一種復(fù)合材料的葡萄糖傳感器的制備方法
【專利摘要】一種復(fù)合材料的葡萄糖傳感器的制備方法，屬于電化學(xué)分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明通過化學(xué)還原法，以酪蛋白為穩(wěn)定劑和還原劑，制備核殼Fe3O4@Au復(fù)合粒子，具有制備簡單易得等優(yōu)點，生物相容性好，利于生物酶的固定；再將葡萄糖氧化酶固定在核殼Fe3O4@Au復(fù)合粒子表面，修飾電極，制備Fe3O4@Au葡萄糖生物傳感器，此合成方法簡單、成本低，且綠色。該傳感器檢測葡萄糖具有較快的響應(yīng)時間、較寬的線性范圍、低的檢出限、高的靈敏度、良好的選擇性。而且該傳感器具有優(yōu)異的重現(xiàn)性和良好的抗干擾能力，很好的長期穩(wěn)定性。
【專利說明】一種復(fù)合材料的葡萄糖傳感器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于電化學(xué)分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及基于Fe3O4OAu納米復(fù)合材料的葡萄糖傳感器的制備和應(yīng)用的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會的快速發(fā)展以及人們生活水平的提高，糖尿病患病率也隨之增高，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，目前已經(jīng)有3.46億人口患有糖尿病，能夠?qū)崟r、可靠檢測血糖的濃度是診斷和控制糖尿病的有效方法。
[0003]電化學(xué)傳感器由于靈敏度高、選擇性好、實驗簡便快速、所需儀器設(shè)備價格低廉等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于生命物質(zhì)的電化學(xué)檢測。開發(fā)用于檢測體內(nèi)葡萄糖濃度的微小變化的、高靈敏度的葡萄糖傳感器具有重要的科學(xué)意義和使用價值。
[0004]核殼納米結(jié)構(gòu)是一種理想的復(fù)合結(jié)構(gòu)，因為其除具有單一粒子的體積效應(yīng)，表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)外，還具有復(fù)合協(xié)同多功能效應(yīng)。而通常磁性材料在外磁場作用下易團聚，限制了其應(yīng)用范圍。制備具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性復(fù)合粒子，可擴大磁性粒子的應(yīng)用領(lǐng)域。大量研究表明Au是保護Fe3O4納米粒子最好的材料之一。這樣得到的粒子既具有Fe3O4的磁性，又有Au的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，同時Au殼可以能保護Fe3O4納米粒子不被氧化和腐蝕，還能與巰基等官能團作用，易于表面功能化，從而拓寬其在蛋白分離、藥物運輸、催化、生物傳感器等領(lǐng)域的應(yīng)用。目前制備Fe3O4OAu復(fù)合粒子的方法主要有水熱法、微乳液法和化學(xué)還原法。其中水熱法和微乳液法制得產(chǎn)物粒徑較小均一，但其制備過程復(fù)雜，影響因素較多。與之相比，化學(xué)還原法具有制備簡單易得等優(yōu)點。
[0005]葡萄糖氧化酶因為具有極其重要的催化活性而被廣泛研究。而且其價格低廉，性質(zhì)穩(wěn)定，實用性強，常被人們用作制備生物傳感器的理想分子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種基于Fe3O4OAu納米復(fù)合材料的葡萄糖傳感器的制備方法。
[0007]本發(fā)明包括以下步驟:
O采用Massart共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子；
2)將酪蛋白溶液與Fe3O4磁性納米粒子在超聲條件下混合制備酪蛋白修飾的Fe3O4納米粒子；
3)將釀蛋白修飾的Fe3O4納米粒子以釀蛋白溶液稀釋后與HAuCl4混合，在混合體系的 值為中性和氮氣保護的條件下反應(yīng)，然后經(jīng)磁分離取得以Fe3O4為核、以Au為殼的核殼
Fe3O4OAu復(fù)合粒子；
4)將由葡萄糖氧化酶溶于去離子水形成的酶溶液與核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子在超聲條件下混合后均勻滴涂在圓盤Pt電極表面，然后置于4°C冰箱中制干，即得具有葡萄糖傳感器的酶電極。[0008]本發(fā)明通過化學(xué)還原法，以酪蛋白為穩(wěn)定劑和還原劑，制備核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子，具有制備簡單易得等優(yōu)點，生物相容性好，利于生物酶的固定；再將葡萄糖氧化酶固定在核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子表面，修飾電極，制備Fe3O4OAu葡萄糖生物傳感器，此合成方法簡單、成本低，且綠色。
[0009]該傳感器檢測葡萄糖具有較快的響應(yīng)時間、較寬的線性范圍、低的檢出限、高的靈敏度、良好的選擇性。而且該傳感器具有優(yōu)異的重現(xiàn)性和良好的抗干擾能力，很好的長期穩(wěn)定性。由于Au和Fe3O4較好的生物相容性和協(xié)同作用，F(xiàn)e3O4OAu功能復(fù)合納米粒子為生物分子的固定和高靈敏的檢測提供了很好生物平臺，在生物傳感器和糖尿病診斷、臨床醫(yī)學(xué)和食品工藝檢測等領(lǐng)域可得到廣泛應(yīng)用。
[0010]為了除去未被固定的酶，以提高檢測的準(zhǔn)確性，所述酶電極在使用前先置于B-R緩沖溶液中洗滌。
[0011]所述酶電極保存于4°C冰箱中，以保持酶電極中葡萄糖氧化酶的活性。
[0012]上述步驟I)中，在氮氣氛圍中，將FeCl2和FeCl3以1: 2的濃度摩爾比混合后加入過量的濃氨水中，在反應(yīng)體系的溫度為80°C的條件下攪拌反應(yīng)至結(jié)束，再從反應(yīng)混合體系中磁分離出固相后用乙醇和水洗滌。在堿性環(huán)境和氮氣氛圍中，將鐵離子與亞鐵離子共沉淀生成Fe3O4磁性納米粒子的優(yōu)點在于該方法操作簡單，簡便易行，且采用該法制備的磁性納米粒子具有原料易得，產(chǎn)品純度高等特點。而水熱法和微乳液法的制備過程較復(fù)雜，影響因素較多。
[0013]上述步驟2)中，用于反應(yīng)的酪蛋白溶液的濃度為10 mg/mL,反應(yīng)體系在反應(yīng)過程中的溫度為25°C。酪蛋白溶液濃度選擇10 mg/mL是因為在該濃度條件下酪蛋白呈膠束狀態(tài)，能夠較好地穩(wěn)定納米粒子，并且最終形成穩(wěn)定的無機-生物復(fù)合結(jié)構(gòu)，在進一步還原Au納米粒子時發(fā)揮其功能性作用。
[0014]反應(yīng)溫度控制為25°C，可以防止高溫條件下，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子易發(fā)生進一步氧化為Fe2O3，從而保證產(chǎn)物較高的純度。
[0015]在所述步驟2)后，以磁場將反應(yīng)后體系中的酪蛋白修飾的Fe3O4納米粒子分離出來，并以乙醇和水洗滌。該操作的可除去未修飾的酪蛋白分子，使得到的產(chǎn)品為均一的蛋白質(zhì)修飾的Fe3O4粒子。
[0016]所述步驟3 )中，反應(yīng)過程中中反應(yīng)體系的溫度為先將80 V。此溫度的選擇是由于我們的反應(yīng)體系未加入任何還原劑，而酪蛋白在室溫條件下還原性較弱，加熱到80°C之后，便可利用酪蛋白自身的還原性還原Au納米粒子，這樣可避免引入其它還原劑。該反應(yīng)體系簡單，且操作方便，易實現(xiàn)。
[0017]所述步驟3)中，將磁分離出的核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子以去離子水和乙醇洗滌。該操作可除去未修飾的酪蛋白分子，使得到的產(chǎn)品都為均一的蛋白修飾的Fe3O4OAu復(fù)合粒子。
[0018]所述步驟4)中，所述酶溶液中葡萄糖氧化酶的濃度為10 mg/mL。該濃度酶可提供足夠量的葡萄糖氧化酶與復(fù)合粒子結(jié)合，使制得的葡萄糖傳感器具有優(yōu)良的傳感性能。
[0019]所述步驟4)中，為除去未被固定的酶，以提高檢測的準(zhǔn)確性，所述酶電極在使用前先置于B-R緩沖溶液中洗滌。該操作目的是將電極表面未修飾的物質(zhì)洗滌干凈，進一步提高電極在使用過程中的靈敏度。[0020]所述步驟4)中，所述酶電極保存于4°C冰箱中。該操作目的是保持酶的活性，避免酶失活，影響電極的傳感性能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明中Fe3O4磁性納米粒子和核殼Fe3O4OAu復(fù)合納米粒子的XRD圖，其中曲線a為Fe3O4磁性納米粒子的XRD圖，曲線b為核殼Fe3O4OAu復(fù)合納米粒子的XRD圖。
[0022]圖2為本發(fā)明中在5mM K3 [Fe (CN6) ]/K4 [Fe (CN6)]溶液中在純Pt電極(曲線a)、Fe3O4OAu復(fù)合納米粒子修飾鉬電極(曲線b)及GOD/ Fe3O4OAu葡萄糖修飾的Pt電極上的循環(huán)伏安圖(曲線C)。 [0023]圖3為本發(fā)明中在B-R (pH=7.0)緩沖溶液中0.55V操作電位下連續(xù)加入0.1mM葡萄糖的GOD/ Fe3O4OAu復(fù)合物修飾鉬電極的響應(yīng)電流與時間的關(guān)系曲線圖。
[0024]圖4為采用本發(fā)明方法制成的酶電極的電流與葡萄糖濃度變化關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0025]1、制備Fe3O4磁性納米粒子:
采用Massart共沉淀法合成四氧化三鐵納米粒子。即在堿性環(huán)境中，鐵離子與亞鐵離子共沉淀生成Fe304。合成原理:
Fe--—2Fe.-—SOHFe；04~4H；0
整個實驗在氮氣氛圍中進行，將FeCl2和FeCl3 (濃度摩爾比為1:2)充分混合，然后緩慢加入過量的25%濃氨水，反應(yīng)溫度為80°C，連續(xù)攪拌20min，停止反應(yīng)，將所得的產(chǎn)物用磁鐵從反應(yīng)物中分離出固相，并用乙醇和水洗滌三次，即得Fe3O4磁性納米粒子。
[0026]制成的Fe3O4磁性納米粒子的XRD如圖1中曲線a所示。
[0027]2、制備酪蛋白(casein)修飾的Fe3O4復(fù)合納米粒子:
取IOmL濃度為10mg/mL的酪蛋白(casein)水溶液在超聲作用下緩慢加入到已制備的Fe3O4磁性納米粒子中，繼續(xù)超聲混合，反應(yīng)溫度為25°C直至反應(yīng)結(jié)束。停止反應(yīng)后，用磁場將酪蛋白(casein)修飾的Fe3O4納米粒子分離出來并用乙醇和水洗滌產(chǎn)物3次，即得酪蛋白(casein)修飾的Fe3O4復(fù)合納米粒子。
[0028]3、制備核殼Fe3O4OAu復(fù)合納米粒子:
取3mL濃度為24mM酪蛋白(casein)修飾的Fe3O4納米粒子,用30mL的I mg/mL酪蛋白溶液稀釋，超聲分散30min，經(jīng)調(diào)節(jié)溶液pH至中性后，加入1.2mLl%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))HAuC14，再將混合液pH調(diào)至中性。在氮氣保護下恒溫80°C攪拌反應(yīng)8h后，停止加熱，在氮氣氛圍中冷卻至室溫。所得產(chǎn)物用磁場分離，并用去離子水和乙醇洗滌，即得到以Fe3O4為核、以Au為殼的核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子。
[0029]制成的核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子XRD如圖1中曲線b所示。
[0030]圖1中的曲線a為Fe3O4 X射線粉末衍射圖，曲線a在2 Θ角為30.1°，35.5°，43.2° ,57.2° ,62.8°附近有衍射峰，分別對應(yīng)Fe3O4反尖晶石(220)，(311 )，(400)，(511)，(440)，與準(zhǔn)譜圖(JCPDS N0.89-0688)相一致。曲線a中沒有觀察到其他物質(zhì)的衍射峰，說明制備的Fe3O4粒子中沒有摻雜其他物質(zhì)。曲線b為Fe3O4IgAuX射線粉末衍射圖，F(xiàn)e3O4 的特征峰消失，在 38.2° ,44.2° ,64.5° ,77.5° 出峰，分別對應(yīng) Au 的(111)，(200)，(220)，(311)晶面。這是由于Au的重原子效應(yīng)，Au包覆在Fe3O4粒子表面，掩蓋了 Fe3O4的特征衍射峰。從圖1中曲線a和曲線b比較說明了 Au包覆在Fe3O4表面,形成了 Fe3O4OAu核殼結(jié)構(gòu)。
[0031]4、制備酶電極:
取一定量的葡萄糖氧化酶溶于去離子水中，配成濃度為10mg/mL的酶溶液。
[0032]將核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子分散在ImL 二次水中，再加入酶溶液，超聲混合均勻。
[0033]然后上述混合液均勻滴涂在圓盤Pt電極表面，放入4°C冰箱中制干并保存。
[0034]新制備的電極在使用前，置于B-R緩沖溶液中攪拌20 min,除去未被固定的酶。
[0035]5、試驗證明制備的Fe304@Au/Pt傳感器的電化學(xué)表征情況:
將Pt電極作為對電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極為，制備的上述Pt圓盤酶電極(直徑3mm)作為工作電極，組成三電極系統(tǒng)。響應(yīng)電流測定時，溫度為25°C，測量電位
0.55V，緩沖液pH=7.0，所有響應(yīng)電流都在B-R緩沖溶液中測得。
[0036]首先，將電解池系統(tǒng)放入恒溫器中，設(shè)置Fe3O4OAu葡萄糖生物傳感器反應(yīng)的電位，將生物傳感器浸沒在B-R緩沖液中，讓背景電流下降到平衡時，即背景電流(Itl),然后測量含有底物的B-R緩沖液中的響應(yīng)電流記為(Is)。酶電極的響應(yīng)電流為實驗中測得的Is與Itl的差值。葡萄糖生物傳感器置于葡萄糖的溶液中，葡萄糖向固定化的酶膜內(nèi)部擴散。葡萄糖氧化酶在有氧條件下催化葡萄糖氧化，生成β-D-葡萄糖酸和過氧化氫。產(chǎn)生的過氧化氫擴散到電極表面，與電極接觸，并產(chǎn)生電流，產(chǎn)生的電流強度與葡萄糖的濃度呈線性關(guān)系O
[0037]因此，通過測定電流強度的變化量就可以定量分析葡萄糖濃度。
[0038]圖2中，曲線a顯示了在5mM K3 [Fe (CN6)]/K4 [Fe (CN6)]溶液中，在裸鉬電極上的循環(huán)伏安圖。曲線b顯示了在5mM K3[Fe (CN6)]/K4[Fe (CN6)]溶液中，在鉬電極上修飾核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子的循環(huán)伏安圖。曲線c顯示了在5mM K3[Fe (CN6) ]/K4 [Fe (CN6)]溶液中，F(xiàn)e3O4OAu葡萄糖生物傳感器的循環(huán)伏安圖。
[0039]曲線a在21 ImV與273mV有一對可逆的鐵氰化鉀還原峰。曲線b的峰電流值顯著增大，因為核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子增大了電極的比表面積,而Au和Fe3O4本身是優(yōu)良的導(dǎo)電材料，所以峰電流值增大。而曲線c的峰電流相對于Fe3O4OAu電極顯著降低，這是由于葡萄糖氧化酶是生物大分子，不導(dǎo)電，阻礙了電極表面的電子傳遞?；谘h(huán)伏安法對電極的表征，說明GOD/ Fe3O4OAu復(fù)合物修飾到電極表面。
[0040]6、電化學(xué)檢測葡萄糖在溶液中的濃度:
在B-R (pH=7.0)緩沖溶液中，0.55V操作電位下，以制備的酶電極對葡萄糖的時間與響應(yīng)電流如圖3所示。
[0041]從圖3可見，隨著葡萄糖溶液的加入，傳感器在5s內(nèi)即達到穩(wěn)定電流。表明該葡萄糖生物傳感器對底物有很快的電催化響應(yīng)。
[0042]從圖4的傳感器響應(yīng)電流與葡萄糖濃度變化關(guān)系圖中看出，當(dāng)葡萄糖濃度在O?
3.5mM范圍內(nèi)，響應(yīng)電流隨葡萄糖濃度的增加而線性增加，線性相關(guān)系數(shù)為0.994，最低檢出限為0.5μΜ (S/N=3)，低于其他傳感器的檢出限。該線性范圍的檢出范圍已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過葡萄糖的生理濃度，以此表明Fe3O4OAu葡萄糖生物傳感器可用于生理水平的葡萄糖濃度的檢測。[0043]以上試驗說明:本發(fā)明方法制備的電極重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，對于同一個葡萄糖傳感器，10次重復(fù)測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差是3.5%，對于5組葡萄糖傳感器，5次測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為
4.3%。而且在生理濃度比例下，尿酸、半胱氨酸、尿素、抗壞血酸等干擾物幾乎不干擾測定。其最低檢測限為500 nM。
【權(quán)利要求】
1.基于核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4OAu納米復(fù)合材料的葡萄糖傳感器的制備方法,其特征在于包括以下步驟: O采用Massart共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子； 2)將酪蛋白溶液與Fe3O4磁性納米粒子在超聲條件下混合制備酪蛋白修飾的Fe3O4納米粒子； 3)將釀蛋白修飾的Fe3O4納米粒子以釀蛋白溶液稀釋后與HAuCl4混合，在混合體系的 值為中性和氮氣保護的條件下反應(yīng)，然后經(jīng)磁分離取得以Fe3O4為核、以Au為殼的核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子； 4)將由葡萄糖氧化酶溶于去離子水形成的酶溶液與核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子在超聲條件下混合后均勻滴涂在圓盤Pt電極表面，然后置于4°C冰箱中制干，即得具有葡萄糖傳感器的酶電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于所述酶電極在使用前先置于B-R緩沖溶液中洗滌除去未被固定的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于所述酶電極保存于4°C冰箱中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于所述步驟I)中，在氮氣氛圍中，將FeCl2和FeCl3Wl: 2的濃度摩爾比混合后加入過量的濃氨水中，在反應(yīng)體系的溫度為80°C的條件下攪拌反應(yīng)至結(jié)束，再從反應(yīng)混合體系中磁分離出固相后用乙醇和水洗漆。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于所述步驟2)中，用于反應(yīng)的酪蛋白溶液的濃度為10 mg/mL,反應(yīng)體系在反應(yīng)過程中的溫度為25°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于在所述步驟2)后，以磁場將反應(yīng)后體系中的酪蛋白修飾的Fe3O4納米粒子分離出來，并以乙醇和水洗滌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于所述步驟3)中，反應(yīng)過程中中反應(yīng)體系的溫度為先將80°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于所述步驟3)中，將磁分離出的核殼Fe3O4OAu復(fù)合粒子以去離子水和乙醇洗滌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于所述步驟4)中，所述酶溶液中葡萄糖氧化酶的濃度為10 mg/mL。
【文檔編號】G01N27/26GK103926297SQ201410183198
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】劉燕, 毛慧淵, 袁敏, 郭榮 申請人:揚州大學(xué)