一種檢測生物大分子或微生物體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測生物大分子或微生物體的方法。所述方法包括如下步驟：使用生物大分子或微生物體的抗體包被的單分散超順納米磁珠與待檢測樣品接觸進行孵育反應(yīng)，生成多顆粒的超順納米磁珠團簇；反應(yīng)后進行磁分離得到聚集物，根據(jù)所述聚集物的聚集程度確定待檢測樣品中生物大分子或微生物體的濃度。本發(fā)明的方法將免疫磁富集與可視化檢測集于一體，操作簡單，整個檢測過程所需時間短，不需要特殊的儀器設(shè)備，而且本發(fā)明的方法對抗體的純度要求不高，可以大大降低檢測成本。
【專利說明】一種檢測生物大分子或微生物體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫檢測分析【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種快速、靈敏和低成本的可視化檢測生物大分子或微生物體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳染性動植物致病菌、病毒以及臨床樣品中的蛋白質(zhì)等生物標志物的快速、靈敏、低成本的檢測和診斷對保護人類健康及生命安全、保障環(huán)境和國家安全、維護社會穩(wěn)定具有重要意義。目前比較成熟的檢測方法主要包括分離培養(yǎng)檢測、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)等方法。分離培養(yǎng)方法簡單、易行，但由于其檢測靈敏度低、耗時長，無法達到現(xiàn)場、快速的要求。免疫學(xué)方法主要包括酶聯(lián)免疫分析和免疫層析試紙條的方法，酶聯(lián)免疫方法具有簡單、靈敏度比較高、成本低等優(yōu)點，適合于大規(guī)模樣品篩查，但其需要多步洗滌，比較耗時耗力，因此其使用也受到一定的限制。膠體金免疫層析試紙條具有快速、簡單、低成本等優(yōu)點，但其靈敏度相對比較低，不能實現(xiàn)定量檢測。分子生物學(xué)方法主要是基于PCR的分析方法，具有檢測靈敏度高，特異性好等優(yōu)點，但需要昂貴的儀器和較高的專業(yè)技術(shù)人員操作，其應(yīng)用受到一定的限制。因此，構(gòu)建一種適合現(xiàn)場、快速、高靈敏和個性化診斷的分析方法，實現(xiàn)對環(huán)境、食品和生物樣品中致病菌、病毒和蛋白質(zhì)的檢測具有重要的意義。
[0003]超順納米磁珠具有飽和磁性強、單分散性好、粒徑可控和多元顏色等優(yōu)異的磁學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，因此基于超順納米磁珠的免疫磁性分離技術(shù)具有免疫反應(yīng)的高度特異性和磁性分離的快速、簡單和高效的優(yōu)點，是目前應(yīng)用最廣泛的分離、富集技術(shù)，近幾年已被廣泛地應(yīng)用于致病菌、病毒、蛋白、腫瘤細胞等生物大分子或微生物體的分離和富集。在免疫磁富集反應(yīng)中，免疫磁珠和目標物的識別是在懸浮溶液中進行的，是一種均相的免疫反應(yīng)模式，有利于抗體-抗原的充分反應(yīng)，可以加快反應(yīng)的速度，因此可以與其它很多技術(shù)結(jié)合起來，構(gòu)建一系列新型的分析方法，例如磁分離-熒光免疫分析方法、磁分離-化學(xué)發(fā)光分析方法、富集-微流控芯片技術(shù)、磁分離-表面等離子共振生物傳感器、磁富集-石英晶微天平生物傳感器等方法。由于免疫磁分離技術(shù)的發(fā)展，大大促進了相關(guān)分析技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用潛力正在不斷地發(fā)掘出來。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，我們對免疫磁珠檢測進行深入研究，發(fā)現(xiàn)通過免疫反應(yīng)形成的多顆粒的超順納米磁珠團簇與單分散超順納米磁珠在磁場中的聚集狀態(tài)不同，并且免疫超順納米磁珠的聚集程度與樣品中的目標物的含量呈正相關(guān)性。
[0005]因此，本發(fā)明的目的在于提供一種快速、靈敏和低成本的可視化檢測生物大分子或微生物體的方法，所述方法中免疫超順納米磁珠既作為磁分離、富集的載體；同時由于其具有顏色，并且多顆粒的超順納米磁珠團簇與單分散超順納米磁珠在磁場中聚集程度不同，可作為可視化的信號報告標志，將免疫反應(yīng)中的磁分離、富集和檢測集于一步完成，實現(xiàn)對樣品中目標物的快速、靈敏地檢測。[0006]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0007]—種檢測生物大分子或微生物體的方法，包括如下步驟:使用生物大分子或微生物體的抗體包被的單分散超順納米磁珠與待檢測樣品接觸進行孵育反應(yīng)，生成多顆粒的超順納米磁珠團簇；反應(yīng)后進行磁分離得到聚集物，根據(jù)所述聚集物的聚集程度確定待檢測樣品中生物大分子或微生物體的濃度。
[0008]在超順納米磁珠的表面偶聯(lián)上相應(yīng)生物大分子或微生物體的抗體，制備成免疫超順納米磁珠。在免疫反應(yīng)中，生物大分子或微生物體具有多個抗原決定簇，通過抗體-抗原之間的特異性識別，可以連接多個單分散性的免疫超順納米磁珠。單分散性的免疫超順納米磁珠通過這種抗原的“橋梁”連接作用，變成團簇狀的多顆粒的超順納米磁珠團簇。然后在外加磁場的作用下，變成聚集態(tài)的多顆粒超順納米磁珠團簇(聚集物)，由于單分散超順納米磁珠與聚集的多顆粒超順納米磁珠在磁場中的分散狀態(tài)不同，導(dǎo)致聚集程度不同，并且單分散性的免疫超順納米磁珠的聚集程度與樣品中目標物(生物大分子或微生物體)的含量正相關(guān)，基于此，可以根據(jù)聚集物的聚集程度確定待檢測樣品中生物大分子或微生物體的濃度，從而構(gòu)建檢測生物大分子或微生物體的可視化分析方法。
[0009]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述聚集物的聚集程度與所述生物大分子或微生物體的濃度呈正相關(guān)。所述生物大分子或微生物體的濃度越高，則所述聚集物的顏色越深；因此可以預(yù)先使用標準樣品構(gòu)建生物大分子或微生物體的濃度與聚集物的聚集程度之間的曲線關(guān)系圖，根據(jù)該曲線關(guān)系圖可以確定一個特定顏色深度所對應(yīng)的生物大分子或微生物體的濃度，實現(xiàn)樣品中生物大分子或微生物體的濃度定量確定。
[0010]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸和多糖，優(yōu)選蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)、核酸和多糖都可能有相應(yīng)的抗原表位，供相應(yīng)抗體結(jié)合，實現(xiàn)多顆粒的超順納米磁珠團簇的生成，因此均可作為本發(fā)明的生物大分子檢測對象。
[0011]優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)包括脂蛋白、糖蛋白、核蛋白和生物標志物。
[0012]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述微生物體包括細菌、真菌和病毒。由于細菌、真菌和病毒表面的蛋白具有抗原表位，能夠與相應(yīng)抗體結(jié)合，實現(xiàn)多顆粒的超順納米磁珠團簇的生成，因此均可作為本發(fā)明的微生物體檢測對象。上述微生物體可以是致病菌或非致病菌，但是本發(fā)明排除疾病診斷的情況。
[0013]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述待檢測樣品為環(huán)境、生物或食品來源的樣品。來源于環(huán)境的樣品比如可以是來源于污染水體的樣品，其中含有待檢測的生物大分子或微生物體，通過使用本發(fā)明的方法，對這些物質(zhì)進行定量，實現(xiàn)污染狀況的評估。來源于食品的樣品比如可以是來源于人工加工的熟食或包裝食品的樣品，其中含有待檢測的生物大分子或微生物體，通過使用本發(fā)明的方法，對這些物質(zhì)進行定量，實現(xiàn)食品安全評估。
[0014]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述抗體為單克隆抗體和/或多克隆抗體，優(yōu)選多克隆抗體。由于待檢測樣品中的生物大分子或微生物體表面可能具有多個抗原決定簇，在有相同或相似抗原決定簇的情況下使用單克隆抗體也能夠?qū)崿F(xiàn)“橋梁”連接作用；多克隆抗體由于具有各種抗原決定簇的結(jié)合位點，能夠很容易實現(xiàn)“橋梁”連接作用。毫無疑問，本發(fā)明也可以使用單克隆抗體和多克隆抗體的混合，并且本發(fā)明對單克隆抗體的純度要求不高，即使含有雜質(zhì)，對于本發(fā)明的影響也可以忽略。
[0015]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述生物大分子或微生物體具有多個抗原決定簇。同一生物大分子或微生物體的多個抗原決定簇分別與不同免疫超順納米磁珠表面的抗體結(jié)合，實現(xiàn)“橋梁”連接作用，生成超順納米磁珠團簇。
[0016]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述孵育反應(yīng)時間為5-60min,例如5min、6min、lOmin、12min、15min、20min、25min、30min、40min、45min、50min、55min、58min、10_40min、10-30min、5_20min、15_30min,優(yōu)選 15min。
[0017]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述磁分離的時間為0.5-5min,例如0.5min、lmin、
1.5min、2min、2.5min、3min、4min、4.5min、4.8min,優(yōu)選 lmin。
[0018]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，根據(jù)所述聚集物的聚集程度確定待檢測樣品中生物大分子或微生物體的濃度，具體為:
[0019]獲取所述聚集物的照片，通過對照片灰度值進行定量來確定待檢測樣品中生物大分子或微生物體的濃度。
[0020]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:
[0021]本發(fā)明的檢測生物大分子或微生物體的方法，基于超順納米磁珠的優(yōu)異磁學(xué)和光學(xué)性能，將免疫磁富集與可視化檢測集于一體，操作簡單，整個檢測過程所需時間短，不需要特殊的儀器設(shè)備，只需要一種抗體，避免了傳統(tǒng)的免疫檢測對兩種抗體(捕獲抗體和檢測抗體)的需要，而且本發(fā)明的方法對抗體的純度要求不高，可以大大降低檢測成本。此夕卜，本發(fā)明的方法具有普遍適用性，可以檢測細菌、真菌、病毒和蛋白質(zhì)等，適合現(xiàn)場檢測，具有很大的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明的基于免疫超順納米磁珠聚集的可視化方法檢測生物大分子或微生物體的反應(yīng)原理示意圖。其中，(I)表示單分散免疫超順納米磁珠與樣品中的生物大分子或微生物體之間的免疫反應(yīng)；(2)表示通過抗原的“橋梁”作用形成的多顆粒的免疫超順納米磁珠團簇；(3)表示多顆粒的免疫超順納米磁珠團簇在外加磁場的作用下，形成聚集的免疫超順納米磁珠聚集物；樣品中目標物(生物大分子或微生物體)越多，免疫超順納米磁珠的聚集程度就越大,其顏色就越深。
[0023]圖2為本發(fā)明的免疫超順納米磁珠磁聚集的機理圖。其中，(a)表示免疫超順納米磁珠與樣品混合在一起，反應(yīng)15min之后，沒有外加磁場下的狀態(tài)圖；(b)表示免疫超順納米磁珠與樣品混合在一起，反應(yīng)15min之后,在磁場下的狀態(tài)圖；(c)表不將外加磁場去掉，將聚集狀態(tài)的免疫超順納米磁珠重懸，然后放在沒有外加磁場的試管架上，所述免疫超順納米磁珠在重力單獨作用下的狀態(tài)圖。數(shù)字表示生物大分子或微生物體的濃度(cfu/mL)。
[0024]圖3為本發(fā)明的方法檢測大腸桿菌的結(jié)果圖。其中，(a)表示免疫超順納米磁珠與大腸桿菌樣品混合在一起，反應(yīng)之后，在磁場下的狀態(tài)圖；樣品中大腸桿菌濃度(cfu/mL)越高，免疫超順納米磁珠的聚集程度就越大，其顏色就越深；(b)表示聚集物照片灰度值與樣品中大腸桿菌濃度梯度(圖中1-6分別表示大腸桿菌濃度ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、104、103、0cfu/mL)的關(guān)系圖；大腸桿菌濃度越高，灰度值越大。
[0025]圖4為本發(fā)明的方法檢測胎癌蛋白(CEA)的結(jié)果圖。其中，(a)表示免疫超順納米磁珠與CEA樣品混合在一起，反應(yīng)之后，在磁場下的狀態(tài)圖；樣品中CEA濃度(ng/mL)越高，免疫超順納米磁珠的聚集程度就越大，其顏色就越深；(b)表示聚集物照片灰度值與樣品中CEA濃度(ng/mL)的關(guān)系圖；CEA濃度越高，灰度值越大。
[0026]圖5為本發(fā)明的方法檢測甲胎蛋白(AFP)的結(jié)果圖。其中1-6分別表示AFP濃度分別為40、20、10、5、2.5和Ong/mL的樣品與免疫超順納米磁珠混合在一起，反應(yīng)之后，在磁場下的狀態(tài)圖；樣品中AFP濃度(ng/mL)越高，免疫超順納米磁珠的聚集程度就越大，其顏色就越深。
【具體實施方式】
[0027]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，以下實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0028]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。
[0029]本發(fā)明的反應(yīng)原理示意圖如圖1所示，(I)表示單分散免疫超順納米磁珠與樣品中的生物大分子或微生物體之間的免疫反應(yīng)；(2)表示通過抗原的“橋梁”作用形成的多顆粒的免疫超順納米磁珠團簇；(3)表示多顆粒的免疫超順納米磁珠團簇在外加磁場的作用下，形成聚集的免疫超順納米磁珠聚集物；樣品中目標物(生物大分子或微生物體)越多，免疫超順納米磁珠的聚集程度就越大，其顏色就越深。
[0030]下列實施例中所用的試劑儀器設(shè)備來源如下:大腸桿菌購自美國菌種保存中心，大腸桿菌抗體(多抗)購自美國Genway ;甲胎蛋白、胎癌蛋白及其相關(guān)抗體購自北京熱景生物技術(shù)有限公司；磁分離架購自上海奧潤微納新材料有限公司；渦流振蕩器購自德國IKA公司。
[0031]實施例1
[0032]免疫超順納米磁珠的制備和磁聚集可視化免疫檢測，具體步驟如下:
[0033](I)免疫超順納米磁珠的制備:
[0034]將一定量的表面修飾有羧基的超順納米磁珠(0.2-0.5mg)分散在一定體積的MES緩沖溶液中(pH = 5.6，0.01M)，然后加入一定量的碳二亞胺(EDC,0.01-0.1mg)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，0.01-0.1mg)，在渦流振蕩器上輕輕地振蕩反應(yīng)0.5h，然后磁分離，再用pH = 7.4的PBS緩沖液重懸，然后加入一定量的抗體(0.1-0.5mg)，反應(yīng)2h，再加入5%BSA (100-500 UL)反應(yīng)0.5h，最后磁分離，去掉上清液，然后加入一定量的PBST洗滌液重懸超順納米磁珠，然后再磁分離，去掉上清液，重復(fù)洗3次，最后得到的免疫超順納米磁珠，用PBS緩沖液重懸，在4°C冰箱保存。
[0035](2)磁聚集可視化免疫檢測步驟:
[0036]將一定量的免疫超順納米磁珠和一系列濃度的生物大分子(如蛋白質(zhì))或微生物體(如細菌、真菌或病毒)混合在一起，在振蕩器上反應(yīng)10-20min，然后將裝有免疫超順納米磁珠的試管放在磁分離架上，Imin后觀察免疫超順納米磁珠的聚集狀態(tài)。
[0037]上述步驟之后的結(jié)果如圖2所示，(a)表示免疫超順納米磁珠與樣品混合在一起，反應(yīng)15min之后，沒有外加磁場下的狀態(tài)圖；(b)表示免疫超順納米磁珠與樣品混合在一起，反應(yīng)15min之后，在磁場下的狀態(tài)圖；(c)表示將外加磁場去掉，將聚集狀態(tài)的免疫超順納米磁珠重懸，然后放在沒有外加磁場的試管架上，所述免疫超順納米磁珠在重力單獨作用下的狀態(tài)圖?？梢姡瑯悠分心繕宋?如大腸桿菌)越多，免疫超順納米磁珠的聚集程度就越大，其顏色就越深；重懸后，在重力單獨作用下的沉降速度和程度越大。
[0038]實施例2
[0039]檢測水樣中的大腸桿菌，具體實驗步驟如下:
[0040](I)將一系列不同濃度的大腸桿菌(107、106、105、104、10lP0cfu/mL)各 900 μ L 和一定量的超順納米磁珠(100 μ L)混合在一起，在渦流振蕩器上振蕩反應(yīng)15min ；
[0041](2)將上述反應(yīng)完的免疫混合物放在磁分離架上，磁分離Imin ；
[0042](3)肉眼觀察超順納米磁珠的狀態(tài)，可見樣品中大腸桿菌濃度(cfu/mL)越高，免疫超順納米磁珠的聚集程度就越大，其顏色就越深(圖3a);用相機拍照，并用相關(guān)的圖形處理軟件對其灰度值進行定量，結(jié)果顯示:大腸桿菌濃度越高，灰度值越大(圖3b)。
[0043]實施例3
[0044]檢測雞胚囊液中的新城疫病毒，具體實驗步驟如下:
[0045](I)將一系列不同濃度的新城疫病毒(ΙΟ7、ΙΟ6、105、IO4UO3和Ocopy/mL)各900 μ L和一定量的超順納米磁珠(100 μ L)混合在一起，在渦流振蕩器上振蕩反應(yīng)15min ；
[0046](2)將上述反應(yīng)完的免疫混合物放在磁分離架上，磁分離Imin ；
[0047](3)肉眼觀察超順納米磁珠的狀態(tài)，用相機拍照，并用相關(guān)的圖形處理軟件對其灰度值進行定量。結(jié)果類似于圖3。
[0048]實施例4
[0049]檢測尿液中的胎癌蛋白(CEA)的含量，具體實驗步驟如下:
[0050](I)將一系列不同濃度的CEA(20、10、5、2、l、0ng/mL)各900 μ L和一定量的超順納米磁珠(100 μ L)混合在一起,在潤流振蕩器上振蕩反應(yīng)15min ；
[0051](2)將上述反應(yīng)完的免疫混合物放在磁分離架上，磁分離Imin ；
[0052](3)肉眼觀察超順納米磁珠的狀態(tài)，可見樣品中CEA濃度(ng/mL)越高，免疫超順納米磁珠的聚集程度就越大，其顏色就越深(圖4a);用相機拍照，并用相關(guān)的圖形處理軟件對其灰度值進行定量，結(jié)果顯示=CEA濃度越高，灰度值越大(圖4b)。
[0053]實施例5
[0054]檢測尿液中的甲胎蛋白(AFP)的含量，具體實驗步驟如下:
[0055](I)將一系列不同濃度的AFP(40、20、10、5、2.5和Ong/mL)各900 μ L和一定量的超順納米磁珠(100 μ L)混合在一起，在渦流振蕩器上振蕩反應(yīng)15min ；
[0056](2)將上述反應(yīng)完的免疫混合物放在磁分離架上，磁分離Imin ；
[0057](3)肉眼觀察超順納米磁珠的狀態(tài)，樣品中AFP濃度(ng/mL)越高，免疫超順納米磁珠的聚集程度就越大，其顏色就越深(圖5)。用相機拍照，并用相關(guān)的圖形處理軟件對其灰度值進行定量，顯示灰度值與AFP濃度呈正相關(guān)。
[0058] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細特征以及詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細特征以及詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細特征以及詳細方法才能實施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測生物大分子或微生物體的方法，包括如下步驟:使用生物大分子或微生物體的抗體包被的單分散超順納米磁珠與待檢測樣品接觸進行孵育反應(yīng)，生成多顆粒的超順納米磁珠團簇；反應(yīng)后進行磁分離得到聚集物，根據(jù)所述聚集物的聚集程度確定待檢測樣品中生物大分子或微生物體的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚集物的聚集程度與所述生物大分子或微生物體的濃度呈正相關(guān)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸和多糖，優(yōu)選蛋白質(zhì)； 優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)包括脂蛋白、糖蛋白、核蛋白和生物標志物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述微生物體包括細菌、真菌和病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述待檢測樣品為環(huán)境、生物或食品來源的樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述抗體為單克隆抗體和/或多克隆抗體，優(yōu)選多克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述生物大分子或微生物體具有多個抗原決定簇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于，所述孵育反應(yīng)時間為5-60min，優(yōu)選15min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于，所述磁分離的時間為0.5-5min,優(yōu)選Imin。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于，根據(jù)所述聚集物的聚集程度確定待檢測樣品中生物大分子或微生物體的濃度，具體為: 獲取所述聚集物的照片，通過對照片灰度值進行定量來確定待檢測樣品中生物大分子或微生物體的濃度。
【文檔編號】G01N33/532GK103954775SQ201410197209
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】蔣興宇, 陳翊平, 查瑞濤, 張偉, 曹豐晶 申請人:國家納米科學(xué)中心