一種檢測人血清中痕量免疫球蛋白g濃度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測人血清中痕量免疫球蛋白G濃度的方法。以羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記的異硫菁酸熒光素作為能量轉(zhuǎn)移的給體,納米金作為受體,構(gòu)成性能穩(wěn)定的能量轉(zhuǎn)移體系,羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記的異硫菁酸熒光素將能量傳遞給納米金,使其熒光發(fā)生猝滅。而免疫球蛋白G加入后卻使異硫菁酸熒光素的熒光恢復(fù),且其熒光恢復(fù)值與免疫球蛋白G的濃度在4.0~220.0納克/毫升范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,從而建立檢測人免疫球蛋白G的新方法。本發(fā)明克服了已有技術(shù)在檢測時存在靈敏度低、操作繁瑣等缺點,對于人血清中免疫球蛋白G的檢測更加方便快速。
【專利說明】一種檢測人血清中痕量免疫球蛋白G濃度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用異硫菁酸熒光素與納米金能量轉(zhuǎn)移技術(shù)速檢測人血清中痕量免疫球蛋白G濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫球蛋白G是血清中含量最高的一種免疫蛋白,約占血清免疫蛋白的70%~80%,是機(jī)體再次免疫應(yīng)答后形成抗體的主要組分,在機(jī)體防御機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用,在臨床上作為多種疾病診斷及療效評價的重要指標(biāo),因此其定性、定量檢測十分重要。目前,國內(nèi)外檢測人免疫球蛋白G的主要方法有酶聯(lián)免疫法,電壓免疫傳感技術(shù),電化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù),熒光傳感技術(shù),紫外吸收光度法等。以上方法有的操作復(fù)雜,有的靈敏度不高。因此,尋求一種快速、準(zhǔn)確、高選擇性的方法檢測人血清中免疫球蛋白G具有重要的意義。能量轉(zhuǎn)移技術(shù)是一種新型熒光檢測技術(shù),具有靈敏度高,與常規(guī)熒光法和共振光散射法相比受瑞利散射光干擾小等特點。同時,本文利用免疫球蛋白G與納米金對羊抗人免疫球蛋白G標(biāo)記的異硫菁酸熒光素的競爭作用,只需要標(biāo)記熒光給體,而省卻了標(biāo)記受體的操作,節(jié)省了藥品。本方法利用其獨特的檢測特性,從而建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測免疫球蛋白G的新方法。目前國內(nèi)外應(yīng)用異硫菁酸熒光素與納米金能量轉(zhuǎn)移法在免疫球蛋白G的檢測上尚未見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種方法簡單,靈敏度高,選擇性好,方便快速的檢測人血清中痕量免疫球蛋白G濃度 的方法。
[0004]本發(fā)明的思路:以羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記的異硫菁酸熒光素作為能量轉(zhuǎn)移的給體,納米金作為受體,構(gòu)成性能穩(wěn)定的能量轉(zhuǎn)移體系,羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記的異硫菁酸熒光素將能量傳遞給納米金,使其熒光發(fā)生猝滅。而免疫球蛋白G加入后卻使異硫菁酸熒光素的熒光恢復(fù),且其熒光恢復(fù)值與免疫球蛋白G的濃度在4.0~220.0納克/毫升范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,從而建立檢測人免疫球蛋白G的新方法。
[0005]本發(fā)明的具體機(jī)理:羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記的異硫菁酸熒光素與納米金發(fā)生能量轉(zhuǎn)移使其自身的熒光發(fā)生猝滅。能量轉(zhuǎn)移速率與給體,受體間的距離有關(guān),免疫球蛋白G的加入可與異硫菁酸熒光素上的羊抗人免疫球蛋白G抗體發(fā)生抗原抗體特異性免疫反應(yīng),使得納米金與異硫菁酸熒光素之間的距離更遠(yuǎn),能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象受到抑制,使得羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記的異硫菁酸熒光素的熒光有規(guī)律恢復(fù)。
[0006]具體步驟為:
(I)納米金溶液的制備:
將5毫升5毫摩爾/升氯金酸加入到100毫升亞沸水中,在不斷攪拌下加熱至沸,然后快速加入5毫升質(zhì)量體積濃度為0.1%的檸檬酸溶液,保持沸騰10分鐘,溶液的顏色逐漸變成酒紅色,停止加熱,在10000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心10分鐘,除去過量的檸檬酸,即制得濃度為50納摩爾/升的納米金溶液,在4°C的條件下保存,備用。
[0007](2)羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液的制備:
將20毫升1.0X 10_5摩爾/升異硫菁酸熒光素,100微升20毫克/毫升的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和100微升10毫克/毫升的N-羥基丁二酰亞胺在室溫下混合攪拌0.5小時,再加入100微升I毫克/毫升羊抗人免疫球蛋白G抗體,在室溫下孵化2小時,最后在10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘,除去多余的抗體,即制得羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液,在4 °C的條件下保存,備用。
[0008](3)配制溶液:
分別將50微升步驟(2)制備的羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液,800 微升步驟(1)制備的納米金溶液和 0、2.0,5.0,10.0,20.0,30.0,50.0,70.0,110.0 微升1.0X 10_5克/毫升的免疫球蛋白G加入到9支5毫升色管中,用pH = 7.4的緩沖溶液定容至刻度,反應(yīng)10分鐘;所述pH = 7.4的緩沖溶液含有0.05摩爾/升的磷酸氫二鈉和
0.05摩爾/升的磷酸二氫鈉。
[0009](4)工作曲線的繪制:
將步驟(3)制得的溶液分別用RF-5301 PC熒光光度計進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測,激發(fā)波長為480納米,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5納米;根據(jù)測量結(jié)果,免疫球蛋白G的濃度c在
4.0^220納克/毫升范圍內(nèi)與熒光恢復(fù)值A(chǔ)If呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為:AIf= 9.52+1.68c,線性相關(guān)系數(shù) r = 0.9987。
[0010](5)人血清中免疫球蛋白G的檢測:
a.將待測人血清樣品用50毫摩爾/升的磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍作為待測溶液。
[0011]b.分別將50微升步驟(2)制備的羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液,800微升步驟(1)制備的納米金溶液和步驟(5)第a步制備的待測溶液加入5毫升色管中,用PH = 7.4的緩沖溶液定容至刻度,反應(yīng)10分鐘;用RF-5301 PC熒光光度計在激發(fā)波長為480納米,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5納米的條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測,測得熒光恢復(fù)量AIf,根據(jù)步驟(4)所得的線性回歸方程,即算出免疫球蛋白G的濃度c ;所述pH =
7.4的緩沖溶液含有0.05摩爾/升的磷酸氫二鈉和0.05摩爾/升的磷酸二氫鈉。
[0012]本發(fā)明方法克服了已有技術(shù)在檢測時存在反應(yīng)時間長、操作繁瑣、靈敏度低、等缺點,更好地提高了靈敏度和選擇性,對于人血清中免疫球蛋白G的檢測更加準(zhǔn)確方便快速。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明中不同濃度的免疫球蛋白G對異硫菁酸熒光素的熒光恢復(fù)譜圖。
[0014]圖中a 到 j 分別為 0,2.0,5.0,10.0,20.0,30.0,50.0,70.0,110.0 微升 1.0Χ10-5
克/毫升的免疫球蛋白G在5毫升比色管中定容至刻度后對異硫菁酸熒光素的熒光恢復(fù)光譜圖。
[0015]圖2為本發(fā)明中免疫球蛋白G的濃度c與異硫菁酸熒光素-納米金能量轉(zhuǎn)移體系中異硫菁酸熒光素的熒光恢復(fù)量的關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0016]實施例:(I)納米金溶液的制備:
將5毫升5毫摩爾/升氯金酸加入到100毫升亞沸水中,在不斷攪拌下加熱至沸,然后快速加入5毫升質(zhì)量體積濃度為0.1%的檸檬酸溶液,保持沸騰10分鐘,溶液的顏色逐漸變成酒紅色,停止加熱,在10000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心10分鐘,除去過量的檸檬酸,即制得濃度為50納摩爾/升的納米金溶液,在4°C的條件下保存,備用。
[0017](2)羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液的制備:
將20毫升1.0X 10_5摩爾/升異硫菁酸熒光素,100微升20毫克/毫升的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和100微升10毫克/毫升的N-羥基丁二酰亞胺在室溫下混合攪拌0.5小時,再加入100微升I毫克/毫升羊抗人免疫球蛋白G抗體,在室溫下孵化2小時,最后在10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘,除去多余的抗體,即制得羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液,在4 °C的條件下保存,備用。
[0018](3)配制溶液:
分別將50微升步驟(2)制備的羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液,800 微升步驟(1)制備的納米金溶液和 0、2.0,5.0,10.0,20.0,30.0,50.0,70.0,110.0 微升1.0X 10_5克/毫升的免疫球蛋白G加入到9支5毫升色管中,用pH = 7.4的緩沖溶液定容至刻度,反應(yīng)10分鐘;所述pH = 7.4的緩沖溶液含有0.05摩爾/升的磷酸氫二鈉和
0.05摩爾/升的磷酸二氫鈉。
[0019](4)工作曲線的 繪制:
將步驟(3)制得的溶液分別用RF-5301 PC熒光光度計進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測,激發(fā)波長為480納米,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5納米;根據(jù)測量結(jié)果,免疫球蛋白G的濃度c在
4.0^220納克/毫升范圍內(nèi)與熒光恢復(fù)值A(chǔ)If呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為:AIf= 9.52+1.68c,線性相關(guān)系數(shù) r = 0.9987。
[0020](5)人血清中免疫球蛋白G含量的檢測:
a.將從桂林理工大學(xué)校醫(yī)院獲取的待測人血清樣品用50毫摩爾/升的磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍作為待測溶液。
[0021]b.將步驟(5)第a步制得的待測溶液按本發(fā)明的方法定容并進(jìn)行測定,同時進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收試驗,結(jié)果如表1所示,其RSD ( 2.86%(n=6),加標(biāo)回收率在98.7%~105.0%,說明本發(fā)明方法具有較高的準(zhǔn)確度和較好的精密度。
[0022]1:樣品測定和加標(biāo)-收試驗數(shù)—___
【權(quán)利要求】
1.一種檢測人血清中痕量免疫球蛋白G濃度的方法,其特征在于具體步驟為: (1)納米金溶液的制備: 將5毫升5毫摩爾/升氯金酸加入到100毫升亞沸水中,在不斷攪拌下加熱至沸,然后快速加入5毫升質(zhì)量體積濃度為0.1%的檸檬酸溶液,保持沸騰10分鐘,溶液的顏色逐漸變成酒紅色,停止加熱,在10000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心10分鐘,除去過量的檸檬酸,即制得濃度為50納摩爾/升的納米金溶液,在4°C的條件下保存,備用; (2)羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液的制備: 將20毫升1.0X 10_5摩爾/升異硫菁酸熒光素,100微升20毫克/毫升的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和100微升10毫克/毫升的N-羥基丁二酰亞胺在室溫下混合攪拌0.5小時,再加入100微升I毫克/毫升羊抗人免疫球蛋白G抗體,在室溫下孵化2小時,最后在10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘,除去多余的抗體,即制得羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液,在4 °C的條件下保存,備用; (3)配制溶液: 分別將50微升步驟(2)制備的羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液,800 微升步驟(1)制備的納米金溶液和 0、2.0,5.0,10.0,20.0,30.0,50.0,70.0,110.0 微升1.0X 10_5克/毫升的免疫球蛋白G加入到9支5毫升色管中,用pH = 7.4的緩沖溶液定容至刻度,反應(yīng)10分鐘;所述pH = 7.4的緩沖溶液含有0.05摩爾/升的磷酸氫二鈉和0.05摩爾/升的磷酸二氫鈉; (4)工作曲線的繪制: 將步驟(3)制得的溶液分別用RF-5301 PC熒光光度計進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測,激發(fā)波長為480納米,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5納米;根據(jù)測量結(jié)果,免疫球蛋白G的濃度c在4.0^220納克/毫升范圍內(nèi)與熒光恢復(fù)值A(chǔ)If呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為:Δ If= 9.52+1.68c,線性相關(guān)系數(shù) r = 0.9987 ; (5)人血清中免疫球蛋白G的檢測: a.將待測人血清樣品用50毫摩爾/升的磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍作為待測溶液; b.分別將50微升步驟(2)制備的羊抗人免疫球蛋白G抗體標(biāo)記異硫菁酸熒光素溶液,800微升步驟(1)制備的納米金溶液和步驟(5)第a步制備的待測溶液加入5毫升色管中,用pH = 7.4的緩沖溶液定容至刻度,反應(yīng)10分鐘;用RF-5301 PC熒光光度計在激發(fā)波長為480納米,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5納米的條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測,測得熒光恢復(fù)量Λ If,根據(jù)步驟(4)所得的線性回歸方程,即算出免疫球蛋白G的濃度c ;所述pH = 7.4的緩沖溶液含有0.05摩爾/升的磷酸氫二鈉和0.05摩爾/升的磷酸二氫鈉。
【文檔編號】G01N33/68GK103969446SQ201410195006
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月11日
【發(fā)明者】陶慧林, 廖秀芬, 徐銘澤, 謝襄漓, 鐘福新, 易忠勝 申請人:桂林理工大學(xué)