基于金納米粒子-多肽團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于金納米粒子-多肽復(fù)合物團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法，屬于光學(xué)傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。它先將蛋白激酶對應(yīng)的底物多肽通過半胱氨酸的巰基連接到金納米粒子表面，制備金納米粒子-多肽復(fù)合物；在蛋白激酶和三磷酸腺苷的作用下，多肽的絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，當(dāng)有Zr4+存在時，Zr4+與多肽的磷酸基團(tuán)之間發(fā)生多重螯合作用，使得金納米粒子-多肽復(fù)合物團(tuán)聚，導(dǎo)致金納米粒子-多肽復(fù)合物的紫外吸收減小和共振光散射峰增大。蛋白激酶的濃度越大，多肽上產(chǎn)生的磷酸化位點(diǎn)越多，金納米粒子-多肽復(fù)合物的聚集就越明顯，金納米粒子的紫外吸收峰越小，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)激酶及其抑制劑的高靈敏檢測。
【專利說明】基于金納米粒子-多肽團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于金納米粒子-多肽團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法，屬于光學(xué)傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)的磷酸化是人體內(nèi)翻譯后修飾的重要過程，在新陳代謝及細(xì)胞間信息傳導(dǎo)等方面起著重要的作用，異常的磷酸化反應(yīng)會導(dǎo)致多種疾病。至今，一些相關(guān)的研究表明人體的一些重大疾病如白血病，阿茨海默癥，甚至是癌癥等都與相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化異常表達(dá)有關(guān)。磷酸化反應(yīng)的產(chǎn)生是由于蛋白質(zhì)激酶催化蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化，因此快速、靈敏地識別蛋白質(zhì)激酶的活性一直是生物學(xué)科中一個重要的研究課題，它不僅有助于研究細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的分子機(jī)制，也在一些重大疾病的早期診斷和藥物研發(fā)中起著十分重要的作用。
[0003]金納米粒子(AuNPs)是一種金屬納米粒子。近年來的研究表明金納米粒子除了具有納米粒子的性質(zhì)外，還具有熒光、超分子與分子識別等特性。因此，在生物分析和臨床診斷方面，AuNPs常常作為第一選擇用來進(jìn)行相關(guān)的免疫標(biāo)記，這是由于AuNPs當(dāng)遇到目標(biāo)物質(zhì)時會產(chǎn)生相應(yīng)的顏色變化，從而引起金納米粒子紫外吸收的變化，實(shí)現(xiàn)分析檢測。利用AuNPs的團(tuán)聚反應(yīng)檢測 蛋白激酶的活性，為分析檢測蛋白激酶提供了一種簡單、靈敏、有效的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供了一種基于AuNPs -多肽團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法。
[0005]本發(fā)明是這樣來實(shí)現(xiàn)的，首先合成AuNPs，采用渦旋偶聯(lián)的方法將蛋白激酶對應(yīng)的底物多肽連接于AuNPs表面，再通過構(gòu)建磷酸化反使AuNPs表面的多肽帶有磷酸基團(tuán)，利用磷酸基團(tuán)與Zr4+離子之間的多重螯合作用誘導(dǎo)AuNPs發(fā)生團(tuán)聚，通過紫外吸收峰的減弱以及共振光散射峰的增強(qiáng)，建立了一種基于AuNPs -多肽團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法。
[0006]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
(1)AuNPs的制備:將50mL 0.05 g/L的HAuCl4.4H20在磁力攪拌下加熱煮沸，再快速加入I mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5%的檸檬酸鈉溶液，溶液顏色由黃色變成深酒紅色后，持續(xù)沸騰5分鐘，即合成了單分散的AuNPs;
(2)AuNPs-多肽復(fù)合物的制備:將I mg牛血清蛋白、I mL的AuNPs溶液和10 μ L 500μ M多肽混合，在渦旋儀上旋轉(zhuǎn)10分鐘，4 °C下反應(yīng)12小時后，在15000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去除上層清液，將沉淀重懸于ImL濃度為35 mM、pH為7.5的Ifepes緩沖溶液中，制備成AuNPs-多肽復(fù)合物；
(3)AuNPs-多肽的磷酸化:將50μ L的AuNPs-多肽復(fù)合物、30 μ L 500 U/mL蛋白激酶A (PKA)、20 μ L I mM三磷酸腺苷(ATP)和100 μ L超純水混合，在37 °C孵育2小時，制得AuNPs-磷酸化多肽復(fù)合物；
(4)PKA及其抑制劑檢測:將20 μ L的AuNPs-磷酸化多肽復(fù)合物、330 μ L超純水和50μ L 0.8 mM的Zr4+溶液混合，在Zr4+的誘導(dǎo)作用下，AuNPs-多肽復(fù)合物發(fā)生團(tuán)聚，隨著PKA濃度的增加，AuNPs的紫外吸收減小，PKA的濃度在1.2-9.4 U/mL范圍內(nèi)與AuNPs的紫外吸收強(qiáng)度呈線性關(guān)系，檢測限為0.4 U/mL。AuNPs的光散射強(qiáng)度隨著PKA抑制劑鞣花酸濃度的增加而降低，當(dāng)鞣花酸濃度為15 μ M時，光散射強(qiáng)度降到最低，表明隨著鞣花酸濃度的增加，鞣花酸抑制了 PKA的活性，使得PKA催化多肽磷酸化反應(yīng)的能力下降，AuNPs-多肽發(fā)生磷酸化的程度降低，計(jì)算得到的鞣花酸的半抑制濃度為4.02 μ M0
[0007]本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明利用Zr4+與磷酸基團(tuán)之間的螯合作用，在PKA和ATP的作用下，誘導(dǎo)AuNPs-磷酸化多肽復(fù)合物發(fā)生團(tuán)聚，使得AuNPs的紫外吸收峰下降和共振光散射峰增強(qiáng)，構(gòu)建了一種基于AuNPs-多肽復(fù)合物團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法，該方法具有靈敏度高、檢測限低和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1是基于AuNPs-多肽復(fù)合物團(tuán)聚效應(yīng)的PKA檢測原理圖。
[0009]圖2 是(A) AuNPs 和(B) AuNPs-多肽在加入 75 U/mL PKA+100 μ M ATP 發(fā)生磷酸化反應(yīng)后再加入0.1 mM Zr4+，(C)AuNPs-多肽中加入4.02 μ M鞣花酸，再加入75 U/mL ΡΚΑ+100μ M ΑΤΡ+0.1 mM Zr4+反應(yīng)后的透射電鏡圖。 [0010]圖3是(a) AuNPs和(b) AuNPs-多肽復(fù)合物的紫外-可見吸收光譜圖。
[0011]圖4是AuNPs-多肽復(fù)合物中(a)不加PKA和(b)加75 U/mL PKA，再分別加入100μΜΑΤΡ，0.1 mMZr4+反應(yīng)后的紫外-可見吸收光譜圖。內(nèi)插圖:分別與(a)和(b)對應(yīng)的照片。
[0012]圖5 是(A)在 AuNPs-多肽中加入不同濃度 PKA (a~g:1.2，2.3，4.7，9.4，18.6，37.5，75 U/mL),再分別加入100 μ M ΑΤΡ+0.1 mM Zr4+發(fā)生團(tuán)聚反應(yīng)的紫外-可見吸收光譜圖。(B)是吸光度-PKA濃度曲線。
[0013]圖6是(A) AuNPs-多肽復(fù)合物團(tuán)聚的共振光散射光譜圖:PKA濃度分別為0，1.2，2.3,4.7,9.4,18.6,37.5,75 U/mL, ATP 濃度為 100 μ Μ, Zr4+ 濃度為 0.1 mM。(B)共振光散射強(qiáng)度-PKA濃度曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1
(1)AuNPs的制備:將50mL 0.05 g/L的HAuCl4.4H20在磁力攪拌下加熱煮沸，再快速加入I mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5%的檸檬酸鈉溶液，溶液顏色由黃色變成深酒紅色后，持續(xù)沸騰5分鐘，即合成了單分散的AuNPs;
(2)AuNPs-多肽復(fù)合物的制備:將I mg牛血清蛋白、I mL的AuNPs溶液和10 μ L 500μ M多肽混合，在渦旋儀上旋轉(zhuǎn)10分鐘，4 °C下反應(yīng)12小時后，在15000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去除上層清液，將沉淀重懸于ImL濃度為35 mM、pH為7.5的Ifepes緩沖溶液中，制備成AuNPs-多肽復(fù)合物；(3)AuNPs-多肽的磷酸化:將50 μ L的AuNPs-多肽復(fù)合物、30 μ L 500 U/mL的PKA、20μ L I mM的ATP和100 μ L超純水混合，在37 °C孵育2小時，制得AuNPs-磷酸化多肽復(fù)合物。
[0015]采用透射電鏡對AuNPs和AuNPs-多肽復(fù)合物的形貌進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。由圖2A可見，AuNPs的平均粒徑約為13 nm ;在AuNPs-多肽復(fù)合物中加入PKA和ATP催化多肽的磷酸化反應(yīng)，再加入Zr4+誘導(dǎo)AuNPs-多肽復(fù)合物發(fā)生團(tuán)聚(圖2B);當(dāng)AuNPs-多肽復(fù)合物和鞣花酸預(yù)先混合，再加入PKA、ATP和Zr4+時，鞣花酸抑制了 PKA的活性，使得AuNPs-多肽復(fù)合物的磷酸化程度降低，故而AuNPs-多肽復(fù)合物仍然保持較好的分散狀態(tài)(圖2C)。
[0016]采用紫外-可見吸收光譜對合成的AuNPs以及PKA對應(yīng)的底物多肽在AuNPs表面的組裝，結(jié)果如圖3所示。AuNPs在523 nm處有一個紫外吸收峰；當(dāng)PKA識別的底物多肽LRRASLGGGGC通過端位半胱氨酸的巰基以金-巰鍵形式連接于AuNPs表面時，AuNPs-多肽復(fù)合物的吸收峰紅移了 5 nm，表明PKA識別的底物多肽連接到了 AuNPs表面，成功制備了AuNPs-多肽復(fù)合物。
[0017]實(shí)施例2
采用紫外-可見吸收光譜對AuNPs-多肽復(fù)合物的團(tuán)聚現(xiàn)象進(jìn)行表征(圖4)。合成的AuNPs-多肽復(fù)合物有良好的紫外吸收峰(曲線a);在PKA和ATP的作用下，AuNPs-多肽復(fù)合物表面的絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，加入的Zr4+與AuNPs-磷酸化多肽的絲氨酸位點(diǎn)的磷酸基團(tuán)發(fā)生多重螯合作用，使得AuNPs-多肽復(fù)合物發(fā)生團(tuán)聚，AuNPs的紫外吸收峰減小(曲線b)。AuNPs-多肽復(fù)合物長時間放置后溶液的顏色保持酒紅色不變(a)，表明本發(fā)明制備的AuNPs-多肽復(fù)合物具有良好的穩(wěn)定性；而在AuNPs-多肽復(fù)合物中加入PKA和ATP反應(yīng)后，再加入Zr4+時，溶液的顏色從酒紅色變成藍(lán)色，并在管底產(chǎn)生沉淀(b)，表明AuNPs-多肽復(fù)合物的團(tuán)聚是由于PKA和A TP對多肽的磷酸化反應(yīng)所致。
[0018]PKA及其抑制劑檢測:檢測原理如圖1所示，將AuNPs-磷酸化多肽復(fù)合物與Zr4+溶液混合，在Zr4+的誘導(dǎo)作用下，AuNPs-多肽復(fù)合物發(fā)生團(tuán)聚，隨著PKA濃度的增加，AuNPs的紫外吸收峰減小，PKA的濃度在1.2-9.4 U/mL范圍內(nèi)與AuNPs的紫外吸收強(qiáng)度呈線性關(guān)系，檢測限為0.4 U/mL,結(jié)果如圖5所示。本發(fā)明方法是基于Zr4+誘導(dǎo)AuNPs-磷酸化多肽復(fù)合物的團(tuán)聚反應(yīng)來檢測PKA活性，所以，AuNPs之間距離的改變將導(dǎo)致共振光散射的變化，利用AuNPs共振光散射峰的增強(qiáng)也可檢測PKA的活性，結(jié)果如圖6A所示。以AuNPs-多肽復(fù)合物加入Zr4+的共振光散射峰強(qiáng)度為對照，向AuNPs-多肽復(fù)合物中加入不同濃度的PKA發(fā)生磷酸化反應(yīng)，再加入Zr4+，測量共振光散射峰；隨著PKA濃度的增加，共振光散射峰以相似的峰形逐漸增大，表明AuNPs-多肽復(fù)合物的團(tuán)聚程度隨著PKA濃度的增大而增大，由圖6B可見，共振光散射峰的強(qiáng)度與PKA濃度在1.2-9.4 U/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限為0.38 U/mL。采用共振光散射法檢測PKA的靈敏度可與紫外吸收光譜法相媲美，進(jìn)而表明共振光散射法可用于生物樣品中蛋白激酶活性的分析。
[0019]本研究以鞣花酸為例采用共振光散射法對PKA的抑制劑進(jìn)行篩選。先將PKA與不同濃度的鞣花酸混合，再加入AuNPs-多肽復(fù)合物和ATP，反應(yīng)2小時，再向該混合溶液中加入Zr4+，隨后檢測共振光散射峰強(qiáng)度變化。當(dāng)鞣花酸濃度為O時的共振光散射強(qiáng)度較強(qiáng)，而隨著鞣花酸濃度的增加，共振光散射強(qiáng)度逐漸降低。這是由于隨著鞣花酸濃度的增加，鞣花酸抑制了 PKA的活性，使得PKA催化多肽發(fā)生磷酸化反應(yīng)的能力降低，AuNPs-多肽表面的磷酸基團(tuán)減少，表明鞣花酸對PKA活性具有良好的抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.基于金納米粒子-多肽團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法，其特征在于蛋白激酶及其抑制劑檢測:將金納米粒子-磷酸化多肽復(fù)合物與Zr4+溶液混合，在Zr4+的誘導(dǎo)作用下，金納米粒子-磷酸化多肽復(fù)合物發(fā)生團(tuán)聚，隨著蛋白激酶濃度的增加，金納米粒子的紫外吸收峰減小，共振光散射強(qiáng)度增大，蛋白激酶活性與金納米粒子的紫外吸收強(qiáng)度呈正相關(guān)，而與共振光散射強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，實(shí)現(xiàn)了對蛋白激酶活性的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金納米粒子-多肽團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法，其特征在于所述金納米粒子-磷酸化多肽復(fù)合物制備步驟如下: (1)金納米粒子的制備:將50mL 0.05 g/L的HAuCl4.4H20在磁力攪拌下加熱煮沸，再快速加入I mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5%的檸檬酸鈉溶液，溶液顏色由黃色變成深酒紅色后，持續(xù)沸騰5分鐘，即合成了單分散的金納米粒子； (2)金納米粒子-多肽復(fù)合物的制備:將Img牛血清蛋白、I mL金納米粒子溶液和10μ L 500 μ M多肽混合，在渦旋儀上旋轉(zhuǎn)10分鐘，4 °C下反應(yīng)12小時后，在15000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去除上層清液，將沉淀重懸于ImL濃度為35 mM、pH為7.5的Ifepes緩沖溶液中，制備成金納米粒子-多肽復(fù)合物； (3)金納米粒子-多肽的磷酸化:將50UL金納米粒子-多肽復(fù)合物、30 μ L 500 U/mL蛋白激酶、20 μ L I mM三磷酸腺苷和100 μ L超純水混合，在37 °C孵育2小時，制得金納米粒子-磷酸化多肽復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于金納米粒子-多肽團(tuán)聚效應(yīng)的蛋白激酶及其抑制劑檢測方法，其特征在于:金納米粒子的光散射強(qiáng)度隨著蛋白激酶抑制劑鞣花酸濃度的增加而降低，這是由于隨 著鞣花酸濃度的增加，鞣花酸抑制了蛋白激酶的活性，使得蛋白激酶催化多肽磷酸化反應(yīng)的能力下降，金納米粒子-多肽復(fù)合物發(fā)生磷酸化的程度降低，表明鞣花酸對蛋白激酶活性有良好的抑制作用。
【文檔編號】G01N21/33GK104020120SQ201410196470
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】邱建丁, 王瑩, 張立, 梁汝萍 申請人:南昌大學(xué)