Ska1蛋白：前列腺癌早期篩查與診斷的靶標分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了SKA1蛋白在作為靶標分子在制備前列腺癌早期篩查與診斷試劑中的應用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SKA1蛋白在前列腺癌前病變與前列腺癌中過表達，SKA1蛋白的過表達誘導人前列腺上皮細胞多中心體的產(chǎn)生，促使人前列腺上皮細胞發(fā)生癌變的轉(zhuǎn)化。經(jīng)驗證前列腺特異性過表達SKA1的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生自發(fā)性前列腺腫瘤。SKA1蛋白的表達量還與臨床前列腺癌前病變以及癌組織中多中心體細胞出現(xiàn)的比例正相關(guān)。這些證據(jù)充分證實了SKA1可以作為早期前列腺癌篩查與診斷的靶標分子。本發(fā)明為前列腺癌早期篩查與診斷提供了新的途徑。
【專利說明】SKA1蛋白：前列腺癌早期篩查與診斷的靶標分子

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及SKA1蛋白作為前列腺癌早期篩查與診斷的靶標分子的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌是歐美國家排名第二的男性"殺手"，而隨著生活質(zhì)量的提高，人口老齡 化，前列腺癌在中國的發(fā)病率迅速升高。據(jù)報道，我國每年約有7-8萬名前列腺癌新增病 例，發(fā)病率以每年25%-30%的速度增長，成為發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤，嚴重威脅男性 健康。前列腺癌早期發(fā)病癥狀不明顯。被診斷時，腫瘤已增大或發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移；此時，病變 已屬晚期，預后效果差，生存率低。因此，前列腺癌的早期篩查與診斷對降低前列腺癌的發(fā) 病率與提1?療效具有重要意義。
[0003] 中心體是維持細胞分裂中兩級紡錘體形成的重要細胞器。中心體由中心粒 (Centriole)與中心粒外周蛋白（Peri_centriolarprotein，PCM)組成。中心粒在每個細 胞分裂周期復制一次，調(diào)控中心體的數(shù)目。中心粒復制起始于有絲分裂前的S期，復制時每 個母本中心粒在其附近產(chǎn)生一個子代中心粒。中心粒于G2期完成復制，復制后的2對中心 粒組建兩個中心體，為有絲分裂做準備。有絲分裂中，兩個中心體在有絲分裂極的兩端牽引 紡錘絲運動，完成有絲分裂。然而，多數(shù)腫瘤細胞中存在多個中心體（多于2個中心體）。 多中心體誘導染色體的不穩(wěn)定，導致抑癌與致癌基因的缺失或過表達，癌癥治療過程中耐 藥性的產(chǎn)生，并與腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。臨床研究表明實體腫瘤組織中多中心體細 胞出現(xiàn)的比例越大，腫瘤的惡性度越高，預后效果越差。最新臨床研究證實多中心體出現(xiàn)在 癌前病變組織中。有證據(jù)表明多中心體可通過引起成體干細胞分裂模式的紊亂誘導腫瘤的 發(fā)生，說明多中心體在癌癥發(fā)生早期就已發(fā)揮致病效應?，F(xiàn)有研究表明部分調(diào)控中心粒復 制的基因或蛋白恰恰是致癌或抑癌基因。例如，乳腺癌中BRCA1基因的突變或Nip基因的 過表達，均能夠引起多中心體的出現(xiàn)并導致乳腺癌的發(fā)生。BRCA1基因的突變現(xiàn)已成為乳腺 癌早期診斷與篩查的重要靶標分子，極大地降低了乳腺癌的發(fā)病率。雖然多中心體與前列 腺癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，并且臨床前列腺癌前病變組織中也已檢測到數(shù)目可觀的多中 心體，但是迄今為止尚未在臨床上找到通過誘導細胞多中心體的產(chǎn)生而促進前列腺癌發(fā)生 與發(fā)展的致病源分子。
[0004] 紡錘體與著絲粒結(jié)合蛋白 SKA1 (spindle and kinetochore-associated proteinl)，屬于紡錘體與著絲粒結(jié)合蛋白SKA家族。SKA1是微管結(jié)合蛋白，負責將其家族 中另外兩個成員SKA2與SKA3結(jié)合到微管上形成SKA復合物。SKA復合物具有保持有絲分 裂中紡錘體微管與著絲粒穩(wěn)定結(jié)合的作用，從而確保有絲分裂的順利完成。本發(fā)明的研究 發(fā)現(xiàn)，SKA1蛋白除了有絲分裂期在微管與著絲粒處富集外，在中心體也有富集。與正常前 列腺組織相比，SKA1在前列腺癌前病變以及腫瘤組織中均過表達。SKA1的過表達導致前列 腺上皮細胞出現(xiàn)多中心體。最為重要的是，前列腺特異性過表達SKA1的轉(zhuǎn)基因小鼠中，有 34%的小鼠（19/56)出現(xiàn)癌前病變，21 % (12/56)的小鼠出現(xiàn)自發(fā)性前列腺腫瘤，表明SKA1 是致癌基因。隨后，在對前列腺癌前病變與前列腺癌臨床標本的篩查中發(fā)現(xiàn)，SKA1的表達 水平與這些癌前病變或癌組織中多中心體出現(xiàn)的比例成正相關(guān)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是從誘導前列腺上皮細胞產(chǎn)生多中心體的分子與蛋白入手，尋找一 種能夠用于前列腺癌早期篩查與診斷的靶標分子，其應具有以下特征（1)這種蛋白在臨床 前列腺腫瘤中異常表達（2)這種蛋白的異常表達能夠誘導前列腺上皮細胞中多中心體的 產(chǎn)生（3)這種蛋白的異常表達能夠影響起前列腺癌的發(fā)生或發(fā)展（4)這種蛋白的異常表達 與臨床標本中多中心體的產(chǎn)生直接相關(guān)。
[0006] 本發(fā)明提供了 SKA1蛋白在作為靶標分子在制備前列腺癌早期篩查與診斷試劑中 的應用。
[0007] 本發(fā)明還提供了用于檢測SKA1蛋白的試劑在制備前列腺癌早期篩查與診斷試劑 盒中的應用。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種前列腺癌早期篩查與診斷試劑盒，其特征在于，包含用于檢 測SKA1蛋白表達水平的試劑。
[0009] 優(yōu)選地，所述的用于檢測SKA1蛋白表達水平的試劑為兔抗人SKA1多克隆抗體。 (如 Sigma，HPA045495)。
[0010] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SKA1蛋白在前列腺癌前病變與前列腺癌中過表達，SKA1蛋白的過表 達誘導人前列腺上皮細胞多中心體的產(chǎn)生，促使人前列腺上皮細胞發(fā)生癌變的轉(zhuǎn)化。經(jīng)驗 證前列腺特異性過表達SKA1的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生自發(fā)性前列腺腫瘤。SKA1蛋白的表達量還 與臨床前列腺癌前病變以及癌組織中多中心體細胞出現(xiàn)的比例正相關(guān)。這些證據(jù)充分證實 了 SKA1可以作為早期前列腺癌篩查與診斷的靶標分子。本發(fā)明的原理如圖9所示。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0012] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并證實了 SKA1蛋白可以作為前列腺癌早期篩查與診斷的靶標分子， 為前列腺癌早期篩查與診斷提供了新的途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1A為實施例1中的免疫組化染色圖；標尺：200 μ m。
[0014] 圖1B為實施例1中的免疫組化評分圖；
[0015] 圖1C為實施例1中的PCR檢測結(jié)果圖；
[0016] 圖2A為用鼠源前列腺上皮特異性啟動子PSP94啟動小鼠 Skal基因的表達示意 圖；
[0017] 圖2B為實施例2中的轉(zhuǎn)基因小鼠免疫組化染色圖；標尺：10 μ m。
[0018] 圖3A為對SKA1-GFP分裂間期細胞進行抗γ -TUBULIN的免疫熒光染色圖， SKA1 (綠色）與中心體標記蛋白γ-TUBULIN(紫色）在分裂間期重合。DAPI染細胞核（藍 色）。標尺：20 μ m。
[0019] 圖3B為對SKA1-GFP分裂期細胞進抗γ -TUBULIN的免疫熒光染色圖圖；SKA1 (綠 色）與中心體標記蛋白Y-TUBULIN(紫色）在有絲分裂期重合。DAPI染細胞核（紅色）。 標尺：20 μ m。圖3C為實時動態(tài)活體連續(xù)觀測細胞分裂圖；細胞核用H2B-RFP標記，顯示 SKA1在有絲分裂過程中位于中心體位置。標尺：20μπι。
[0020] 圖4A為對表達SKA1-GFP的人前列腺上皮細胞進行抗中心粒標志蛋白CENTRIN3 的免疫熒光染色圖。分裂間期以及有絲分裂期，SKA1-GFP(綠色）均與CENTRIN3(紅色） 共定位。同時，上皮細胞中不僅有正常數(shù)目的中心粒，還有多拷貝中心粒的出現(xiàn)。標尺， 2. 5 μ m。
[0021] 圖4B為多拷貝SKA1-GFP處于集合與分散兩種狀態(tài)下對其進行抗中心體蛋白 Y -TUBULIN，CEP135 和 CP110 的免疫熒光染色圖。轉(zhuǎn)染 SKA2-RFP 或 SKA3-RFP，檢測 SKA2、 SKA3是否與SKA1共定位。標尺，2. 5μπι。
[0022] 圖5Α為轉(zhuǎn)染GFP的對照細胞與SKA1-GFP細胞同步化進入中心粒復制的S期后， 進行抗中心粒標志蛋白CENTRIN3(紅色）的免疫熒光染色圖，統(tǒng)計細胞中< 4，= 4或> 4 個中心粒的數(shù)目（每組檢測細胞> 200個）。過表達SKA1-GFP后，RWPE1上皮細胞的中心 粒出現(xiàn)多拷貝復制，DU145前列腺癌細胞系中心粒多拷貝復制細胞的比例上升。內(nèi)嵌框內(nèi) 是放大的中心粒。標尺，20 μ m。
[0023] 圖5B為實時連續(xù)動態(tài)拍攝過表達SKA1的人前列腺上皮細胞中心粒復制的過 程圖。為檢驗復制的多拷貝SKA1-GFP是中心粒，對相應時間點的細胞固定后，進行抗 CENTRIN3的免疫熒光染色。內(nèi)嵌框內(nèi)是放大的圖像。標尺，20μπι。
[0024] 圖6Α為分別轉(zhuǎn)染了對照與干擾SKA1表達的siRNA序列的細胞同步化進入S期后， 固定并進行抗CENTRIN3的免疫熒光染色圖。
[0025] 圖6B為實時定量PCR檢測RWPE1細胞siRNA干擾24與48小時后，SKA1的相對 表達量圖。標尺，20 μ m。
[0026] 圖6C為RWPE1細胞siRNA分別干擾24小時與48小時后，細胞中心粒的數(shù)目圖； (每組檢測細胞> 200個）
[0027] 圖6D為實時定量PCR檢測DU145細胞siRNA干擾24與48小時后，SKA1的相對 表達量圖；
[0028] 圖6E為DU145細胞siRNA分別干擾24小時與48小時后，細胞中心粒的數(shù)目圖； (每組檢測細胞> 200個）
[0029] 圖7A為將過表達SKA1的前列腺上皮細胞與對照細胞進行抗中心體標記蛋白 Y -TUBULIN(綠色）的免疫熒光染色圖，細胞核用DAPI染色（紅色）。過表達SKA1后出現(xiàn) 多中心體細胞（箭頭）。對多中心體細胞計數(shù)后顯示，約有45%的前列腺上皮細胞在過表 達SKA1后出現(xiàn)多中心體，而幾乎所有（> 97% )轉(zhuǎn)染對照載體的上皮細胞為正常的1或2 個中心體。
[0030] 圖7B為裸鼠體重以及移植物的體積圖；將因過表達SKA1后出現(xiàn)多中心體的人前 列腺上皮細胞與對照細胞分別植入裸鼠皮下，從植入后1周起檢測裸鼠體重以及移植物的 體積。
[0031] 圖7C為將過表達SKA1的人前列腺細胞形成的移植團塊切片，H&E染色或進行抗 Ki67、SKAl、γ-TUBULIN的免疫染色圖。數(shù)字標記的圖片為對應上方圖片內(nèi)嵌框圖片的放 大。標尺：20 μ m。
[0032] 圖8A為將6例前列腺癌前病變與25例前列腺癌組織的切片進行抗中心體標記蛋 白Y-TUBULIN的免疫組織化學染色圖。為方便統(tǒng)計每個細胞中的中心體數(shù)目，細胞與細胞 之間的邊界用抗Pan-cadherin抗體染色。細胞核用DAPI染色。標尺：50μπι。d，20ym。
[0033] 圖8B為正常前列腺、上皮內(nèi)瘤（癌前病變）、以及不同惡性度的腫瘤組織樣本中多 中心體細胞所占平均比例圖。
[0034] 圖8C為SKA1的表達與前列腺癌前病變與腫瘤組織中多中心體細胞所占比例成正 相關(guān)示意圖，相關(guān)系數(shù)（r)為0.933。
[0035] 圖9為本發(fā)明的原理圖。

【具體實施方式】
[0036] 下面結(jié)合實施例來具體說明本發(fā)明。
[0037] 實施例1 :
[0038] 與正常前列腺組織相比，SKA1蛋白在前列腺癌前病變與癌組織中高表達：
[0039] 1、抗SKA1免疫組織化學染色：
[0040] 將6例新鮮前列腺癌前病變與25例癌組織石蠟包埋并切成5m切片。將不同組織 的切片按順序排列到一張載玻片上，進行免疫組織化學染色。具體操作方法為：
[0041] 1. 1 預處理：
[0042] 將新鮮前列腺癌前病變以及癌組織的石蠟切片60°C脫蠟1小時。3% H202 (Sigma， 7722-84-1)室溫25°C孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗3次， PBS(Invitrogen，14190250)浸泡 5 分鐘。
[0043] 1. 2抗原熱修復：
[0044] 將2000ml的0· 01M枸櫞酸鹽緩沖液（ρΗ6· 0)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。 切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時 (約加熱5?6分鐘后），計時2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥， 打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS沖洗2分鐘X 3次。
[0045] 所述的0. 01Μ枸櫞酸鹽緩沖液（ρΗ6. 0)的配制方法為：將3g枸櫞酸三鈉 (C6H5Na307 · 2H20)和 0· 4g 枸櫞酸（C6H807 · H20)溶于 1L 蒸餾水中。
[0046] 1. 3將抗原熱修復后的前列腺癌前病變以及癌組織進行免疫組化染色：
[0047] 10%正常山羊血清（PBS稀釋，Jackson Laboratory, 005-000-121)封閉，室溫孵育 10分鐘。傾去血清，滴加1 : 400比例稀釋的兔抗人SKA1-抗（Sigma，HPA045495)，4°C過 夜。PBS沖洗，5分鐘X 3次。滴加1 : 200比例稀釋的生物素標記羊抗兔二抗（1 % BSA-PBS 稀釋，Jackson Laboratory，111-065-144)，37°C孵育 30 分鐘；室溫孵育 2 小時。PBS 沖洗，5 分鐘X3次。滴加1 : 200比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋；Pierce，N200)， 37°C孵育30分鐘；PBS沖洗，5分鐘X3次。DAB辣根過氧化物顯色試劑盒顯色（Cloud-Clone Corp，USCNdab01)。自來水充分沖洗，蘇木素（Sigma，H3136)復染細胞核，指甲油封片。
[0048] 2、病理鑒定
[0049] 免疫組化后的結(jié)果根據(jù)SKA1-陽性染色所占的范圍以及染色強度進行評分，具體 如下：由2位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行雙盲閱片。SKA1染色陽性表達為細胞胞漿上呈現(xiàn)棕 黃色顆粒；采用半定量結(jié)果判斷，分別對鏡下陽性細胞的百分比和染色強度給予評分。1、陽 性著色細胞數(shù)：每張切片上觀察5個高倍視野（X 200)，計數(shù)陽性細胞百分比，陽性細胞數(shù) < 5%為0分，5%?25%為1分，26%?50%為2分，51 %?75%為3分，76%?100%為 4分。2、陽性著色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。3、兩者 計分相加得分為SKA1免疫組化陽性得分。
[0050] 如圖1A和1B顯示，SKA1蛋白在前列腺癌前病變（6例；p < 0. 0018)與癌組織（25 例；p < 0. 0001)中的表達顯著性地高于癌旁正常前列腺組織。SKA1蛋白在6例上皮內(nèi)瘤 (前列腺癌前病變）以及25例不同惡性度的前列腺腫瘤組織中（從高分化到低分化）的表 達呈強陽性（褐色），而在大部分正常前列腺組織中的表達呈弱陽性或接近陰性。
[0051] 3、實時定量PCR(QPCR)檢測SKA1的表達
[0052] 臨床手術(shù)電切的10例前列腺癌組織以及10例癌旁正常前列腺組織碾碎后， 用總RNA提取試劑盒提?。↖nvitrogen，IS10006)。總RNA的提取方法參照供應商的 說明書° RNA(0_5ug)用 Superscript First-Strand Synthesis System(Invitrogen, 11904018)反轉(zhuǎn)錄，特異性引物為SKA1 (上游引物5' ACATGAAATCCCGCTTAAC' 3,下 游引物 5' ACGAGTAAGTCCTCCCCCTC' 3 ;ΝΜ_001039535· 2)，內(nèi)參為 GAPDH(上游引物 5' GAGCCAAAAGGGTCATCATC' 3,下游引物 5' GTCAGGTCCACCACTGACAC' 3 ;ΝΜ_002046· 3)。PCR 擴增的條件為95°C預變性5分鐘，95°C變性15s，60°C退火15s，72°C延伸30s，35個循環(huán)。 擴增在 ABI7900QPCR 儀上進行（Applied Biosystems)。
[0053] 如圖1C所示，前列腺癌組織（10例）中SKA1基因的表達水平約是正常前列腺組 織（10例）的3至25倍。與正常前列腺組織相比，SKAlmRNA在10個前列腺癌標本中均高 表達，其表達可升高3至25倍。標尺：200 μ m。
[0054] 實施例2
[0055] 轉(zhuǎn)基因小鼠前列腺特異性過表達SKA1導致前列腺腫瘤的發(fā)生：
[0056] l、PSP94_Skal轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建：
[0057] 構(gòu)建含 3. 84kb PSP94 (prostatic secretory protein of94amino acid residues) 啟動子/增強子序列的質(zhì)粒，方法類似于專利"Generation of transgenic mouse models for the development of prostate cancer using regulatory regions of the psp94gene"（CA2396891A1，2003-2-38)，區(qū)別僅在于將小鼠 SkalcDNA 序列（NM_025581. 4) 替換原載體上的SV40T基因，構(gòu)建PSP94-Skal質(zhì)粒。顯微注射PSP94-Skal質(zhì)粒到 C57BL/6XCBA(JAX? Mice database, B6CBAF1/J-)的受精卵中。共 7 個轉(zhuǎn)基因系,每個轉(zhuǎn) 基因系8只小鼠，共生產(chǎn)56只PSP94-Skal小鼠。
[0058] 2、小鼠前列腺組織樣本石蠟包埋及切片
[0059] 將小鼠飼養(yǎng)至30-52周齡時，解剖老鼠，取前列腺。將前列腺組織放入10%的福 爾馬林溶液（Sigma，F(xiàn)8775)固定。24小時后，用流水沖洗組織30分鐘。隨后將組織置于 80%乙醇中60分鐘，1次；95 %乙醇60分鐘，2次，95 %乙醇60分鐘，1次；無水乙醇30分 鐘，3次。然后組織放在二甲苯20分鐘，3次。接下來組織放入軟蠟（熔點45-50°C)中60 分鐘；硬蠟（熔點56-58°C )中60分鐘；將浸蠟后的組織塊按切面朝下，用加熱的鑷子輕輕 夾取埋入含有熔蠟的包埋模具中。當蠟塊冷卻至蠟塊面出現(xiàn)一層透明蠟膜時，浸入冷水中 迅速冷卻。從包埋模具中取出包埋蠟塊，用刀片去除組織塊周圍多余石蠟，將包埋蠟塊修正 成為規(guī)則的正方形或長方形。15-20 μ m連續(xù)切片。
[0060] 3、H&E 染色
[0061] 3. 1預處理
[0062] 將56只PSP94_Skal轉(zhuǎn)基因小鼠及56只野生型小鼠的石蠟切片60°C脫蠟1小時。 二甲苯脫蠟10分鐘，3次。無水乙醇，5分鐘，兩次，95%乙醇5分鐘，兩次，85%乙醇，5分鐘 兩次，75%乙醇，5分鐘，1次；自來水洗，2分鐘，1次。
[0063] 3. 2 染色
[0064] 蘇木精染色5分鐘，自來水洗1分鐘，1 %鹽酸乙醇分化10秒，自來水洗1分鐘， 0. 2%氨水返藍30秒，自來水洗1分鐘，伊紅染色5分鐘，自來水速洗。
[0065] 3. 3脫水、透明、封固：
[0066] 80%乙醇20s ;90%乙醇20s ;95%乙醇3分鐘，兩次；無水乙醇5分鐘，兩次；二甲 苯5分鐘三次，中性樹膠封固。
[0067] 4、抗SKA1免疫組織化學染色，見實施例1的步驟1. 3。
[0068] 5、病理檢測：
[0069] 轉(zhuǎn)基因小鼠的病理檢測根據(jù) Animal Models of Human Prostate Cancer :The Consensus Report of the New York Meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee I ttmann M, Huang J, Radaelli E, et al. Cancer Res2013 ;73 :2718-2736的規(guī)則分別由兩個病理醫(yī)生完成。
[0070] 6、實驗結(jié)果
[0071] 前列腺特異性過表達SKA1蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生自發(fā)性前列腺腫瘤。如圖2A所 示，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠所用質(zhì)粒，用鼠源前列腺上皮特異性啟動子PSP94啟動小鼠 Skal基因 的表達。30周到52周，PSP94-Skal小鼠前列腺出現(xiàn)病變。如圖2B所示，H&E病理鑒定顯 示34% (19/56)的PSP94-Skal小鼠出現(xiàn)上皮內(nèi)瘤（癌前病變），21% (12/56)的小鼠出現(xiàn) 前列腺腫瘤，而野生型小鼠前列腺的病理檢測顯示完全正常。用抗SKA1蛋白的免疫組化驗 證了 SKA1在PSP94-Skal轉(zhuǎn)基因小鼠上皮內(nèi)瘤以及腫瘤組織中高表達，而在野生型正常小 鼠前列腺組織中表達較低或呈陰性。標尺：1〇 μ m。
[0072] 實施例3 :SKA1蛋白在中心體富集
[0073] 1、細胞培養(yǎng)：
[0074] STC-RWPE1 :RWPE-1前列腺上皮細胞系（由ATCC公司購買；ATCC ? CRL-11609?)。
[0075] STC-DU145 :DU145 前列腺腫瘤細胞系（由 ATCC 公司購買；ATCC? HTB-81?)。
[0076] STC-PC3 :PC-3 前列腺腫瘤細胞系（由 ATCC 公司購買；ATCC? CRL-1435?)。
[0077] STC-22RV1 :22Rvl 前列腺腫瘤細胞系（由 ATCC 公司購買：ATCC? CRL-2505?)。
[0078] STC-LnCap :LNCap 前列腺腫瘤細胞系（由 ATCC 公司購買：ATCC? CRL-1740?)。
[0079] N1培養(yǎng)基：前列腺上皮細胞系培養(yǎng)基，在DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco, 11330)中添加 5%胎牛血清（？133;1鮮;[1：1'08611，12664025)，111111^-谷氨醜胺（1^-611^3111；[116;1鮮;[1：1'(^611, 25030081)，1 % 膜島素 -轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium-X，ITS ;Gibco, 51500-056)，0· 4%牛垂體萃取精華（bovine pituitary extract, ΒΡΕ ;Hammond CellTech ; 1078_NZ)，5ng/ml 表皮生長因子（epidermal growthfactor，EGF;Sigma，E9644)和 lx 青霉 素 -鏈霉素（Penicillin-Streptomycin ;Invitrogen，15640055) 0
[0080] Cl培養(yǎng)基：前列腺腫瘤細胞培養(yǎng)基：在DMEM培養(yǎng)基（Gibco, 11965118)中添加 10 %胎牛血清、ImML-谷氨酰胺與lx青霉素 -鏈霉素。
[0081] STC-RWPE1 細胞在 N1 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，STC-DU145、STC-PC3、STC-22RV1、STC-LnCap 細胞在Cl培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有細胞在37°C，5% C02的條件下培養(yǎng)。
[0082] 2、慢病毒載體構(gòu)建、病毒包裝及細胞轉(zhuǎn)染：
[0083] a.慢病毒載體構(gòu)建：
[0084] Lenti-SKA1-GFP
[0085] (1) PCR 擴增 SKAlcDNA 片段
[0086] 以pIC291質(zhì)粒為模板（Addgene，51403)，PCR擴增SKAlcDNA片段（不含終止密碼 子，ΝΜ_001039535· 2)。擴增引物上游（含 BamHI 酶切位點）：5-ATCATCGGATCCGCCACCATGGCC TCGTCAGATCTGGAACAATTATGC-3,擴增引物下游（含 AscI 酶切位點）：5-ATCATCGGCGCGCCTTA CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG-3。PCR 擴增的條件為 95 °C 預變性 5 分鐘，95 °C 變性 30s，58 °C 退火30s，68°C延伸 lmin，35個循環(huán)。擴增在ABI7900QPCR儀上進行（Applied Biosystems)。
[0087] (2)電泳回收擴增片段
[0088] 回收片段按照大連寶生物工程有限公司膠回收試劑盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4· 0,9762)進行。
[0089] (3)用BamHI和AscI雙酶切步驟⑵得到的DNA片段
[0090] 酶切體系如下：DNA 片段（約 6〇ng/ μ 1)，10 μ 1 ;BamHI (New England Biolabs， R0136S)，1 μ 1 ;AscI (New England Biolabs，R0558S)，1 μ 1 ; 10 XBamHI 緩沖液（New England Biolabs，R0136S)，5y 1 ;(ΜΗ20,33μ 1 ;37°C酶切1小時后，電泳回收DNA片段，方法同步驟 ⑵。
[0091] (4)用 BamHI 和 AscI 雙酶切 pLenti6· 3/V5_DEST? 慢病毒載體（Invitrogen， K5330-00)
[0092] 酶切體系如下：PLenti6. 3/V5-DEST? 慢病毒載體（約 150ng/y 1)，6μ 1 ;BamHI， 1μ 1 ;AscI，ly 1 ;10XBamHI 緩沖液，5μ 1 ;(ΜΗ20,37μ 1 ;37°C 酶切 1 小時后電泳回收，電 泳回收DNA片段，方法同步驟（2)。
[0093] (5)將步驟⑶得到的目的片段DNA插入到步驟⑷回收的pLenti6. 3/V5-DEST? 慢病毒載體片段DNA中。
[0094] 連接體系如下：10XLigation 緩沖液（New England Biolabs，M0202S)，0· 5 μ 1 ;步 驟⑶回收的DNA片段3. 0μ 1，步驟（4)回收的載體DNA片段，1.0μ 1 ;T4DNA連接酶（10U/ μ 1 ;NewEnglandBiolabs，M0202S)，0.5y 1 ;16°C連接 2h。
[0095] (6)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞
[0096] 取_70°C凍存的100 μ 1 DH5a感受態(tài)大腸桿菌（天根生化科技北京有限公司， CB101)，于冰上解凍，加入10 μ L步驟（5)的連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min。42°C水浴熱 激90s。迅速置于冰上，冰浴5min，使細胞冷卻。在超凈臺上加入預冷的890 μ L的LB液體 培養(yǎng)基（Invitrogen，10855013)，混勻后于37°C，225rpm的條件下振蕩培養(yǎng)1. 5h。取50 μ 1 菌液涂于含Ampicillin的LB平板（Invitrogen，Q601-20)。37°C培養(yǎng)12h，可出現(xiàn)菌落。 [0097] (7)質(zhì)粒提取
[0098] 牙簽挑取單克隆菌落，將牙簽放入含Ampicillin (100 μ g/ml ;天根生化科技北京 有限公司，RT501)的 LB 液體培養(yǎng)基（Invitrogen，10855013)，37°C，250rpm 搖床，培養(yǎng) 16h。 菌液離心，4500印111，41€，3〇111；[11。菌液沉淀提取質(zhì)粒，由質(zhì)粒中抽試劑盒（(^31166116，12245) 完成。
[0099] H2B-RFP 慢病毒載體由 Addgen (22525)購買。
[0100] b.病毒包裝
[0101] 米用 ViraPower? Lentiviral Expression Systems (Invitrogen，K496000)。將 構(gòu)建的慢病毒載體與包裝系統(tǒng)中提供的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞293T(由購買的包裝系 統(tǒng)提供）。培養(yǎng)72小時，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。在Ultra-clear SW28離心管中加 入病毒上清液。超速離心機（Beckman SW28)，4°C，25,000rpm(82,700g)超速離心2小時。 200μ 1PBS溶解沉淀。
[0102] c.細胞轉(zhuǎn)染
[0103] 慢病毒轉(zhuǎn)染前18-24小時，將貼壁細胞以IX 105/孔鋪到24孔板中（Corning， 3337)。使細胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時的數(shù)量為2X105/孔左右。24小時后，加入500 μ 1病毒懸 液（含有6 μ g/ml polybrene ;包裝系統(tǒng)提供）。繼續(xù)培養(yǎng)24小時，用新鮮培養(yǎng)基替換含有 病毒的培養(yǎng)基。
[0104] 共構(gòu)建7株細胞系：
[0105] STC-N1 :SKA1-GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染 RWPE1 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP-RWPE1 細胞；
[0106] STC-D1 :SKA1-GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染 DU145 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP-DU145 細胞；
[0107] STC-P1 :SKA1-GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染 PC3 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP-PC3 細胞；
[0108] STC-R1 :SKA1-GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染 22RV1 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP-22RV1 細胞；
[0109] STC-L1 :SKA1-GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染 LnCap 細胞構(gòu)建 SKAl-GFP-LnCap 細胞；
[0110] STC-N1-H1 :SKA1-GFP 與 H2B-RFP 慢病毒共轉(zhuǎn)染 RWPE1 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP-RWPE1/ h2b-rfp 細胞；
[0111] STC-D1-H1 :SKA1-GFP 與 H2B-RFP 慢病毒共轉(zhuǎn)染 DU145 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP-DU145/ h2b-rfp 細胞；
[0112] 3、細胞同步化到有絲分裂期
[0113] 將步驟 2 中構(gòu)建的 STC-N1、STC-D1、STC-N1-H1、STC-D1-H1 細胞用含有 2mM thymidine (Sigma，T1895)的 N1 培養(yǎng)液（用于培養(yǎng) STC-N1、STC-N1-H1)、或含有 2mM thymidine的Cl培養(yǎng)液（用于培養(yǎng)STC-D1、STC-D1-H1)培養(yǎng)19小時后，換不含thymidine 的N1培養(yǎng)液（用于培養(yǎng)STC-N1、STC-N1-H1)或Cl培養(yǎng)液（用于培養(yǎng)STC-D1、STC-D1-H1) 培養(yǎng)9小時，再次用含有2mM thymidine的N1培養(yǎng)液（用于培養(yǎng)STC-N1、STC-N1-H1)、或 含有2mM thymidine的C1培養(yǎng)液（用于培養(yǎng)STC-D1、STC-D1-H1)培養(yǎng)16小時，換成不含 thymidine的N1培養(yǎng)液（用于培養(yǎng)STC-N1、STC-N1-H1)或C1培養(yǎng)液（用于培養(yǎng)STC-D1、 STC-D1-H1)繼續(xù)培養(yǎng)9小時后，細胞將同步化到有絲分裂期。
[0114] 4、細胞免疫熒光染色
[0115] 將步驟3中同步化到有絲分裂期的STC-N1細胞或STC-D1細胞從孵箱中取出。 用預溫的1XPBS洗3次，每次10分鐘。4%的甲醛室溫固定10分鐘。1XPBS洗3次，每 次5分鐘。0.5 % Triton X-100透化10分鐘。IXPBS洗3次，每次10分鐘。1 % BSA室 溫封閉30分鐘。加兔抗人￥-1'皿皿預(5丨81^，了3559，用1%8541:1000稀釋），放在濕 盒里,4°C過夜。1XPBS洗3次，每次10分鐘。加二抗AlexaFluor? 594-羊抗兔（Jackson ImmunoResearch，lll-585-003,用 1%BSA1 : 500 稀釋）閉光孵育 30 分鐘。1XPBS 洗 3 次，每次10分鐘。20μ1含DAPI封片劑封片（Vect〇r，H-1500)，指甲油固定。
[0116] 5、實時活體成像（Time-lapse imaging)
[0117] 將步驟3同步化的STC-N1-H1細胞或STC-D1-H1細胞進行實時活體成像觀察。 實時活體成像用共聚焦顯微鏡完成（TCS SP5II ;STED CW ;Leica，Solms，Germany)，成像在 37°C、5% C02、潮濕的封閉環(huán)境內(nèi)進行。用20x物鏡，每10分鐘一次獲取圖像，共記錄2小 時。
[0118] 6、數(shù)據(jù)分析
[0119] 將步驟 4 所得結(jié)果在共聚焦顯微鏡（TCS SP5II ;STED CW ;Leica，Solms，Germany) 下觀察、拍照，如圖3A所示。將步驟5的結(jié)果選取時間點作圖，如圖3B所示。
[0120] 7、實驗結(jié)果
[0121] 實驗結(jié)果表明，SKA1蛋白除有絲分裂期在紡錘絲與著絲粒結(jié)合處富集外，還在中 心體富集。如圖3B所示，將SKA1與綠色熒光蛋白（GFP)報告基因融合形成SKA1-GFP融合 蛋白，由GFP發(fā)出的綠色熒光指示SKA1蛋白的位置。用慢病毒載體攜帶SKA1-GFP轉(zhuǎn)染前 列腺正常上皮細胞（RWPE1)或前列腺癌細胞（DU145、PC3、22RVl、LnCap)后發(fā)現(xiàn)，與前期的 報道一致，從分裂前中期到分裂末期，SKA1蛋白位于紡錘體與著絲粒結(jié)合處。
[0122] 如圖3A所示，對SKA1-GFP細胞進行抗γ -TUBULIN的免疫熒光染色，SKA1 (綠色） 與中心體標記蛋白Y -TUBULIN(紫色）在分裂間期重合，DAPI染細胞核（藍色），如圖3B 所示，SKA1 (綠色）與中心體標記蛋白γ-TUBULIN(紫色）在有絲分裂期重合。DAPI染細 胞核（紅色）。抗中心體標記蛋白Y-TUBULIN (紫色）的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在有絲分裂間 期以及分裂期SKA1均在中心體富集。
[0123] 如圖3C所示，用H2B-RFP標記細胞核（紅色熒光），對細胞分裂進行實時動態(tài)活體 成像（Time-lapse imaging),如圖3C所示，顯示SKA1在有絲分裂過程中位于中心體位置， SKA1蛋白在有絲分裂的動態(tài)變化中仍然位于中心體，驗證了免疫熒光染色的結(jié)果。
[0124] 實施例4 :SKA1是中心粒的組成蛋白
[0125] 1、細胞培養(yǎng)
[0126] 同實施例3中步驟1
[0127] 2、慢病毒載體構(gòu)建，病毒包裝及細胞轉(zhuǎn)染
[0128] Lenti-SKA2_RFP 與 Lenti-SKA3_RFP 慢病毒載體構(gòu)建：
[0129] (1) PCR 擴增 SKA2 與 SKA3 的 cDNA 片段
[0130] 提取 STC-RWPE1 細胞的 mRNA，由 mRNA 提取試劑盒完成（Invitrogen，12173-011A) 將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，由cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成（Invitrogen，11752250)。并以此cDNA 為模板（STC-RWPEl-cDNA)，PCR擴增SKA2cDNA片段（不含終止密碼子，NM_182620. 3)，所用 上游引物為（含 BamHI 酶切位點）5' -ATCATCGGATCCGCCGCATTTGTGCTACTGTGAA-3' ；下游引 物為（含 AscI 酶切位點）5' -ATCATCGGCGCGCGCTCCAGGTCTGTTTGCTTCTG-3'，PCR 擴增的條 件為95°C預變性5分鐘，95°C變性30s，58°C退火30s，68°C延伸lmin，35個循環(huán)。擴增在 ABI7900QPCR 儀上進行（Applied Biosystems)。
[0131] 以STC-RWPEl-cDNA為模板，PCR擴增SKA3cDNA片段（不含終止密碼子， NM_145061. 5)，所用上游引物為（含 BamHI 酶切位點）：5'-ATCATCGGATCCATTAAAGCAGTGCCA CCCAGT-3';下游引物為（含AscI 酶切位點）5'-ATCATCGGCGCTTCTTTGTTGCTGACATCTCGGA-3'， PCR擴增的條件為95 °C預變性5分鐘，95 °C變性30s，58 °C退火30s，68 °C延伸lmin，35個循 環(huán)。擴增在 ABI7900QPCR 儀上進行（Applied Biosystems)。
[0132] (2-7)的步驟同實施例3步驟2a (2-7)。
[0133] 病毒包裝：同實施例3，步驟2
[0134] 細胞轉(zhuǎn)染：與實施例3,步驟2相似，僅慢病毒載體質(zhì)粒不同，共構(gòu)建4株細胞系：
[0135] STC-N2 :SKA1-GFP 慢病毒和 SKA2-RFP 慢病毒共轉(zhuǎn)染 RWPE1 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP/ SKA2-RFP-RWPE1 細胞
[0136] STC-N3 :SKA1-GFP 慢病毒和 SKA3-RFP 慢病毒共轉(zhuǎn)染 RWPE1 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP/ SKA3-RFP-RWPE1 細胞
[0137] STC-D2 :SKA1-GFP 慢病毒和 SKA2-RFP 慢病毒共轉(zhuǎn)染 DU145 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP/ SKA2-RFP-DU145 細胞
[0138] STC-D3 :SKA1-GFP 慢病毒和 SKA3-RFP 慢病毒共轉(zhuǎn)染 DU145 細胞構(gòu)建 SKA1-GFP/ SKA3-RFP-DU145 細胞
[0139] 3、細胞同步化到有絲分裂期
[0140] 將 STC-N1、STC-D1 細胞株以及步驟 2 中構(gòu)建的 STC-N2、STC-N3、STC-D2、STC-D3 細胞株同步化到有絲分裂期，方法同實施例3步驟3。
[0141] 4、細胞免疫熒光染色
[0142] 實驗步驟類似于實施例3中步驟4,區(qū)別在于所用抗體不同，本實施例中 所用抗體如下：一抗，小鼠抗人CENTRIN-3(Sigma，WH0001070M1 ;1 : 100)，小鼠 抗人 Y-TUBULIN(Sigma，T6557;l : 1000);兔抗人 CEP135(Sigma，SAB4503685; 1 : 200),驢抗人 CP110(Sigma, SAB2502023 ;1 : 200)。二抗，AiexaFluor? 594-羊 抗鼠 （Jackson ImmunoResearch, 111-585-003,1 : 500) ; AlexaF丨uor? 594-羊抗兔 (Jackson ImmunoResearch, 111-585-003 ;1 : 500) ; AlexaFluor? 594-驢抗羊（Jackson ImmunoResearch,705-585-147;l : 500)。
[0143] 5、數(shù)據(jù)分析
[0144] 步驟 4 的結(jié)果在共聚焦顯微鏡（TCS SP5II ;STED CW ;Leica，Solms，Germany)下觀 察、拍照，如圖4所示。
[0145] 6、實驗結(jié)果：
[0146] 中心體由中心粒與中心粒外周蛋白組成。通過抗中心粒標記蛋白Centrin-3的免 疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，SKA1在分裂間期以及分裂期皆與Centrin-3共定位（圖4A)，表明SKA1 是中心粒蛋白。通過免疫染色，我們同時發(fā)現(xiàn)有些前列腺上皮細胞中出現(xiàn)了多拷貝中心粒 (4個以上），表明這些細胞中心粒復制異常（圖4A)。為進一步驗證SKA1是中心粒蛋白， 用抗中心粒蛋白CEP135、CP110或周圍蛋白γ-TUBULIN的抗體進行免疫熒光染色。因中心 粒復制過程中母本與子代結(jié)合在一起，所以當發(fā)生多拷貝復制時，母與多個子代結(jié)合在一 起呈現(xiàn)花朵樣狀態(tài)，這種表型將維持于整個分裂期，直到下一細胞周期的G1期。細胞進入 G1期后，子代中心粒必須與母本分開成為獨立中心粒后才可進入下一輪復制。因此集合與 分散是標志復制與成熟的兩種重要形態(tài)，我們對這兩種狀態(tài)下的表型都進行了鑒定。轉(zhuǎn)染 SKA1-GFP的細胞無論是在集合或者分散狀態(tài)時都有多拷貝的表型。γ -TUBULIN免疫組織 熒光染色表明這些多拷貝的子代來自于同一個母本（圖4B)。另外，SKA1無論是呈集合或 者散開狀態(tài)時都與CEP135和CP110共定位（圖4B)，進一步表明SKA1是中心粒蛋白。為 證實這一結(jié)論，我們還將細胞分別轉(zhuǎn)染SKA2-RFP與SKA3-RFP的紅色熒光融合蛋白，發(fā)現(xiàn) SKA1-GFP與SKA2-RFP、SKA3-RFP共定位（圖4B)，表明SKA家族都是中心粒蛋白。
[0147] 實施例5 :SKA1的過表達引起中心粒的多拷貝復制
[0148] 1、細胞培養(yǎng)
[0149] 參照實施例3中步驟1。
[0150] 2、慢病毒載體構(gòu)建、病毒包裝及細胞轉(zhuǎn)染。
[0151] Lenti_PLK4慢病毒載體構(gòu)建：
[0152] (l)PCR 擴增 PLK4cDNA 片段
[0153] 以 pWZL Neo Myr Flag PLK4 質(zhì)粒（addgene，20522)為模板，PCR 擴增 PLK4 序列，所 用上游擴增引物（含 Hindlll 酶切位點）：5'-GACACAAGCTTGCGACCTGCATCGGGGAGAAGATCGAG GATT-3 ';下游擴增引物（含 XhoI 酶切位點）5 ' -TCATCCTCGAGTCAATGAAAATTAGGAGTCGGATTAG AAAACATCA-3 '。PCR擴增的條件為95 °C預變性5分鐘，95 °C變性30s，58 °C退火30s，68 °C延 伸 3min，24 個循環(huán)。擴增在 ABI7900QPCR 儀上進行（Applied Biosystems)。
[0154] (2)電泳回收擴增片段
[0155] 回收片段按照大連寶生物工程有限公司膠回收試劑盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4· 0,9762)進行。
[0156] (3)用HindllI和Xhol雙酶切步驟⑵得到的DNA片段
[0157] 酶切體系如下：DNA 片段（約 60ng/ μ 1)，10 μ 1 ;HindIII (New England Biolabs， R0104S)，1 μ 1 ;XhoI (New England Biolabs，R0558S)，1 μ 1 ; 10 XBamHI 緩沖液（New England Biolabs，R0146S)，5y 1 ;(ΜΗ20,33μ 1 ;37°C酶切1小時后，電泳回收DNA片段，方法同步驟 ⑵。
[0158] (4)用 Hindlll 和 Xhol 雙酶切 pLenti6. 3/V5-DEST? 慢病毒載體（Invitrogen， K5330-00)
[0159] 酶切體系如下：PLenti6. 3/V5-DEST? 慢病毒載體（約 150ng/ μ 1)，6 μ 1 ; Hindlll，1 μ 1 ;XhoI，1 μ 1 ;10XBamHI 緩沖液，5μ 1 ;(ΜΗ20,37μ 1 ;37°C酶切 1 小時后電泳 回收，電泳回收DNA片段，方法同步驟（2)。
[0160] (5)將步驟（3)得到的目的片段DNA插入到步驟（4)回收的pLenti6. 3/V5-DEST? 慢病毒載體片段DNA中。
[0161] 連接體系如下：10 X Ligation 緩沖液（New England Biolabs，M0202S)，0· 5 μ 1 ;步 驟⑶回收的DNA片段3. 0μ 1，步驟（4)回收的載體DNA片段，1.0μ 1 ;T4DNA連接酶（10U/ μ 1 ;NewEnglandBiolabs，M0202S)，0. 5μ 1 ;16°C連接 2h。
[0162] (6-7)的步驟同實施例3步驟2a (6-7)。
[0163] 病毒包裝：同實施例3，步驟2
[0164] 細胞轉(zhuǎn)染：與實施例3,步驟2相似，僅慢病毒載體質(zhì)粒不同，共構(gòu)建4株細胞系：
[0165] STC-N1-C1 :pLenti6. 3/V5-DEST? GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染 STC-RWPE1 細胞獲得 GFP-RWPE1 細胞
[0166] STC-D1-C1 :pLenti6. 3/V5-DEST? GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染 STC-DU145 細胞獲得 GFP-DU45 細胞
[0167] STC-N4 :Lenti-Plk4 慢病毒轉(zhuǎn)染 STC-RWPE1 細胞獲得 PLK4-RWPE1 細胞
[0168] STC-D4 :Lenti-Plk4 慢病毒轉(zhuǎn)染 STC-DU145 細胞獲得 PLK4-DU145 細胞
[0169] 3、細胞同步化到G1/S臨界點
[0170] 將 STC-N1、STC-D1、STC-N1-H1 及步驟 2 構(gòu)建的 STC-N1-C1、STC-N4、STC-D1-C1、 STC-D4用含有2mM thymidine的培養(yǎng)基培養(yǎng)19小時后，換為新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞9小時， 然后用含有400 μ M L-Mimosine (Sigma，M0253)的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞12小時后，換為新鮮培 養(yǎng)基，此時細胞已同步化到G1/S臨界點。
[0171] 4、細胞免疫熒光染色
[0172] 處理 1 :將步驟 3 中同步化到 G1/S 臨界點的 STC-N1、STC-N1-C1、STC-N4、STC-D1、 STC-D1-C1、STC-D4細胞繼續(xù)培養(yǎng)3小時后4%甲醛固定。
[0173] 處理2 :將步驟3中同步化到G1/S臨界點的STC-N1-H1細胞在剛換為新鮮培養(yǎng)基 (記錄為Oh)，以及繼續(xù)培養(yǎng)3小時，每隔1小時（取lh，2h，，3h) 4%甲醛固定。
[0174] 將處理1與處理2的細胞抗CENTRIN3細胞免疫熒光染色，步驟類似于實施 例3中步驟4。區(qū)別在于，所用的抗體不同，本實施例中所用的抗體：一抗，小鼠抗人 CENTRIN-3 (Sigma, WH0001070M1 ;1 : 1000);二抗，Alexa Fluor? 594-羊抗鼠 （Jackson ImmunoResearch,111-585-003,1 : 500)。
[0175] 5、實時活體成像（Time-lapse imaging)
[0176] 將步驟3中同步化到的STC-N1-H1細胞進行實時活體成像。實時活體成像用共聚 焦顯微鏡完成（TCS SP5II ;STED CW ;Leica，Solms，Germany)，成像在 37°C，5% C02，潮濕的 封閉環(huán)境內(nèi)進行。記錄中心粒復制，用60x油鏡，每20分鐘一次獲取圖像，記錄3小時。
[0177] 6、數(shù)據(jù)分析
[0178] 將步驟 4 的結(jié)果在共聚焦顯微鏡（TCS SP5II ;STED CW ;Leica，Solms，Germany)下 觀察、拍照；并統(tǒng)計 STC-N1、STC-N1-C1、STC-N4、STC-D1、STC-D1-C1、STC-D4 細胞中< 4,= 4或>4個中心粒的數(shù)目（每組檢測細胞> 200個）。統(tǒng)計結(jié)果以平均數(shù)加減方差的形式 呈現(xiàn)，數(shù)據(jù)分析用t檢驗。數(shù)據(jù)處理用PRISM軟件完成（6四?詘&(1，04，舊4)，如圖54所示。 將步驟5連續(xù)拍攝的圖像取時間點作圖，并將步驟4中STC-N1-H1細胞的結(jié)果在顯微鏡下 觀察、拍照，如圖5B所示。
[0179] 7、實驗結(jié)果
[0180] 為證明SKA1過表達能夠充分引起前列腺上皮細胞中心粒的多拷貝復制，本發(fā)明 將細胞同步化到G1/S臨界點，當換成新鮮細胞液培養(yǎng)后，細胞同步化進入S期，開始中心粒 的復制。轉(zhuǎn)染了對照質(zhì)粒的上皮細胞（>95%)進行正常的復制，復制后出現(xiàn)2對共4個 中心粒（圖5A)。過表達SKA1后，43. 3±5. 8%的上皮細胞復制后出現(xiàn)4個以上的中心粒 (圖5A)，表明過表達SKA1的中心粒進行多拷貝復制。本發(fā)明同時發(fā)現(xiàn)，SKA1引起中心粒多 拷貝復制的能力與PLK4(P〇l〇-like kinase4)磷酸激酶能力相當，后者已被證實能夠引起 中心粒的多拷貝復制。上述結(jié)果在DU145前列腺癌細胞系中也得到了驗證（圖5A)。為證 實多拷貝中心粒的出現(xiàn)是因在一次復制中一個母本復制多個子代引起，而不是多次復制導 致，本發(fā)明對過表達SKA1的前列腺上皮細胞中心粒復制的過程進行了實時動態(tài)連續(xù)拍攝。 結(jié)果表明，本來靜止于G1/S臨界點的細胞，一旦同步化進入S期，能夠在3小時內(nèi)（一個復 制周期）依靠一個母本合成多個子代中心粒（圖5B)。
[0181] 實施例6 :SKA1表達水平的降低阻礙中心粒的復制
[0182] 1、細胞培養(yǎng)，
[0183] 將STC-N1和STC-D1細胞參照實施例3中的步驟1進行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基為STC-N1 在N1培養(yǎng)基，STC-D1在C1培養(yǎng)基
[0184] 2、小RNA干擾（siRNA)序列的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：
[0185] 設計用于干擾SKA1表達的siRNA的序列：
[0186] SKA1-1 :5, -GGACUUACUCGUUAUGUUA-3,；
[0187] SKA1-2 :5 ' -UAUAGUGGAAGCUGACAUA-3，。
[0188] Contro1 :5，-GUGAUAGCUGUCUUAUACU-3，。
[0189] 將上述的SKA1-1與SKA1-2混合（1 : 1比例）轉(zhuǎn)染STC-N1或STC-D1細胞干擾 SKA1在STC-N1或STC-D1細胞中的表達。同時用control RNAi序列轉(zhuǎn)染STC-N1或STC-D1 細胞作為對照。siRNA轉(zhuǎn)染由Lipofectamine?RNAiMAX試劑盒（Invitrogen，13778)完成。
[0190] 3、將干擾了 SKA1表達的STC-NUSTC-D1細胞以及其相應的對照細胞進行G1/S臨 界點同步化處理，參照實施例5的步驟3。
[0191] 4、細胞免疫熒光染色
[0192] 將步驟3的細胞進行細胞免疫熒光染色。實驗步驟類似于實施例3中的步 驟4,區(qū)別在于所用抗體不同，本實施例中所用抗體：一抗，小鼠抗人CENTRIN-3(Sigma， WH0001070M1 ; 1 : 1000);二抗，Alexa Fluoi? 594-羊抗鼠 （Jackson ImmunoResearch, 111-585-003,1 ： 500) 〇
[0193] 5、實時定量PCR檢測細胞中SKA1的表達
[0194] 對步驟2中干擾后的細胞分別在24小時與48小時提取RNA，并進行SKA1表達水 平的檢測，步驟同實時例1中的步驟3。
[0195] 6、數(shù)據(jù)分析
[0196] 將步驟 4 的結(jié)果在共聚焦顯微鏡（TCS SP5II ;STED CW ;Leica，Solms，Germany)下 觀察、拍照，如圖6A所示。將步驟5的結(jié)果作圖，如圖6B、6D所示。將步驟3中同步化了的 細胞進行統(tǒng)計。統(tǒng)計細胞中<4, = 4或>4個中心粒的數(shù)目（每組檢測細胞> 200個）。 統(tǒng)計結(jié)果以平均數(shù)加減方差的形式呈現(xiàn)，數(shù)據(jù)分析用t檢驗。數(shù)據(jù)處理用PRISM軟件完成 (GraphPad，CA，USA)，如圖 6C、6E。
[0197] 7、實驗結(jié)果：
[0198] 分別轉(zhuǎn)染了對照與干擾SKA1表達的siRNA序列的細胞同步化進入S期后，固定并 進行抗CENTRIN3的免疫熒光染色，結(jié)果如圖6A所示。實時定量PCR檢測siRNA干擾24與 48小時后，SKA1的相對表達量，結(jié)果如圖6B和6D所示，siRNA分別干擾24小時與48小時 后，細胞中心粒的數(shù)目（每組檢測細胞> 200個）如圖6C和6E所示。
[0199] 如果細胞不斷進行細胞分裂，而細胞中的中心粒卻不能復制，勢必造成子代細胞 中心粒數(shù)目的減少。為證明SKA1是中心粒復制的重要調(diào)控蛋白，用小RNA (siRNA)干擾SKA1 的表達，檢測中心粒的數(shù)目。86. 7±3. 3%的對照細胞同步化進入S期后正常復制。siRNA 干擾SKA1的表達24小時后，有64.0±5. 1%的細胞不能正常復制（圖6A-圖6C);干擾48 小時后，有80±6. 3%的上皮細胞不能正常復制。同樣的，DU145腫瘤細胞內(nèi)中心粒的數(shù)目 也隨著干擾時間的延長而不斷減少（圖6D，圖6E)。以上實驗表明SKA1是一個重要的中心 粒蛋白，調(diào)控并且參與中心粒的復制。
[0200] 實施例7 :具有一定比例多中心體的人前列腺上皮細胞裸鼠皮下成瘤
[0201] 1、細胞培養(yǎng)，
[0202] 參照實施例3中的步驟1進行培養(yǎng)
[0203] 2、細胞免疫熒光染色：
[0204] 具體步驟參照實施例3中步驟4。
[0205] 3、免疫缺陷型小鼠皮下植瘤與鑒定：
[0206] 取24只雄性裸鼠（6-8周）麻醉后，皮下注射3x106STC_N1細胞，另取24只雄性裸 鼠（6-8周）麻醉后，皮下注射3x106STC-N1-C1細胞。每周檢測小鼠體重以及移植物體積， 游標卡尺記錄腫瘤的長與寬。
[0207] 根據(jù)公式：體積（V) = 0. 5a2x b2,其中a為長，b為寬。當小鼠皮下移植物體積達 約2cm3時，停止觀察。取移植物，浸泡在10 %福爾馬林過夜，常規(guī)方法制作厚度為5μπι的 組織切片，蘇木精-伊紅（Η&Ε)染色，由兩個不同的病理醫(yī)生進行病理診斷。所有流程經(jīng)過 上海交通大學小動物委員會允許后進行。
[0208] 4、將步驟3中的組織切片進行Η&Ε染色，具體步驟參照實施例2中的步驟2。
[0209] 5、將步驟3中的組織切片進行抗SKA1免疫組織化學染色，具體步驟參照實施例1 中的步驟1。
[0210] 6、將步驟3中的組織切片進行抗Ki67免疫組織化學染色，實驗步驟類似于實施例 1中的步驟1，區(qū)別在于所使用的抗體不同，抗Ki67免疫組織化學染色中使用：一抗，兔抗人 Ki67(Epitomics，4203-1 ;1 : 200)，二抗，1 : 200比例稀釋的生物素標記羊抗兔二抗（1 % BSA-PBS 稀釋，Jackson Laboratory，111-065-144)。
[0211] 7、將步驟3中的組織切片進行抗γ-TUBULIN免疫組織熒光染色，具體步驟為：
[0212] a.預處理
[0213] 將石蠟切片在60°C脫蠟1小時。二甲苯脫蠟10分鐘，3次。無水乙醇，5分鐘，兩 次；95%乙醇5分鐘，兩次；85%乙醇，5分鐘，兩次；75%乙醇，5分鐘，1次；自來水洗，2分 鐘，1次。
[0214] b.染色：
[0215] 將預處理后的組織在4%的甲醛室溫固定15分鐘。1XPBS洗3次，每次5分鐘。 0· 5% TritonX-100透化10分鐘。1XPBS洗3次，每次10分鐘。1% BSA室溫封閉1小時。 將小鼠抗人Y-TUBULIN單克隆抗體（Sigma，T6557,用1%BSA1 : 200稀釋）加到載玻片 上，放在濕盒里,4°C過夜。1XPBS洗3次，每次15分鐘,加二抗AlexaFluor? 488-羊抗小鼠 (Jackson ImmunoResearch，115-545-003,用 1%BSA1 : 200 稀釋）加到載玻片上，閉光孵 育2小時。1XPBS洗3次，每次15分鐘。用20μ1含DAPI封片劑封片（Vector，H-1500)， 指甲油固定。
[0216] 8、數(shù)據(jù)分析
[0217] 將步驟 2 所得結(jié)果在共聚焦顯微鏡（TCS SP5II ;STED CW ;Leica，Solms，Germany) 觀察、拍照。統(tǒng)計細胞中<2, = 2或>2個中心體的數(shù)目（每組檢測細胞> 200個）。統(tǒng) 計結(jié)果以平均數(shù)加減方差的形式呈現(xiàn)，數(shù)據(jù)分析用t檢驗。數(shù)據(jù)處理用PRISM軟件完成 (GraphPad，CA，USA)，如圖7A所示。對步驟3所得結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析和處理，結(jié)果都以平均 數(shù)加減方差的形式呈現(xiàn)，數(shù)據(jù)分析用t檢驗。數(shù)據(jù)處理用PRISM軟件完成（GraphPad，CA， USA)，如圖7B所示。在顯微鏡下觀察步驟4-7的染色結(jié)果，如圖7C所示。
[0218] 9、實驗結(jié)果：
[0219] 過表達SKA1后的人前列腺上皮細胞出現(xiàn)中心粒的多拷貝復制，那么這些多拷貝 的中心粒能否結(jié)合中心粒外周蛋白形成多個獨立的中心體？本發(fā)明對細胞進行抗中心體 標記蛋白Y-TUBULIN的免疫熒光染色，并統(tǒng)計多中心體細胞的比例。實驗表明SKA1過表 達導致前列腺上皮細胞中心體的擴繁，約45%的前列腺上皮細胞在過表達SKA1后產(chǎn)生多 中心體，而對照前列腺上皮細胞則具有正常的1或2個中心體（圖7A)。為檢測一定比例的 人前列腺上皮細胞獲得多中心體后能否轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞，本發(fā)明將過表達SKA1后出現(xiàn)多 中心體的上皮細胞與對照細胞分別植入裸鼠皮下。4周后，過表達SKA1的上皮細胞形成腫 瘤樣團塊，而植入的對照細胞在9周觀察期內(nèi)并未生成任何團塊（圖7B)。將移植物取出 后進行H&E染色與病理鑒定，發(fā)現(xiàn)這些細胞的核質(zhì)比顯著增大，ki67免疫組化證實細胞分 裂旺盛，呈典型的腫瘤細胞特征（圖7C)?？筍KA1的免疫組化染色驗證了這些細胞高表達 SKA1 (圖7C)。γ -TUBULIN染色證實了由這些上皮細胞轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞存在多中心體（圖 7C)。以上實驗表明過表達SKA1可導致人前列腺上皮細胞出現(xiàn)一定比例的多中心體，繼而 誘導前列腺上皮細胞向癌細胞的轉(zhuǎn)化。
[0220] 實施例8 :
[0221] 取6例前列腺癌前病變、25例前列腺癌組織以及25例癌旁正常前列腺組織的石蠟 切片，進行以下實驗，證明SKA1的過表達與臨床標本中多中心體的出現(xiàn)呈正相關(guān)。
[0222] 1、將6例前列腺癌前病變、25例前列腺癌組織以及25例正常前列腺組織的石蠟切 片進行H&E染色，具體步驟參照實施例2的步驟2。
[0223] 2、將6例前列腺癌前病變、25例前列腺癌組織以及25例正常前列腺組織的石蠟切 片進行抗SKA1免疫組織染色，具體步驟參照實施例1的步驟1。
[0224] 3、將6例前列腺癌前病變、25例前列腺癌組織以及25例正常前列腺組織的石蠟切 片進行抗Y -TUBULIN與Pan-cadherin免疫組織熒光雙染，具體步驟如下：
[0225] a.預處理：
[0226] 將石蠟切片在60°C脫蠟1小時。二甲苯脫蠟10分鐘，3次。無水乙醇，5分鐘，兩 次；95%乙醇5分鐘，兩次；85%乙醇，5分鐘，兩次；75%乙醇，5分鐘，1次；自來水洗，2分 鐘，1次。
[0227] b.染色：
[0228] 將預處理所得的前列腺癌前病變、前列腺癌組織、正常前列腺組織分別用4%的 甲醛室溫固定15分鐘。1XPBS洗3次，每次5分鐘。0. 5%TritonX-100透化10分鐘。 1XPBS洗3次，每次10分鐘。1% BSA室溫封閉1小時。將小鼠抗人γ-TUBULIN單克隆抗 體（3丨811^，16557，用1(%13341:100稀釋）與兔抗人？311-〇3(11161'；[11出。;[1:0111；^8,2019-1;用 1%BSA1 : 200稀釋）混和加到載玻片上，放在濕盒里，4°C過夜。1XPBS洗3次，每次15 分鐘，加二抗 AlexaFhior? 488-羊抗小鼠 （Jackson ImmunoResearch, 115-545-003,用 1 % BSA1 : 200 稀釋）與 AlexaFluor? 594-羊抗兔（Jackson ImmunoResearch, 111-585-003, 用1% BSA1 : 200稀釋）混合加到載玻片上，閉光孵育2小時。1XPBS洗3次，每次15分 鐘。20μ1含DAPI封片劑封片（Vector，H-1500)，指甲油固定。
[0229] 4、病理鑒定
[0230] 將步驟2免疫組化后的結(jié)果根據(jù)SKA1-陽性染色所占的范圍以及染色強度進行評 分，具體如下：由2位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行雙盲閱片。SKA1染色陽性表達為細胞胞漿上 呈現(xiàn)棕黃色顆粒；采用半定量結(jié)果判斷，分別對鏡下陽性細胞的百分比和染色強度給予評 分。1、陽性著色細胞數(shù)：每張切片上觀察5個高倍視野（X200)，計數(shù)陽性細胞百分比，陽 性細胞數(shù)< 5%為0分，5%?25%為1分，26%?50%為2分，51 %?75%為3分，76%? 100%為4分。2、陽性著色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。 3、兩者計分相加得分為SKA1免疫組化陽性得分。
[0231] 5、中心體數(shù)目檢測
[0232] 將步驟3染色后的結(jié)果在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計每個組織中具有多中心體（3個以及 3個以上γ -TUBULIN陽性的點）細胞的數(shù)目，并且計算每個組織中多中心體細胞占的比例。
[0233] 6、將步驟1、2、3的結(jié)果在顯微鏡下拍照，如圖8A所示。將步驟5的結(jié)果以平均數(shù) 加減方差的形式呈現(xiàn)，Kruskal-Wallis檢驗，如圖8B所示。將步驟4與步驟5所得結(jié)果用 珀松相關(guān)分析檢驗法進行相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)處理用PRISM軟件完成（GraphPad，CA，USA)， 結(jié)果如圖8C所不。
[0234] 7、實驗結(jié)果：
[0235] 為檢測SKA1的過表達是否與臨床前列腺癌細胞中多中心體的出現(xiàn)相關(guān)，本發(fā)明 將6例前列腺癌前病變與25例前列腺癌組織的切片進行抗中心體標記蛋白γ -TUBULIN 的免疫組織化學染色。為方便統(tǒng)計每個細胞中的中心體數(shù)目，細胞與細胞之間的邊界用抗 Pan-Cadherin抗體染色（圖5A)。實驗表明前列腺腫瘤組織的分化程度越高，腫瘤組織中 多中心體細胞所占比例越大（圖5B)。更為重要的是，SKA1的表達與前列腺癌前病變以及 腫瘤組織中多中心體細胞出現(xiàn)的比例成正相關(guān)（圖5C)。上述實驗證明SKA1的表達水平與 臨床前列腺癌細胞中多中心體的出現(xiàn)正向相關(guān)。
[0001] __序列表 <uo>上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 <120>SKA1蛋白：前列腺S早期篩杏與診斷的靶標分子 - <160> 15 <210> 1 <211> ?9 <212> DNA <213> A# C Homo sapiens sp.) <400> 1 acatgaaatc ccgcttaac <210>2 <2ll>20 <212>DNA <213> Aft (Homo sapiens sp.) <400> 2 acgagtaagt cctccccctc <210>3 <211>20 <212> DNA <213> 人種（Homo sapiens sp.) <400>3 gagccaaaag ggtcatcatc <210 4 <2U> 20 <2I2>DNA <213> A# (Homo sapiens sp.) <400> 4 gjca^tcca ccactgacac
[0002] <210>5 <21I>48 <212>DNA <213>人工序列 <400>5 atcatcggat ccgccaccat ggcctcgtca gatctggaac aattatgc <210>6 <211>43 <212>DNA <213>人工序列 <400> 6 Atcatcggc-g cgccttactl gtacageteg teeatgeega gag <210>7 <211>34 <212> DNA <213>人丄序列 <400>7 atcatcggat ccgccgcatt tgtgctactg tgaa <210>8 <211>35 <212> DNA <213>人工序列 <400> 8 atcatcggcg cgcgctccag gtctgtttgc ttctg <210>9 <211>33
[0003] <212> DNA <213>人工序列 <400> 9 atcatcggat ccattaa^c agtgccaccc agt <2iO> 10 <2!1>34 <212> DMA <213>人1:序到 <>10 atcatcggcg cttctttgtt gctgacatct cgga <210> 11 <21I>42 <212> DNA <2〗3>人_￡序列 <400> 11 Gacacaagct tgcgacctgc ateggggaga agalcgagga tt <2!0> 12 <211>46 <212> DMA <213>人工序列 <400> 12 tcaKxtcga gtcaatgaaa attigagtc ggattagaaa acatea <210> 13 <211>19 <212> RNA <213>入工序列
[0004] <400>13 ggacuuacuc guuauguua . <210> 14 <211>19 <212> RNA <213>人工序賣 <400> 14 uauapiggaa gcugacaua <210> 15 <2!!>19 <2I2>RNA <213>人:[:序列 <400> 15 gugauagcug ucuuauacu
【權(quán)利要求】
1. SKA1蛋白在作為靶標分子在制備前列腺癌早期篩查與診斷試劑中的應用。
2. 用于檢測SKA1蛋白的試劑在制備前列腺癌早期篩查與診斷試劑盒中的應用。
3. -種前列腺癌早期篩查與診斷試劑盒，其特征在于，包含用于檢測SKA1蛋白表達水 平的試劑。
4. 如權(quán)利要求3所述的前列腺癌早期篩查與診斷試劑盒，其特征在于，所述的用于檢 測SKA1蛋白表達水平的試劑為兔抗人SKA1抗體。
【文檔編號】G01N33/68GK104062434SQ201410191538
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】高維強, 宣建武, 李佳 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院