一種基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法，通過激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)的熒光相關(guān)譜模塊在不同激光功率下對(duì)供體和受體熒光標(biāo)記的活細(xì)胞進(jìn)行選擇性供體激發(fā)，相關(guān)卡對(duì)供體通道和受體通道的光子數(shù)漲落信號(hào)采集形成自相關(guān)曲線，通過對(duì)受體自相關(guān)曲線的三線態(tài)分析可以計(jì)算能量轉(zhuǎn)移速率和轉(zhuǎn)移效率，利用最大熵算法還可從受體三線態(tài)自相關(guān)曲線中反演其三線態(tài)分布進(jìn)而計(jì)算供受體距離分布，熒光相關(guān)譜分析本身就是稀溶液濃度測(cè)量的優(yōu)秀技術(shù)，因此對(duì)光譜重疊項(xiàng)積分項(xiàng)作供體受體濃度比例修正后，本發(fā)明可以應(yīng)用于供體受體非配對(duì)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率以及距離分布的測(cè)量，該方法測(cè)量方便，測(cè)量精度高。
【專利說(shuō)明】一種基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及熒光共振能量轉(zhuǎn)移距離分布的測(cè)量方法，具體是指一種基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法。
【背景技術(shù)】
[0002]熒光共振能量轉(zhuǎn)移是一種受激發(fā)的供體熒光分子通過偶極子-偶極子長(zhǎng)程庫(kù)倫相互作用將激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移給鄰近基態(tài)受體分子的光物理過程。熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生需要供體分子和受體分子之間的距離在1-1Onm之間。這個(gè)空間尺度正好是活體細(xì)胞中各類分子相互作用的線度，因此熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)特別適用于細(xì)胞內(nèi)分子互作用以及分子構(gòu)象變化的研究 。
[0003]熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)，供體熒光會(huì)下降而受體熒光會(huì)上升。利用這一點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的測(cè)量一般分為穩(wěn)態(tài)熒光測(cè)量法和熒光壽命測(cè)量法兩種。穩(wěn)態(tài)熒光測(cè)量法包括光譜擬合法和受體漂白法。在供體通道分別測(cè)量的對(duì)供受體同時(shí)存在的樣品和供體單獨(dú)存在的樣品分別測(cè)量其熒光強(qiáng)度Fda和Fd，就可以確定熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率E = 1_Fda/Fd，或利用供體標(biāo)準(zhǔn)歸一化光譜SPd和受體標(biāo)準(zhǔn)歸一化光譜SPa可以從供體受體標(biāo)準(zhǔn)歸一化光譜 SPdaU) = (l-E)*SPDU)+E*OA*b*SPAU)/0)D 中擬合得出轉(zhuǎn)移效率，其中 Od 和 ΦΑ


分別為供體和受體的熒光量子產(chǎn)率；b為比例系數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法，該方法包括如下步驟: (1)在單個(gè)細(xì)胞中分別表達(dá)供體熒光蛋白和受體熒光蛋白以及在單個(gè)細(xì)胞中共同表達(dá)供體熒光蛋白和受體熒光蛋白，供體熒光蛋白下述簡(jiǎn)稱為供體，受體熒光蛋白下述簡(jiǎn)稱為受體； (2)利用激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的熒光相關(guān)譜模塊對(duì)所述單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行熒光相關(guān)譜測(cè)量，獲得單獨(dú)供體的自相關(guān)曲線GDd( τ )、單獨(dú)受體的自相關(guān)曲線GAa( τ )、供體受體同時(shí)存在的供體自相關(guān)曲線Gllb(T)以及供體受體同時(shí)存在的受體自相關(guān)曲線GAb(T)； (3)利用自相關(guān)函數(shù)對(duì)步驟(2)中獲得單獨(dú)供體的自相關(guān)曲線Gm(T)進(jìn)行擬合，計(jì)算供體在不同供體波長(zhǎng)激光功率下平衡時(shí)三線態(tài)平均比例和三線態(tài)弛豫時(shí)間T&，并分別對(duì)此供體波長(zhǎng)激光功率的對(duì)數(shù)作圖，同樣地對(duì)單獨(dú)受體的自相關(guān)曲線GAa( τ )進(jìn)行擬合，獲得受體在不同受體波長(zhǎng)激光功率下平衡時(shí)三線態(tài)平均比例?巧和三線態(tài)弛豫時(shí)間 #;，并分別對(duì)此受體波長(zhǎng)激光功率的對(duì)數(shù)作圖； (4)針對(duì)步驟(3)中單獨(dú)供體在不同激光功率下平衡時(shí)三線態(tài)平均比例和三線態(tài)弛豫時(shí)間Ιτ&兩條曲線數(shù)據(jù)，進(jìn)行聯(lián)合的列文伯格-馬夸爾特非線性最小二乘法擬合，擬合時(shí)參考已知的供體熒光壽命可確定供體熒光衰減速率fcfad: 求得供體的系間竄越Afso供體的三線態(tài)衰減速率常數(shù)以及供體的激發(fā)截面aJL (5)重復(fù)第(4)步驟，由已知的受體熒光壽命確定由步驟(3)獲得的單獨(dú)受體的兩條曲線數(shù)據(jù)受體平衡時(shí)三線態(tài)平均比重巧^和受體三線態(tài)弛豫時(shí)間^^對(duì)同樣的兩條公式進(jìn)行聯(lián)合擬合，求得受體的系間竄越fcfse、受體的三線態(tài)衰減速率常數(shù) (6)重復(fù)第(3)、(4)步驟，利用步驟(2)方案三獲得的供體受體同時(shí)存在的受體自相關(guān)曲線GAb( τ )數(shù)據(jù)，獲得受體在不同供體激光功率下的平衡時(shí)三線態(tài)平均比例和三線態(tài)弛豫時(shí)間T益，考慮了熒光共振能量轉(zhuǎn)移速率速率常數(shù)kFKET之后，對(duì)步驟(4)中出現(xiàn)的兩條公式中針對(duì)受體的kM。參數(shù)進(jìn)行修正； (7)利用修正之后的公式求取熒光共振能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)kET和能量轉(zhuǎn)移效率E； (8)任意選取上述步驟(2)不同激光功率的某一激光功率下的受體自相關(guān)曲線，用最大熵算法反演獲得受體的三線態(tài)權(quán)值分布函數(shù) (9)利用步驟(4)、步驟(5)中獲得的供體和受體各自的系間竄越、三線態(tài)衰減速率常數(shù)以及激發(fā)截面化1，在確定供體激發(fā)的激光功率下模擬計(jì)算不同能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)kET所對(duì)應(yīng)的受體三線態(tài)的弛豫特征時(shí)間值1^，并用數(shù)值作圖法表現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)kET對(duì)受體三線態(tài)的弛豫特征時(shí)間值的函數(shù)關(guān)系及其反函數(shù)的導(dǎo)函數(shù)關(guān) (10)由步驟(7)獲得的能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)kET對(duì)受體三線態(tài)的弛豫特征時(shí)間值Iii的函數(shù)關(guān)系以及導(dǎo)函數(shù)關(guān)系dTtri/i?ET，通過概率分布函數(shù)的自由變量之間的轉(zhuǎn)換，將步驟(8)獲得的三線態(tài)權(quán)值分布函數(shù)變換到能量轉(zhuǎn)移速率分布函數(shù)/feCT(feET)，最后變換到供受體距離分布f； (r)，此時(shí)得到的是供體受體濃度在1:1情況下的距離分布情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法，其特征在于:所述步驟(2)中對(duì)所述單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行熒光相關(guān)譜測(cè)量具體采用如下測(cè)量方法:測(cè)量時(shí)需要進(jìn)行如下三組測(cè)量方案同時(shí)進(jìn)行:方案一、在單獨(dú)表達(dá)供體的單個(gè)細(xì)胞采用供體激發(fā)波長(zhǎng)在不同功率下的激光激發(fā)供體，在供體通道進(jìn)行熒光光子數(shù)計(jì)數(shù)而獲得單獨(dú)供體的自相關(guān)曲線Gm(T);方案二、在單獨(dú)表達(dá)受體的單個(gè)細(xì)胞采用跟激發(fā)供體同樣系列的激光功率激發(fā)受體，在受體通道進(jìn)行熒光光子數(shù)計(jì)數(shù)而獲得單獨(dú)受體的自相關(guān)曲線GAa( τ );方案三、在共同表達(dá)供體和受體的單個(gè)細(xì)胞采用跟同樣系列的激光功率激發(fā)供體，在供體通道獲得供體受體同時(shí)存在的供體自相關(guān)曲線GDb( τ )以及在受體通道獲得供體受體同時(shí)存在的受體自相關(guān)曲線GAb(T)，這里τ是指相關(guān)時(shí)間，上標(biāo)的大寫字母D表示供體通道的供體熒光信號(hào)，上標(biāo)的大寫字母A表示受體通道的受體熒光信號(hào)，上標(biāo)的小寫字母d表示供體單獨(dú)存在的樣品，上標(biāo)的小與字母a表不受:體單獨(dú)存在的樣品，上標(biāo)的小與字母b表不供體和受體同時(shí)存在的樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法， 其特征在于:所述步驟(4)中采用如下兩個(gè)公式進(jìn)行聯(lián)合的列文伯格-馬夸爾特非線性最小二乘法擬合:
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法，其特征在于:所述步驟(6)中，對(duì)步驟(4)中出現(xiàn)的兩條公式中針對(duì)受體的k_參數(shù)做如下修正:
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法，其特征在于:所述步驟(10)中，能量轉(zhuǎn)移速率分布函數(shù):/fcET(feET)的計(jì)算公式如下:

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的基于熒光相關(guān)譜的供體受體距離分布測(cè)量方法，該方法還包括如下步驟: (11)從供體和受體同時(shí)存在的供體自相關(guān)曲線Gllb(T)和供體和受體同時(shí)存在的受體自相關(guān)曲線GAb(T)的擴(kuò)散部分分別求出探測(cè)體積內(nèi)的發(fā)光供體分子數(shù)Nd和受體分子數(shù)NA，并利用步驟(7)計(jì)算獲得的能量轉(zhuǎn)移效率E以及激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的探測(cè)體積Vrff，計(jì)算供體分子濃度:
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103983623SQ201410182400
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】陳秉靈, 郭周義 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)