臨床資料統(tǒng)計，其五年生存率僅25%左右。但是如果發(fā)現(xiàn)得早，90%的病人都能活下來；卵巢癌5年內(nèi)的復發(fā)率可高達80%，且復發(fā)時間主要集中在治療期的3年內(nèi)。在女性的一生中，每五位女性就會有一位出現(xiàn)盆腔腫塊,需要接受檢查來排除惡性腫瘤的可能性。目前，卵巢癌的診斷主要依據(jù)兩種檢測手段。一種是經(jīng)陰道超聲檢查(TUV)。這種成像方法可用于檢查女性的生殖器官，包括子宮、卵巢、宮頸及陰道。盡管其應用較為普遍，但是這種方法并不能準確檢測出該腫塊是良性還是惡性。此外，該方法還需要經(jīng)驗豐富的臨床技師對檢測結(jié)果進行解讀。另一種常規(guī)檢測方法是檢測腫瘤標志物CA125，這種方法被視為卵巢癌診斷的“金標準”。但是，CA125的特異性及敏感度較低，容易出現(xiàn)假陰性或假陽性。大約50%的卵巢癌I期患者并沒有CA125水平升高的現(xiàn)象，也就是說有一半的卵巢癌患者可能被漏診。某些良性卵巢疾病也會導致CA125水平升高，造成假陽性。因此，在臨床診斷上亟需一種更好的診斷工具以盡早診斷卵巢癌。
[0004]腫瘤標志物(tumor markers,TM)是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身合成、釋放，或由機體對腫瘤細胞反應而產(chǎn)生的標志腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)。這些物質(zhì)在正常成人中不存在或者是在癌癥患者中出現(xiàn)的水平顯著高于正常人。目前腫瘤標志物檢測技術被認為是早期發(fā)現(xiàn)無癥狀微灶腫瘤的唯一途徑，這一檢測技術可先于X光片、超聲、CT、MRI或PET-CT等物理檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤?？捎糜诟呶Ｈ巳簮盒阅[瘤的篩查，腫瘤診斷與鑒別診斷，評估治療的效果，預測或監(jiān)視腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移。目前，醫(yī)院出現(xiàn)的卵巢癌診斷試劑盒是檢測常見的腫瘤標記物，靈敏性及準確性都偏低，即使聯(lián)檢也只70%左右，難以滿足早期快速診斷的要求。
[0005]由于市場上還沒有針對卵巢癌的快速高效診斷試劑盒問世，嚴重影響到卵巢癌早期發(fā)現(xiàn)及治療，卵巢癌患者確診時往往已處于癌癥晚期，錯過了最佳治療時機，大大降低了患者的生存率。如果卵巢癌能被早期診斷，可以極大地提高患者的生存率。

【發(fā)明內(nèi)容】
:[0006]本發(fā)明的目的是針對以上述卵巢癌診斷存在的不足，提供一種靈敏度高，準確性強的用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法。
[0007]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術方案是:用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)和癌抗原-125(CA-125)分別制得的單克隆抗體。
[0008]所述捕獲抗體還包括人附睪蛋白4(HE4)制得的單克隆抗體。
[0009]所述試劑盒還包括檢測抗體，所述檢測抗體包括半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)分別制得的多克隆抗體。
[0010]所述捕獲抗體為將半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應單克隆抗體。
[0011]所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0012](I)抗原的制備:把半乳糖凝集素_3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0013](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。
[0014]所述檢測抗體為將半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應多克隆抗體。
[0015]所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0016](I)抗原的制備:把半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0017](2)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體。
[0018]所述捕獲抗體預先包被于微量滴定板的孔內(nèi)，可以簡化步驟，提高檢測效率。
[0019]用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟:
[0020](I)抗原的制備:將半乳糖凝集素_3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0021](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0022](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0023](4)捕獲抗體包被:
[0024]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ IPBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中備用。
[0025](5)封閉和加樣:每孔添加200 μ I封閉緩沖液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。
[0026]本發(fā)明方法可以提高用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的敏度高準確性強的特點，其靈敏度及準確性均達到96%以上。
[0027]用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:
[0028](I)抗原的制備:將半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原；
[0029](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0030](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0031](4)捕獲抗體包被:
[0032]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0033]②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜；
[0034]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中備用。
[0035](5)封閉
[0036]①.在微量滴定板的每個孔添加200 μ I封閉緩沖液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；
[0037]②.封蓋微量滴定板并在37°C下孵育至少I小時，優(yōu)選的，孵育過夜；
[0038](6)加樣
[0039]①.將100 μ I的樣品添加到每個孔，在37°C下孵育60分鐘；要得到準確的定量結(jié)果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品(兩重測定或三重測定)和空白樣，以確保準確性；
[0040]②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)；
[0041]③.將100 μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測抗體添加到微量滴定板的每個孔；
[0042]④.封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時；
[0043]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0044]⑥.添加100 μ I標記二抗；
[0045]⑦.封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時。
[0046]⑧.用PBST洗滌微量滴定板四次。
[0047](7)檢測[0048]①.將TMB (3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液，然后在450nm處讀取光密度。
[0049]②.由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標準曲線，濃度標在X軸(對數(shù)標度)上，而吸光度標在Y軸(線性標度)上。通過內(nèi)插法在此標準曲線上得出樣品濃度。
[0050]本發(fā)明從眾多的腫瘤標記物中，篩選出4個腫瘤標記物一半乳糖凝集素-3(Galectin-3)，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)，人附睪蛋白4 (HE4)及癌抗原-125 (CA-125)組成卵巢癌快速診斷試劑盒。其中，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)又被稱為前白蛋白(PA)，是一種由肝臟、脈絡叢和眼產(chǎn)生的蛋白，它與轉(zhuǎn)運甲狀腺素和維生系A代謝有關。在肝臟受到損傷的病人的血清中TTR的含量明顯降低。肝癌中TTR基因轉(zhuǎn)錄受阻，并在基因結(jié)構(gòu)上存在缺陷。而且TTR對腫癌細胞的生長有明顯的抑制作用，因此TTR基因是一種抑癌基因。由于血漿中提取TTR產(chǎn)量低、步驟繁瑣，所以我們用基因工程分子克隆的方法可大量生產(chǎn)TTR研發(fā)本試劑盒。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是一種半乳糖結(jié)合蛋白，是Galectin家族中唯一具有嵌合結(jié)構(gòu)的成員。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)廣泛分布于腫瘤組織中，半乳凝素-3的表達同其腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關。Galectin-3可與細胞表面糖基化的⑶98結(jié)合促使整合素在細胞表面聚集成簇，間接增強整合素與其配體的親和力；也能直接結(jié)合整合素α I β I和⑶I lb/18，正性或負性調(diào)節(jié)整合素的活性，影響整合素與細胞外配體的結(jié)合。Galectin-3還可以增加整合素在細胞表面的表達，并促進膠原在細胞間隔的分泌。由于半乳糖凝集素-3對多聚糖有親和力，它也可以直接結(jié)合糖基化的細胞外基質(zhì)成分，介導細胞與基質(zhì)的黏附。我們的研究顯示卵巢癌患者血清中Galectin-3水平明顯超過健康人群。人附睪蛋白4(HE4)是一種新的腫瘤標志物。正常生理情況下，HE4在呼吸道、生殖系統(tǒng)和卵巢組織中有非常低水平的表達，但在很多卵巢癌組織和患者血清中高度表達。癌抗原-125 (CA-125或糖鏈抗原-125)，也被稱為粘蛋白_16，是被MUC16基因所編碼的蛋白質(zhì)，是從上皮性卵巢癌抗原檢測出可被單克隆抗體0C125結(jié)合的一種糖蛋白。CA-125對卵巢癌的早期檢測的潛在作用是有爭議的，尚未廣泛用于在無癥狀婦女篩選。使用CA-125這一生物標志物的主要問題是它缺乏敏感性，特別是在檢測卵巢癌時其缺乏特異性，尤其是在絕經(jīng)前婦女的早期階段。這些限制意味著，CA-125測試卵巢癌往往給人誤報，讓病人焦慮，從而做進一步不必要的篩選(有時包括手術)。此外，這些限制意味著，許多早期卵巢癌的婦女將收到來自CA-125檢測假陰性，并沒有得到自己的病情進一步治療。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的可用于臨床的卵巢癌血清標志物包括CA125和HE4，兩者的聯(lián)合使用對卵巢癌的總體敏感性和特異性分別為76%和95%，但用于卵巢癌的早期診斷缺乏足夠的敏感性和特異性。
[0051]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下:最全面的檢測卵巢癌，能夠更好的判斷絕經(jīng)前或絕經(jīng)后盆腔腫塊的良惡性，更好地對婦科良性卵巢腫塊和囊腫與卵巢癌進行鑒別診斷，具有靈敏度高準確性強的特點，其靈敏度及準確性均達到96%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1是本發(fā)明用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的原理圖；
[0053]圖2是本發(fā)明用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒在卵巢癌治療前后血中檢測到Galectin-3的變化對比圖；[0054]圖3是本發(fā)明用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒在卵巢癌治療前后血中檢測到TTR的變化對比圖；
[0055]圖4是本發(fā)明用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒在卵巢癌治療前后血中檢測到HE4的變化對比圖；
[0056]圖5是本發(fā)明用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒在卵巢癌治療前后血中檢測到CA125的變化對比圖。
【具體實施方式】
[0057]以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒進行詳細的描述說明。
[0058]用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，捕獲抗體封閉緩沖液，標準品，標記抗體，洗漆液及顯色液等。所述標記抗體選用HRP標記二抗。所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)和癌抗原-125(CA-125)分別制得的單克隆抗體；通過對半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)和癌抗原-125(CA-125)的共同快速檢測，可以有效的提高檢測準確率和靈敏度，有效的克服單憑檢測癌抗原_125(CA-125)導致的不足。
[0059]所述捕獲抗體還包括和人附睪蛋白4(HE4)制得的單克隆抗體，通過檢測半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4 (HE4)，使其靈敏度及準確性均達到96%以上，這個是現(xiàn)有試劑盒不可比擬的，可以快速準確的診斷卵巢癌，極大地提高患者的生存率。
[0060]所述捕獲抗體為將半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應單克隆抗體。
[0061]所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0062](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法把半乳糖凝集素_3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；所述抗原的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅。
[0063](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。所述哺乳動物是小鼠及兔子，優(yōu)選小鼠。所述捕獲抗體的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅。
[0064]所述檢測抗體包括半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)分別制得的多克隆抗體。
[0065]所述檢測抗體為將半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應多克隆抗體。所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0066](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法把半乳糖凝集素_3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0067](2)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體。所述哺乳動物是小鼠及兔子，優(yōu)選兔子。
[0068]其中，所述捕獲抗體可以預先包被于PVC材質(zhì)的微量滴定板的孔內(nèi)，可以簡化步驟，提高檢測效率。
[0069]用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟:
[0070](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法將半乳糖凝集素_3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0071](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0072](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0073](4)捕獲抗體包被:
[0074]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被于微量滴定板的孔內(nèi)；
[0075]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜；
[0076]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中備用；所述洗滌液為PBS(磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的TWeen20，所述Tween20的質(zhì)量百分比濃度為0.05% ;
[0077](5)封閉
[0078]①.在微量滴定板的每孔添加200 μ I封閉緩沖液(為含1.2% BSA (牛血清白蛋白)的PBS(磷酸鹽緩沖液))，用于封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；
[0079]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37°C下孵育至少I小時，優(yōu)選的，孵育過夜。
[0080]用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:
[0081](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法將半乳糖凝集素_3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0082](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0083](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0084](4)捕獲抗體包被:
[0085]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0086]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜；[0087]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液，可以是含0.05%吐溫-20的pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中備用；所述洗滌液為PBS (磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的TWeen20，所述TWeen20的質(zhì)量百分比濃度為0.05% ;
[0088](5)封閉
[0089]①.在微量滴定板的每個孔添加200 μ I封閉緩沖液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；
[0090]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37°C下孵育至少I小時，優(yōu)選的，在4°C下孵育過夜；
[0091](6)加樣
[0092]①.將100 μ I適當稀釋(稀釋20倍)的樣品添加到每個孔，在37°C下孵育60分鐘；要得到準確的定量結(jié)果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品(兩重測定或三重測定)和空白樣，以確保準確性；
[0093]②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)；
[0094]③.將100 μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測抗體添加到微量滴定板的每個孔；
[0095]④.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時；
[0096]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0097]⑥.添加100 μ I標記二抗，其在使用前便已在PBS中稀釋10000倍(1:10000)。所述標記二抗可以為HRP標記羊抗兔。
[0098]⑦.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37°C下孵育I小時。
[0099]⑧.用PBST洗滌微量滴定板四次。
[0100](7)檢測
[0101]①.將TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)溶液添加到每個孔，孵育15_30分鐘，添加等體積的終止液(2M H2SO4),然后在450nm處讀取光密度。
[0102]②.由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標準曲線，濃度標在X軸(對數(shù)標度)上，而吸光度標在Y軸(線性標度)上。通過內(nèi)插法在此標準曲線上得出樣品濃度。
[0103]本發(fā)明用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒包括半乳糖凝集素_3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)四項指標中兩項同時升高作為診斷早中期卵巢癌的標準，檢測原理如圖1所示；半乳糖凝集素_3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)四項指標中兩項同時下降作為卵巢癌治療效果評估的標準?？梢杂糜谂R床上通過檢測血中3個腫瘤標記物水平的高低對卵巢癌的治療效果進行動態(tài)評估。另外還可以用于臨床上對卵巢癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移及預后判斷的應用；也可用于肺癌早中期快速診斷。
[0104]近幾年本發(fā)明人一直從事半乳糖凝集素及其抑制劑與腫瘤相關的研究，取得了許多具有世界先進水平科研成果。半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)正在成為新的研究熱點，世界很多實驗室都開始著手這方面的研究。很顯然，本發(fā)明人在這個領域的研究走在世界的前列。同時，發(fā)明人還對TTR與卵巢癌的相關性進行了研究，我們的研究表明Galectin-3對卵巢癌的敏感性和特異性分別為78.2%和82.6% ;TTR對卵巢癌的敏感性和特異性分別為65.5%和85.2%，見下表:
[0105]
【權利要求】
1.用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于.包括的步驟如下: (1)抗原的制備:將半乳糖凝集素-3、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、癌抗原-125和人附睪蛋白4基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原； (2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體； (3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體； (4)捕獲抗體包被: ①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；②.封蓋微量滴定板并在4°C下孵育過夜；③.棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST,除去洗滌液，除去剩余的液滴，晾干放于4°C環(huán)境中備用； (5)封閉和加樣:每孔添加200μ I封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于:所述捕獲抗體預先包被于微量滴定板的孔內(nèi)。
【文檔編號】G01N33/574GK103969437SQ201410164258
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權日:2014年4月22日
【發(fā)明者】余躍飛, 羅喜平, 王曉娟 申請人:廣州恒泰生物科技有限公司