基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器，由捕獲抗體、檢測抗體、鏈霉親和素、生物素化的引物和發(fā)卡探針組成；其中，捕獲抗體為anti-TNF-α；檢測抗體為Bio-anti-TNF-α；生物素化的引物(Bio-I)的堿基序列為5’-AGT?CTA?GGA?TTC?GGC?GTG?GGT?TAA?TTT?TTT?TTT-biotin-3’；發(fā)卡探針由發(fā)卡探針H1和發(fā)卡探針H2組成，其中發(fā)卡探針H1的堿基序列為5’-TTA?ACC?CAC?GCC?GAA?TCC?TAG?ACT?CAA?AGT?AGT?CTA?GGA?TTC?GGC?GTG-3’；發(fā)卡探針H2的堿基序列為5’-AGT?CTA?GGA?TTC?GGC?GTG?GGT?TAA?CAC?GCC?GAA?TCC?TAG?ACT?ACT?TTG-3’。本發(fā)明還公開了該免疫傳感器的制備方法和在TNF-α檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的免疫傳感器具有檢測靈敏度高，樣品使用量小，無需酶放大等優(yōu)勢，可實現(xiàn)對低濃度TNF-α的定量檢測。
【專利說明】基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]單分子檢測(SMD)是以單個分子的分析為基礎(chǔ)構(gòu)建的一種方法，到目前為止，它已經(jīng)在生命科學(xué)的研究中備受關(guān)注。該方法被廣泛應(yīng)用于細胞成像、蛋白質(zhì)相互作用的研究以及DNA和蛋白質(zhì)的定量檢測中。在上述提及的應(yīng)用中，定量檢測是以對目標物分子的一個接一個的計數(shù)來實現(xiàn)的，這種定量檢測手段代表了檢測的最終極限。傳統(tǒng)的平均測定方法是以信號強度和目標物濃度之間的關(guān)系來定量的。信號強度越高，被測定目標物的濃度越高。與平均測定方法所不同的是，在SMD定量方法中，信號強度不再那么重要，每個可以產(chǎn)生信號的分子都可以被計數(shù)，更具有可視性和數(shù)字性，保證了較高的重現(xiàn)性。由于SMD定量檢測方法具有平均測定所無法比擬的優(yōu)點，目前，已經(jīng)有工作將SMD應(yīng)用到定量分析之中。
[0003]為了實現(xiàn)SMD定量檢測，單一分子的信號強度必須足夠強以至于可以被檢測至|J。目前常見的SMD定量檢測方法之一就是，使用熒光標記物，如有機熒光染料和量子點(QDs)。Tan等課題組成功地利用染料標記分子信標來監(jiān)測分子之間的反應(yīng)動力學(xué)。但是，目前常用的熒光染料主要存在兩方面的問題，一個是，相對低的熒光強度，另一個就是光不穩(wěn)定性。為了解決上述問題，QDs作為一種全新的納米標簽已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于單分子檢測之中。Jin課題組利用功能化的單個QDs實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的定量檢測。實驗結(jié)果表明，QDs與傳統(tǒng)的熒光染料相比，表現(xiàn)出出色的光穩(wěn)定性和靈敏度。盡管QDs具有高的量子產(chǎn)率和出色的光穩(wěn)定性的特性，然而，QDs自身的重金屬毒性限制了其在蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用。為了克服上述問題，出現(xiàn)的另外一種保證單個分子信號強度的方法就是，利用寡核苷酸序列作為標記物。Echopf課題組設(shè)計了一種微球為基礎(chǔ)的DNA檢測策略，在該方法中，通過RCA引入大量的熒光探針，實現(xiàn)了對單個目標物分子的定量。然而，RCA為基礎(chǔ)構(gòu)建的放大技術(shù)需要蛋白酶的輔助。蛋白酶不僅對反應(yīng)條件要求苛刻，而且增加了復(fù)雜性和成本，這些都限制了以蛋白酶輔助為基礎(chǔ)的方法在實際檢測中的應(yīng)用。因此，迫切需要發(fā)展一種全新的、無酶的方法來構(gòu)建SMD定量檢測平臺。
[0004]腫瘤壞死因子-α (TNF-α)是一種重要的縮氨酸細胞因子，同時，也是癌癥的生物標記物。TNF-a作為一種內(nèi)源性的介質(zhì)或是輔助因子，可以誘導(dǎo)某些腫瘤的出血性壞死。而且，許多的生理學(xué)和病理學(xué)過程都伴隨TNF- a濃度的變化，例如HIV感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、內(nèi)毒素休克和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，因此，TNF-a的靈敏檢測具有重要的實際意義。目前TNF-a的檢測多采用酶聯(lián)免疫吸附測定，但該方法存在重復(fù)性不好，靈敏度不高，檢測限偏高等問題，并且易出現(xiàn)假陽性，影響檢測的真實性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器，將該免疫傳感器用于TNF-α的檢測，具有靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，并且具有高的選擇性和低的基質(zhì)效應(yīng)。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供該免疫傳感器在TNF-a檢測中的應(yīng)用。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器，由捕獲抗體、檢測抗體、鏈霉親和素、生物素化的引物和發(fā)卡探針組成；
[0009]所述捕獲抗體為腫瘤壞死因子-a捕獲抗體(ant1-TNF-a)；
[0010]所述檢測抗體為生物素化的單克隆兔抗人腫瘤壞死因子-a (Bio-ant1-TNF-α)；
[0011]所述生物素化的引物(Bio-1)的堿基序列為5，-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGTTAA TTT TTT TTT-biotin-3’，如 SEQ ID N0.1 所示；
[0012]所述發(fā)卡探針由發(fā)卡探針Hl和發(fā)卡探針H2組成，其中發(fā)卡探針Hl的堿基序列為5，-TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3，JnSEQ IDN0.2所示；
[0013]發(fā)卡探針H2 的堿基序列為 5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAATCC TAG ACT ACT TTG-3’，如 SEQ ID N0.3 所示。
[0014]一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0015](I)夾心免疫反應(yīng)過程的構(gòu)建:將腫瘤壞死因子-α捕獲抗體(ant1-TNF-α)滴到硅烷化處理的玻璃基底上，在37°C的保濕條件下孵育8-14h ;加入封閉劑，在保濕條件下反應(yīng)3-8h，封閉暴露的位點，以減少非特異性吸附；再加入可識別抗原的不同位點的檢測抗體(Bio-ant1-TNF-a )，在37°C孵育l_3h ;在每一步反應(yīng)之后，均用PBS-T和純水沖洗三次，，除去未結(jié)合的試劑；
[0016](2)基于雜交鏈反應(yīng)的免疫傳感器的構(gòu)建:免疫雜交反應(yīng)之后，向玻璃基底上加入鏈霉親和素(SA)，孵育l-3h ;PBS-T和純水沖洗三次之后，加入生物素化的引物(Bio-1)，孵育l-3h ;對玻璃基底進行清洗之后，加入發(fā)卡探針H1、H2的混合物，孵育2-6h ;玻璃基底再次用PBS-T和純水沖洗三次，除去未反應(yīng)的發(fā)卡探針，即得；
[0017]步驟(I)中，ant1-TNF-a的濃度為10_30pM，封閉劑的濃度為20_60mM，Bio-ant1-TNF-α 的濃度為 20_40pM ；
[0018]所述封閉劑為乙醇胺或牛血清蛋白，優(yōu)選的為乙醇胺；
[0019]玻璃基底的硅烷化處理包括以下步驟:
[0020]a:清洗，將玻璃基底在質(zhì)量濃度為5%?8%的鉻酸溶液中浸泡8_16h，用大量清水沖洗，再用純水沖洗；之后，將玻璃基底依次在丙酮、乙醇和純水中超聲清洗，每次IOmin,每種溶液清洗兩次，每次清洗后更換新的溶液；之后，將清洗干凈的玻璃基底加入鹽酸、純水、雙氧水體積比為1:1:1的混合溶液中超聲30min ;再用純水超聲清洗兩次,每次IOmin ;最后，將活化好的蓋玻片放入120°C的恒溫干燥箱中，以除去上面殘留的水分；
[0021 ] b:硅烷化，將步驟a處理好的玻璃基底放入體積分數(shù)為6 %的GOPS-無水甲苯溶液中進行硅烷化處理，該反應(yīng)在95°C下反應(yīng)6h;反應(yīng)結(jié)束后，將玻璃基底取出，依次在甲苯、乙醇和純水中超聲清洗15min ;經(jīng)氮氣流吹干后，制備好的硅烷化的蓋玻片貯存在干燥器中備用；[0022]步驟⑵中，鏈霉親和素的濃度為10_80pM，Bio-1的濃度為0.1-0.5nM，發(fā)卡探針H1、H2的混合物中，Hl和H2濃度相同，均為5_15nM ；
[0023]步驟⑵中，所述Bio-1 的堿基序列為 5’ -AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAATTT TTT TTT-biotin-3’ ；
[0024]發(fā)卡探針Hl 的堿基序列為 5’-TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGTCTA GGA TTC GGC GTG-3’ ；
[0025]發(fā)卡探針H2 的堿基序列為 5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAATCC TAG ACT ACT TTG-3，；
[0026]優(yōu)選的，發(fā)卡探針Hl和H2在使用之前經(jīng)過退火步驟，目的是保證發(fā)卡的穩(wěn)定性，退火過程是在90°C加熱5min，然后緩慢冷卻到室溫。
[0027]步驟(I)、(2)中，ant1-TNF-α、封閉劑、Bio-ant1-TNF-α、鏈霉親和素、Bio-Ι、發(fā)卡探針H1、H2的混合物加入量的體積比為(I?2): (I?2): (I?2): (I?2): (I?2)。
[0028]該免疫傳感器在TNF-α檢測中的應(yīng)用。其應(yīng)用方法為:
[0029](I)將捕獲抗體ant1-TNF- α滴到硅烷化處理的玻璃基底上，在37°C的保濕條件下孵育8-14h ;加入封閉劑，在保濕條件下反應(yīng)3-8h，封閉暴露的位點，以減少非特異性吸附；，加入待檢測的TNF- α，孵育l-3h，形成了抗體-抗原復(fù)合物；再加入可識別抗原的不同位點的檢測抗體(Bio-ant1-TNF-α )，在37°C孵育l_3h ;而形成“三明治”型的免疫復(fù)合物；
[0030](2)免疫雜交反應(yīng)之后，向玻璃基底上加入鏈霉親和素(SA)，孵育l_3h ；PBS-T和純水沖洗三次之后，加入Bio-1，孵育l-3h ;對玻璃基底進行清洗之后，加入發(fā)卡探針Hl、H2的混合物，孵育2-6h ;玻璃基底再次用PBS-T和純水沖洗三次，除去未反應(yīng)的發(fā)卡探針；
[0031](3)熒光成像檢測:加入SYBR Green I，室溫下孵育IOmin ;吸去過量未反應(yīng)的SYBRGreen I，用PBS-T和純水沖洗三次后，加入相同體積的PBS緩沖溶液，進行熒光成像實驗，對獲得的熒光圖片進行處理，并進行數(shù)據(jù)分析；
[0032]步驟(I)、(2)、(3)中，ant1-TNF-α、封閉劑、待檢測的TNF-a ,Bio-ant1-TNF-a、鏈霉親和素、Bio-1、發(fā)卡探針H1、H2的混合物、SYBR Green I加入量的體積比為(I?2):(I ?2): (I ?2):(I ?2):(I ?2): (I ?2):(I ?2)；
[0033]步驟(3)中，SYBRGreen I 的濃度為 5-15 μ M ；
[0034]步驟(3)中，熒光成像檢測的實驗設(shè)置為:選擇60Χ物鏡，設(shè)置曝光時間為100ms，增益值為2000，將實驗后所得的蓋玻片固定到載物臺上；開啟汞燈，調(diào)整激發(fā)波長濾光片，選擇470?490nm之間的激發(fā)通道，使熒光染料分子SYBR Green I受到激發(fā)而發(fā)出熒光；調(diào)整焦距，獲得熒光圖片，用MetaMorph軟件對獲得的熒光圖片進行處理，并進行數(shù)據(jù)分析。
[0035]雜交鏈反應(yīng)(HCR)是利用一組互補的、動力學(xué)受限的發(fā)卡探針來實現(xiàn)雜交的鏈反應(yīng)，整個反應(yīng)是由堿基對形成是產(chǎn)生的自由能來驅(qū)動的。HCR反應(yīng)是在等溫、無酶的條件下進行的。與其它以酶為基礎(chǔ)構(gòu)建的放大方法相比，HCR更穩(wěn)定，更價廉。因此，我們以HCR信號放大技術(shù)和SYBR Green I內(nèi)插染料為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一種全新的、靈敏的SMD定量檢測方法。
[0036]免疫復(fù)合物的形成會催化發(fā)卡探針Hl和H2的自組裝，形成一條長的雙螺旋聚合物，SYBRGreen I是本設(shè)計中使用到的熒光信號標記分子，這種分子的特性是，在溶液中或是遇到單鏈DNA時幾乎不發(fā)熒光，而當插入到雙鏈DNA的股溝中之后，會產(chǎn)生明顯增強的熒光信號。在倒置落射顯微鏡的輔助之下，每一個亮點都對應(yīng)于一個單一的目標物分子，亮點可以被準確地計數(shù)而實現(xiàn)對TNF- α的定量。
[0037]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下有益效果:
[0038](1)本發(fā)明的免疫傳感器具有檢測靈敏度高，樣品使用量小，無需酶放大等優(yōu)勢，可實現(xiàn)對低濃度TNF- α的定量檢測。
[0039](2)通過加入封閉劑可以減少具有環(huán)氧基基團的物質(zhì)在硅烷化玻璃基底上的結(jié)合，降低了生物分子的非特異性吸附對背景的干擾，減少了假陽性信號的產(chǎn)生，提高了實驗的靈敏度。
[0040](3)本發(fā)明的免疫傳感器用于TNF-α定量檢測的檢測方法具有較好的重現(xiàn)性和精密度，對TNF- α具有良好的選擇性，可實現(xiàn)在復(fù)雜基質(zhì)中對TNF- α的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為HCR-單分子計數(shù)實驗原理圖；
[0042]圖2為亮點數(shù)與TNF- α濃度之間的線性關(guān)系(N = 3);
[0043]圖3為免疫傳感器對TNF-a的選擇性考察結(jié)果圖，其中1:BSA ；2:凝血酶；3 --人IgG ；4:PDGF ；5:TNF- a ；6:混合樣本(TNF- a，IpM ;BSA、凝血酶、人 IgG 和 PDGF，IOpM)；
[0044]圖4為基質(zhì)干擾試驗結(jié)果，其中I為正常血清；2為Na+，146mM ；3為Cl—，180 μ M ；4為 GLU, 6.1lmM ;5 為 UA, 420 μ M ;6 為 DA, 0.8ηΜ ；
[0045]圖5a為驗證性實驗陰性組結(jié)果；
[0046]圖5b為驗證性實驗陽性組結(jié)果；
[0047]圖5c為驗證性實驗對照組結(jié)果。
【具體實施方式】
[0048]結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。
[0049]實驗中所使用的儀器及試劑為:(I)儀器:K30型干式恒溫器(奧盛，杭州)；DHG-907A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器(精宏，上海)；雷磁PHS-3C型酸度計(中國)；Branson-200型超聲清洗機(中美合資必能信超有限公司，上海)；H_101型渦旋混合器(上?？岛坦怆妰x器有限公司，上海)。落射熒光顯微鏡系統(tǒng)(Olympus OpticalC0.Ltd，Tokyo，Japan)，主要包括倒置熒光顯微鏡(Olympus 1X81)，電子增強型光電耦合器(EMCCD) (Cascade, 512B, America),倒置突光顯微鏡控制單兀(Olympus IX2-UCB),鹵素?zé)?Olympus LG_PSs2);精密光學(xué)隔振平臺(上海億奧信息光學(xué)科技有限公司，上海)；精密凈化交流穩(wěn)壓電源(中川電氣科技有限公司，上海)；(2)試劑:人腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、多克隆鼠抗人腫瘤壞死因子-α抗體(anti_TNF_ a )、生物素化的單克隆兔抗人腫瘤壞死因子-a (Bio-ant1-TNF-a)、人免疫球蛋白G(IgG) (Abeam, UK);尿酸(UA)、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖(GLU)(上海生工生物有限公司，上海)；3_環(huán)氧基丙氧丙基三甲氧基硅烷(C9H2tlO5Si, G0PS)、吐溫-20 (Tween-20)、凝血酶和血小板生長因子(PDGF) (Sigma-Aldrich C0.St.Louis, MO，USA);多巴胺(DA)(阿拉丁試劑有限公司，上海)；鏈酶親和素(SA)和SYBR Green I (北京百泰科生物技術(shù)有限公司，北京)；乙醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司，天津)；丙酮(分析純，天津市富宇精細化工有限公司，天津)；無水甲苯是分析純的甲苯經(jīng)過二次減壓蒸餾制備而獲得Aa2HPO4.12H20(分析純，天津市廣成化學(xué)試劑廠，天津)；NaH2P04*2H20(分析純，天津市廣成化學(xué)試劑廠，天津)；NaCl(分析純，天津市塘沽化學(xué)試劑廠，天津)；混合纖維素酯微孔濾膜(孔徑0.22 μ m，上海興亞凈化材料廠，上海)；蓋玻片(22X22mm,厚度0.17mm, Cole-parmer, VernonHills, 111.,USA)。
[0050]實驗中使用到的各種緩沖溶液的配方如下:
[0051]PBS 緩沖溶液:0.15mol/L NaCl，7.6Xl(T3mol/L Na2HP04，2.4Xl(T3mol/LNaH2PO4, pH7.4。
[0052]PBS-T 緩沖溶液:0.15mol/L NaCl，7.6X l(T3mol/L Na2HPO4, 2.4X l(T3mol/LNaH2PO4,0.05% Tween-20, pH7.4。
[0053]TE 緩沖溶液:10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L Na2EDTA, pH8.0。
[0054]HCR 反應(yīng)緩沖液:50mM Na2HPO4,0.5M NaCl, pH6.8。
[0055]實施例1
[0056]一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器，由腫瘤壞死因子-α捕獲抗體(ant1-TNF-α)、單克隆兔抗人腫瘤壞死因子-α檢測抗體(Bio-ant1-TNF-a )、鏈霉親和素、生物素化的引物和發(fā)卡探針組成；
[0057]所述生物素化的引物(Bio-1)的堿基序列為5’ -AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGTTAA TTT TTT TTT-biotin-3’ ；
[0058]所述發(fā)卡探針由發(fā)卡探針Hl和發(fā)卡探針H2組成，其中發(fā)卡探針Hl的堿基序列為5’ -TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’ ；
[0059]發(fā)卡探針H2 的堿基序列為 5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAATCC TAG ACT ACT TTG-3，。
[0060]該免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0061 ] (I)夾心免疫反應(yīng)過程的構(gòu)建:將50 μ L的腫瘤壞死因子-α捕獲抗體(ant1-TNF-a) (20pM)滴到硅烷化處理的玻璃基底上，在37°C的保濕條件下孵育12h ;加入50 μ I的封閉劑(50mM，乙醇胺)，在保濕條件下反應(yīng)5h來封閉暴露的位點，以減少非特異性吸附。再加入50 μ I的檢測抗體(Bio-ant1-TNF- α ) (30pM)在37°C孵育2h ;在每一步反應(yīng)之后，都是用PBS-T和純水沖洗三次來除去未結(jié)合的試劑；
[0062](2)基于雜交鏈反應(yīng)的免疫傳感器的構(gòu)建:免疫雜交反應(yīng)之后，向玻璃基底上加Λ 50 μ I的鏈霉親和素(SA)，孵育2h。使用PBS-T和純水沖洗三次之后，加入50 μ I的生物素化的引物(Bio-1) (0.1nM)，孵育2h。對基底進行清洗之后，加入發(fā)卡探針的混合物(H1，10nM、H2，IOnM)，孵育4h。Hl和H2在使用之前經(jīng)過退火步驟，目的是保證發(fā)卡的穩(wěn)定性，退火過程是在90°C加熱5min，然后緩慢冷卻到室溫。最后，整個基底再次用PBS-T和純水沖洗三次來除去未反應(yīng)的發(fā)卡探針，即得。
[0063]步驟(I)中，玻璃基底的硅烷化處理方法包括清洗和硅烷化兩步，首先將玻璃基底在質(zhì)量濃度為6%的鉻酸溶液中浸泡12h，用大量清水沖洗，再用純水沖洗；之后，將玻璃基底依次在丙酮、乙醇和純水中超聲清洗，每次lOmin，每種溶液清洗兩次，每次清洗后更換新的溶液；之后，將清洗干凈的玻璃基底加入鹽酸、純水、雙氧水體積比為1:1:1的混合溶液中超聲30min ;再用純水超聲清洗兩次，每次IOmin ;最后，將活化好的蓋玻片放入120°C的恒溫干燥箱中，以除去上面殘留的水分；然后將處理好的玻璃基底放入體積分數(shù)為6%的GOPS-無水甲苯溶液中進行硅烷化處理，該反應(yīng)在95 °C下反應(yīng)6h ;反應(yīng)結(jié)束后，將玻璃基底取出，依次在甲苯、乙醇和純水中超聲清洗15min;經(jīng)氮氣流吹干后，制備好的硅烷化的蓋玻片貯存在干燥器中備用。
[0064]步驟(2)中，Bio-1的堿基序列為 5’ -AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA TTTTTT TTT-biotin-3’ ；
[0065]發(fā)卡探針Hl 的堿基序列為 5’-TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGTCTA GGA TTC GGC GTG-3’ ；
[0066]發(fā)卡探針H2 的堿基序列為 5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAATCC TAG ACT ACT TTG-3，。
[0067]該免疫傳感器在在TNF- α檢測中的應(yīng)用方法為:
[0068](I)將50 μ L的腫瘤壞死因子-α捕獲抗體(ant1-TNF- α ) (20pM)滴到新鮮制備的玻璃基底上，在37°C的保濕條件下孵育12h。加入50 μ L的封閉劑(50mM，乙醇胺)，在保濕條件下反應(yīng)5h來封閉暴露的位點，以減少非特異性吸附。加入50 μ L的TNF- α孵育2h，形成了抗體-抗原復(fù)合物，再加入50 μ L的檢測抗體(Bio-ant1-TNF- α ) (30pM)在37°C孵育2h。此抗體識別抗原的不同位點，而形成“三明治”型的免疫復(fù)合物；在每一步反應(yīng)之后，都是用PBS-T和純水沖洗三次來除去未結(jié)合的試劑；
[0069](2)免疫雜交反應(yīng)之后，向玻璃基底上加入50 μ L的鏈酶親和素(SA)，孵育2h。使用PBS-T和純水沖洗三次之后，加入50 μ L的生物素化的引物(Bio-1) (0.1nM)，孵育2h。對基底進行清洗之后，加入發(fā)卡探針的混合物(Hl，10nM、H2，IOnM)，孵育4h。Hl和H2在使用之前經(jīng)過退火步驟，目的是保證發(fā)卡的穩(wěn)定性，退火過程是在90°C加熱5min，然后緩慢冷卻到室溫。最后，整個基底再次用PBS-T和純水沖洗三次來除去未反應(yīng)的發(fā)卡探針；
[0070](3)加入50μ L的SYBR Green I (10 μ Μ)，室溫下孵育lOmin。吸去過量未反應(yīng)的SYBR Green I，清洗三次之后，加入相同體積的PBS緩沖溶液，進行熒光成像實驗。選擇60X物鏡，設(shè)置曝光時間為100ms，增益值為2000，將實驗后所得的蓋玻片固定到載物臺上。開啟汞燈，調(diào)整激發(fā)波長濾光片，選擇470?490nm之間的激發(fā)通道，使熒光染料分子SYBRGreen I受到激發(fā)而發(fā)出熒光。調(diào)整焦距，獲得熒光圖片，用MetaMorph軟件對獲得的熒光圖片進行處理，并進行數(shù)據(jù)分析。
[0071]實施例2
[0072]—種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器，其制備方法中，ant1-TNF- α的濃度為IOpM ;封閉劑為牛血清蛋白，濃度為60mM ；Bio-ant1-TNF-α的濃度為20ρΜ，鏈霉親和素的濃度為ΙΟρΜ，Bio-1的濃度為0.5nM，發(fā)卡探針H1、H2的混合物中，Hl和H2濃度相同，均為5nM ；
[0073]ant1-TNF-α、封閉劑、Bio-ant1-TNF-a、鏈霉親和素、Bio-Ι、發(fā)卡探針 H1、H2 的混合物加入量的體積比為1:2:1:2:1 ;其余同實施例1。
[0074]實施例3[0075]—種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器，其制備方法中，ant1-TNF-α的濃度為30pM ;封閉劑為牛血清蛋白，濃度為20mM ；Bio-ant1-TNF-α的濃度為40ρΜ，鏈霉親和素的濃度為80pM，Bio-1的濃度為0.1nM，發(fā)卡探針H1、H2的混合物中，Hl和H2濃度相同，均為15nM ；
[0076]ant1-TNF-α、封閉劑、Bio-ant1-TNF-a、鏈霉親和素、Bio-Ι、發(fā)卡探針 H1、H2 的混合物加入量的體積比為2:1:2:1:2 ;其余同實施例1。
[0077]實施例4
[0078]線性和檢測限考察:
[0079]配制不同濃度的TNF- α溶液，檢測方法同實施例1，考察熒光亮點數(shù)與TNF- α濃度之間的關(guān)系。結(jié)果表明:熒光亮點數(shù)和TNF-a在50fM到IpM的濃度范圍之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=L 237+9.505C，相關(guān)系數(shù)為0.998，線性關(guān)系圖見圖2。
[0080]實施例5
[0081]精密度、重現(xiàn)性、選擇性和回收率考察:
[0082]為了驗證該免疫傳感器的精密度和重現(xiàn)性，進行了日內(nèi)實驗和日間實驗的相對標準偏差(RSD)的考察(N = 5)。實驗結(jié)果表明，一次實驗中，在IpM和0.1pM兩個不同濃度下的五個樣本的變動系數(shù)分別為3.6%和3.2%。同樣在上述兩個濃度下，連續(xù)五次實驗之間的變動系數(shù)分別為4.2%和3.8%。
[0083]由于方法的特異性在生物樣本分析中占據(jù)重要的作用，因此，有必要考察該方法在生物樣本中對TNF-a的特異性識別能力，實驗中選用人IgG、凝血酶、血小板生長因子(PDGF)和BSA作為干擾物。從圖3可知，在相同的抗原濃度下(1.0pM)，干擾物產(chǎn)生的信號強度遠遠低于TNF-α。為了進一步考察該設(shè)計在混合樣本中，對TNF-α的特異選擇性，將
1.0pM 的 TNF- α 與 10.0pM 的人 IgG、10.0pM 的凝血酶、10.0pM 的 PDGF 和 10.0pM 的 BSA 同時孵育，該條件下產(chǎn)生的熒光強度與相同條件下、單純的TNF-a的幾乎相同。這些結(jié)果表明，該熒光免疫傳感器對TNF- α具有良好的選擇性。
[0084]還進行了 TNF-a在小牛血清中回收率的考察。兩種不同TNF_a添加濃度下(1.0pM和0.1pM)的回收率在93% -95%的范圍內(nèi)。
[0085]實施例6
[0086]樣本基質(zhì)組分干擾試驗:
[0087]選擇普通人血清中共存的Na+、Cl-、葡萄糖(GLU)、尿酸(UA)和多巴胺(DA)五種組分，組分濃度接近于其在正常人血清中的最高水平，檢測在不同干擾組分存在的條件下，對其熒光免疫實驗的信號強度與正常樣本(也就是不添加任何干擾成分)進行比較，結(jié)果如圖4所示，在不同干擾組分存在的條件下，熒光免疫實驗的信號強度與正常樣本的基本相同。證明復(fù)雜基質(zhì)對該免疫傳感器產(chǎn)生的干擾是微乎其微的。
[0088]實施例7
[0089]驗證性實驗
[0090]本發(fā)明的免疫傳感器中的亮點，是由大量的SYBR Green I插入到長的雙螺旋DNA中產(chǎn)生的，為了證明該設(shè)計中HCR的重要性，我們利用典型的熒光成像實驗來給予證實。其中，以加入目標物TNF- α的免疫傳感器作為陽性組，不含目標物TNF- α的免疫傳感器作為陰性組，加入目標物TNF-α，但不加入發(fā)卡探針的免疫傳感器作為對照組；實驗結(jié)果如圖5所示，當有目標物TNF-α存在時，可以觀察到大量的熒光亮點存在。反之，即使加入染料后，在視野中也觀察不到亮點。結(jié)果說明，沒有雙鏈DNA的生成就不會產(chǎn)生亮點。另外，在對照組中，加入目標物TNF- α，但是不加發(fā)卡探針，這種情況下不會發(fā)生HCR的鏈延伸反應(yīng)，此時，幾乎沒有可見的亮點存在。同樣地，該結(jié)果有力地證明HCR反應(yīng)在SMD計數(shù)中的重要作用。
[0091]實施例8
[0092]采用本發(fā)明實施例1制備的免疫傳感器，對四份正常人血清樣本進行考察。檢測結(jié)果見表1，結(jié)果表明:在四個血清樣本中，檢測到的TNF-α濃度在0.39pM到0.52pM的范圍內(nèi)，這與文獻報道的(0.29pM到0.58pM)TNF-a正常范圍是相吻合的。
[0093]表1樣品測定結(jié)果
[0094]
【權(quán)利要求】
1.一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器，其特征在于，由捕獲抗體、檢測抗體、鏈霉親和素、生物素化的引物和發(fā)卡探針組成； 所述捕獲抗體為ant1-TNF-α ； 所述檢測抗體為Bio-ant1-TNF-a ； 所述生物素化的引物的堿基序列為5，-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA TTT TTTTTT-biotin-3’ ； 所述發(fā)卡探針由發(fā)卡探針Hl和發(fā)卡探針H2組成，其中發(fā)卡探針Hl的堿基序列為5’ -TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’ ； 發(fā)卡探針 H2 的堿基序列為 5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCCTAG ACT ACT TTG-3，。
2.權(quán)利要求1所述的一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟: (1)夾心免疫反應(yīng)過程的構(gòu)建:將捕獲抗體ant1-TNF-a滴到硅烷化處理的玻璃基底上，在37°C的保濕條件下孵育8-14h ;加入封閉劑，在保濕條件下反應(yīng)3-8h，封閉暴露的位點，以減少非特異性吸附；再加入檢測抗體Bio-ant1-TNF-a，在37°C孵育l_3h ;在每一步反應(yīng)之后，均用PBS-T和純水沖洗多次，除去未結(jié)合的試劑； (2)基于雜交鏈反應(yīng)的免疫傳感器的構(gòu)建:免疫雜交反應(yīng)之后，向玻璃基底上加入鏈霉親和素，孵育l_3h ；PBS-T和純水沖洗多次之后，加入Bio-1，孵育l-3h ;PBS_T和純水沖洗多次之后，加入發(fā)卡探針H1、H2的混合物，孵育2-6h ;玻璃基底再次用PBS-T和純水沖洗多次，除去未反應(yīng)的發(fā)卡探針，即得； 步驟⑴中，ant1-TNF-a的濃度為10_30pM，封閉劑的濃度為20_60mM，Bio-ant1-TNF-a 的濃度為 20_40pM ； 所述封閉劑為乙醇胺或牛血清蛋白； 步驟(2)中，鏈霉親和素的濃度為10-80pM，Bio-1的濃度為0.1-0.5nM，發(fā)卡探針H1、H2的混合物中，Hl和H2濃度相同，均為5-15nM ； ant1-TNF-a、封閉劑、Bio-ant1-TNF-a、鏈霉親和素、Bio-Ι、發(fā)卡探針H1、H2的混合物加入量的體積比為(I~2): (I~2): (I~2): (I~2): (I~2)。
3.如權(quán)利要求2所述的一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，玻璃基底的硅烷化處理包括以下步驟: a:清洗，將玻璃基底在質(zhì)量濃度為5%~8%的鉻酸溶液中浸泡8-16h，用大量清水沖洗，再用純水沖洗；之后，將玻璃基底依次在丙酮、乙醇和純水中超聲清洗，每次lOmin，每種溶液清洗多次，每次清洗后更換新的溶液；之后，將清洗干凈的玻璃基底加入鹽酸、純水、雙氧水體積比為1:1:1的混合溶液中超聲30min ;再用純水超聲清洗多次,每次IOmin ;最后，將活化好的蓋玻片放入120°C的恒溫干燥箱中，除去上面殘留的水分； b:硅烷化，將步驟a處理好的玻璃基底放入體積分數(shù)為6%的GOPS-無水甲苯溶液中進行硅烷化處理，該反應(yīng)在95°C下反應(yīng)6h;反應(yīng)結(jié)束后，將玻璃基底取出，依次在甲苯、乙醇和純水中超聲清洗15min ;經(jīng)氮氣流吹干后，制備好的硅烷化的蓋玻片貯存在干燥器中備用。
4.如權(quán)利要求2所述的一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，封閉劑為乙醇胺，濃度為50mM。
5.如權(quán)利要求2所述的一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，鏈霉親和素的濃度為30pM。
6.如權(quán)利要求2所述的一種基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，發(fā)卡探針Hl和H2在使用之前經(jīng)過退火步驟，退火過程是在90°C加熱5min,然后冷卻至室溫。
7.權(quán)利要求1所述基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器在TNF-α檢測中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的基于雜交鏈反應(yīng)和單分子計數(shù)的免疫傳感器在TNF-α檢測中的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用方法為: (1)將捕獲抗體ant1-TNF-α滴到硅烷化處理的玻璃基底上，在37°C的保濕條件下孵育8-14h ;加入封閉劑，在保濕條件下反應(yīng)3-8h，封閉暴露的位點，以減少非特異性吸附；，加入待檢測的TNF-a，孵育l_3h，形成了抗體-抗原復(fù)合物；再加入檢測抗體Bio-ant1-TNF-a，在37°C孵育l_3h ;而形成“三明治”型的免疫復(fù)合物； (2)免疫雜交反應(yīng)之后，向玻璃基底上加入鏈霉親和素，孵育l_3h；PBS-T和純水沖洗多次之后，加入Bio-1，孵育l-3h ;對玻璃基底進行清洗之后，加入發(fā)卡探針H1、H2的混合物，孵育2-6h ;玻璃基底再次用PBS-T和純水沖洗多次，除去未反應(yīng)的發(fā)卡探針； (3)熒光成像檢測:加入SYBRGreen I，室溫下孵育IOmin ;吸去過量未反應(yīng)的SYBRGreen I，用PBS-T和純水沖洗多次后，加入相同體積的PBS緩沖溶液，進行熒光成像實驗，對獲得的熒光圖片進行處理，并進行數(shù)據(jù)分析； 步驟(1)、(2)、(3)中，ant1-TNF-a、封閉劑、待檢測的 TNF-a ,Bio-ant1-TNF-a、鏈霉親和素、Bio-1、發(fā)卡探針H1、H2的混合物、SYBR Green I加入量的體積比為(I~2): (I~2): (I ~2):(I ~2):(I ~2): (I ~2):(I ~2)； 步驟(3)中，SYBR Green I的濃度為δ-ΙδμΜ。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用方法的步驟(3)中，熒光成像檢測的實驗設(shè)置為:選擇60Χ物鏡，設(shè)置曝光時間為100ms，增益值為2000，將實驗后所得的蓋玻片固定到載物臺上；開啟汞燈，調(diào)整激發(fā)波長濾光片，選擇470~490nm之間的激發(fā)通道，使熒光染料分子SYBR Green I受到激發(fā)而發(fā)出熒光；調(diào)整焦距，獲得熒光圖片，用MetaMorph軟件對獲得的熒光圖片進行處理，并進行數(shù)據(jù)分析。
【文檔編號】G01N33/533GK103940989SQ201410171532
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】王磊, 姜瑋, 代爽 申請人:山東大學(xué)