一種基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法
【專利摘要】一種基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法，屬于材料化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明包括納米金二聚體的組裝、納米金的表面修飾、納米金與細(xì)胞共同孵育、細(xì)胞內(nèi)手性信號(hào)的表征等步驟。本發(fā)明選擇金納米粒子作為激元，將其組裝成二聚體后，對(duì)其表面進(jìn)行改性修飾，使其能夠快速的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，然后對(duì)其進(jìn)行圓二色譜的表征。本發(fā)明提供了能夠高效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的納米金二聚體的制備方法，得到了結(jié)構(gòu)均一，在細(xì)胞內(nèi)有良好的分散性，且手性信號(hào)穩(wěn)定的納米金二聚體。
【專利說(shuō)明】—種基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法，屬于材料化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]金納米粒子作為一種基本的納米材料，具有獨(dú)特的物理、化學(xué)性質(zhì)。通過(guò)自組裝的方式使其形成二聚體結(jié)構(gòu)，一方面由于二聚體的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，另一方面由于納米粒子表面的等離子體共振與手性配體偶極之間的耦合，使得這種二聚體組裝體能夠在體外可見(jiàn)光區(qū)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的圓二色性。細(xì)胞是生命的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，對(duì)細(xì)胞的深入研究是揭開(kāi)生命奧秘、改造生命和征服疾病的關(guān)鍵。將金納米材料以二聚體的形式導(dǎo)入細(xì)胞，可以有效利用圓二色光譜超靈敏的信號(hào)放大作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)進(jìn)行探究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法，步驟為:
(1)納米金二聚體的組裝:利用檸檬酸還原法得到金納米粒子，將其分別與硫代磷酸化修飾的巰基DNAl、DNA2及DNA3偶聯(lián)形成Au-DNAl復(fù)合體、Au_DNA2復(fù)合體及Au_DNA3復(fù)合體；將復(fù)合體Au-DNAl和AU-DNA2混合，形成納米金二聚體溶膠結(jié)構(gòu)，并對(duì)此結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；
(2)納米金的表面修飾:將巰基修飾的聚乙二醇PEG5000和穿膜肽TAT同時(shí)加入到步驟(I)中得到的納米金二聚體溶膠及AU-DNA3復(fù)合體溶液中，偶聯(lián)24h后分別得到表面修飾的納米金二聚體及表面修飾的金納米粒子；
(3)納米金與細(xì)胞共同孵育:將步驟(2)中得到的納米金二聚體及金納米粒子分別與一定數(shù)量的細(xì)胞共同培養(yǎng)一段時(shí)間后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別得到細(xì)胞內(nèi)含有納米金二聚體的細(xì)胞懸液及細(xì)胞內(nèi)含有金納米粒子的細(xì)胞懸液；
(4)細(xì)胞內(nèi)手性信號(hào)的表征:對(duì)步驟(3)中得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行生物電鏡表征和圓二色性表征。
[0005]所述基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法，具體步驟如下:
(I)納米金二聚體的組裝:取200mL、2nM、20nm的金納米粒子8000rpm離心IOmin,并重懸在20mL 0.01M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液PBS中，得納米金重懸液；
取5mL納米金重懸液并按金納米粒子:DNA摩爾濃度比為1: 5向溶液中加入硫代磷酸化修飾的巰基DNAl進(jìn)行偶聯(lián)，室溫靜置24h后得到Au-DNAl復(fù)合體；另取5mL納米金重懸液按同樣的摩爾比加入硫代磷酸化修飾的巰基DNA2，室溫靜置24h后得到AU-DNA2復(fù)合體；按同樣的摩爾比把硫代磷酸化修飾的巰基DNA3加入到余下的IOmL納米金重懸液中，得到AU-DNA3復(fù)合體溶膠；
將Au-DNAl和AU-DNA2復(fù)合體等體積混勻，80°C孵育5min，室溫冷卻并靜置12h，得到納米金二聚體溶膠；
(2)納米金表面修飾:將巰基修飾的PEG5000和TAT按金納米粒子:PEG: TAT摩爾比為1: 1000: 100同時(shí)加入步驟(1)制備的納米金二聚體溶膠和AU-DNA3復(fù)合體溶膠中；室溫震蕩24h后，8000rpm離心10min,沉淀重懸于超純水中，分到得到表面修飾的納米金二聚體及表面修飾的金納米粒子；
(3)納米金與細(xì)胞的共同孵育:將步驟(2)中得到的表面修飾的納米金二聚體及表面修飾的金納米粒子分別以8000 rpm離心10min,沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，使納米金二聚體及金納米粒子的終濃度都為5nM ;將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板的兩個(gè)孔中，每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)量控制為IO4個(gè)，培養(yǎng)24h后去掉培養(yǎng)液；向其中一個(gè)孔加入上述含有納米金二聚體的細(xì)胞培養(yǎng)液300 μ L，另一個(gè)加入300 μ L含有金納米粒子的細(xì)胞培養(yǎng)液，分別孵育2h后，去除培養(yǎng)液，用PBS反復(fù)洗滌各個(gè)孔中細(xì)胞5次，將洗滌后的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化5min, 1000rpm離心10min,沉淀 重懸于50 μ L PBS中，分別得到細(xì)胞內(nèi)含有納米金二聚體的細(xì)胞懸液及細(xì)胞內(nèi)含有金納米粒子的細(xì)胞懸液；
(4)細(xì)胞內(nèi)二聚體的表征:采用生物透射電鏡和圓二色譜法對(duì)步驟(3)中得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行表征。
[0006]所述DNAl序列如SEQ ID N0.1所示,DNA2序列如SEQ ID N0.2所示,DNA3序列如SEQ ID N0.3所示，TAT多肽序列如SEQ ID N0.4所示。具體如表1。
[0007]表1 DNA及多肽的編號(hào)、序列及長(zhǎng)度
【權(quán)利要求】
1.一種基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法，其特征在于步驟為: (1)納米金二聚體的組裝:利用檸檬酸還原法得到金納米粒子，將其分別與硫代磷酸化修飾的巰基DNAl、DNA2及DNA3偶聯(lián)形成Au-DNAl復(fù)合體、Au_DNA2復(fù)合體及Au_DNA3復(fù)合體；將復(fù)合體Au-DNAl和AU-DNA2混合，形成納米金二聚體溶膠結(jié)構(gòu)，并對(duì)此結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征； (2)納米金的表面修飾:將巰基修飾的聚乙二醇PEG5000和穿膜肽TAT同時(shí)加入到步驟(1)中得到的納米金二聚體溶膠及AU-DNA3復(fù)合體溶液中，偶聯(lián)24h后分別得到表面修飾的納米金二聚體及表面修飾的金納米粒子； (3)納米金與細(xì)胞共同孵育:將步驟(2)中得到的納米金二聚體及金納米粒子分別與一定數(shù)量的細(xì)胞共同培養(yǎng)一段時(shí)間后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別得到細(xì)胞內(nèi)含有納米金二聚體的細(xì)胞懸液及細(xì)胞內(nèi)含有金納米粒子的細(xì)胞懸液； (4)細(xì)胞內(nèi)手性信號(hào)的表征:對(duì)步驟(3)中得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行生物電鏡表征和圓二色性表征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法，其特征在于具體步驟如下: (1)納米金二聚體的組裝:取200mL、2nM、20nm的金納米粒子8000rpm離心10min,并重懸在20mL 0.01M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液PBS中，得納米金重懸液； 取5mL納米金重懸液并按金納米粒子:DNA摩爾濃度比為1: 5向溶液中加入硫代磷酸化修飾的巰基DNAl進(jìn)行偶聯(lián)，室溫靜置24h后得到Au-DNAl復(fù)合體；另取5mL納米金重懸液按同樣的摩爾比加入硫代磷酸化修飾的巰基DNA2，室溫靜置24h后得到AU-DNA2復(fù)合體；按同樣的摩爾比把硫代磷酸化修飾的巰基DNA3加入到余下的IOmL納米金重懸液中，得到AU-DNA3復(fù)合體溶膠； 將Au-DNAl和AU-DNA2復(fù)合體等體積混勻，80°C孵育5min，室溫冷卻并靜置12h，得到納米金二聚體溶膠； (2)納米金表面修飾:將巰基修飾的PEG5000和TAT按金納米粒子:PEG: TAT摩爾比為1: 1000: 100同時(shí)加入步驟(1)制備的納米金二聚體溶膠及AU-DNA3復(fù)合體溶膠中；室溫震蕩24h后，8000rpm離心10min,沉淀重懸于超純水中，分別得到表面修飾的納米金二聚體及表面修飾的金納米粒子； (3)納米金與細(xì)胞的共同孵育:將步驟(2)中得到的表面修飾的納米金二聚體及表面修飾的金納米粒子分別以8000 rpm離心10min,沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，使納米金二聚體及金納米粒子的終濃度都為5nM ;將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板的兩個(gè)孔中，每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)量控制為104個(gè)，培養(yǎng)24h后去掉培養(yǎng)液；向其中一個(gè)孔加入上述含有納米金二聚體的細(xì)胞培養(yǎng)液300 μ L，另一個(gè)加入300 μ L含有金納米粒子的細(xì)胞培養(yǎng)液，分別孵育2h后，去除培養(yǎng)液，用PBS反復(fù)洗滌各個(gè)孔中細(xì)胞5次，將洗滌后的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化5min, 1000rpm離心10min,沉淀重懸于50 μ L PBS中，分別得到細(xì)胞內(nèi)含有納米金二聚體的細(xì)胞懸液及細(xì)胞內(nèi)含有金納米粒子的細(xì)胞懸液； (4)細(xì)胞內(nèi)二聚體的表征:采用生物透射電鏡和圓二色譜法對(duì)步驟(3)中得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行表征。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于離散型金納米二聚體的細(xì)胞內(nèi)等離子手性平臺(tái)的構(gòu)建方法，其特征在于:所述DNAl序列如SEQ ID N0.1所示，DNA2序列如SEQ ID N0.2所示，DNA3序列如SEQ I D N0.3所示，TAT多肽序列如SEQ ID N0.4所示。
【文檔編號(hào)】G01N21/25GK103954565SQ201410202424
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】徐麗廣, 胥傳來(lái), 孫茂忠, 匡華, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:江南大學(xué)