一種高效液相色譜法測(cè)定艾塞那肽及其雜質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種高效液相色譜法測(cè)定艾塞那肽及其雜質(zhì)的方法,通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定艾塞那肽及其雜質(zhì),各雜質(zhì)的專屬性、線性及范圍、回收率、精密度、耐用性等試驗(yàn)均良好;通過(guò)本發(fā)明方法使分離的已結(jié)構(gòu)確證的雜質(zhì)達(dá)到8個(gè)。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理,儀器設(shè)備為已普及的高效液相色譜儀;且流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低,實(shí)現(xiàn)艾塞那肽及其雜質(zhì)的分離并定量測(cè)定。
【專利說(shuō)明】一種高效液相色譜法測(cè)定艾塞那肽及其雜質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬分析化學(xué)領(lǐng)域,涉及分析檢測(cè)艾塞那肽及其雜質(zhì)的方法,特別涉及用一種高效液相色譜法有效分離并測(cè)定艾塞那肽及其雜質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在艾塞那肽合成、放置、制劑工藝過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生某些與艾塞那肽結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類似的雜肽(即艾塞那肽雜質(zhì)),例如缺失肽、非對(duì)映異構(gòu)體等。目前,分離艾塞那肽及其雜質(zhì)的方法常為反相高效液相色譜法和離子交換色譜法,但這些現(xiàn)公開(kāi)的反相高效液相色譜法(流動(dòng)相系乙腈:0.1%三氟乙酸溶液等)方法在艾塞那肽及其雜質(zhì)測(cè)定過(guò)程中,專屬性差,使得艾塞那妝及其雜質(zhì)(Exenatide fragment3_39、Acetyl Exenatide> L-Glu13 Exenatide>D-Ser8Exenatide、D-Ser11 Exenatide、Met[O] Exenatide、D-His1 Exenatide、Des-Gly2Exenatide)的峰不能分離或分離度達(dá)不到要求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種高效液相色譜法測(cè)定艾塞那肽及其雜質(zhì)的方法,旨在解決艾塞那妝及其雜質(zhì)(Exenatide fragment3_39、Acetyl Exenatide、L-Glu13 Exenatide、D-Ser8Exenatide、D-Ser11 Exenatide、Met[0] Exenatide、D-His1 Exenatide、Des-Gly2Exenatide)的分離并定量測(cè)定。
[0004]本發(fā)明通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):
1、色譜柱的準(zhǔn)備:所用色譜柱的填充劑為用辛烷基硅烷;
2、高效液相色譜儀的設(shè)置:檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為6°C,柱溫為40°C,流動(dòng)相流速為0.8~1.2ml/min ;
3、色譜流動(dòng)相水相的配置:稱取烷基磺酸鈉(庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、壬烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉)適量,用水溶解并稀釋成濃度總和為1.2^1.8mmol/L溶液,并用磷酸調(diào)PH至4.0-4.8;
所述的烷基磺酸鈉可以是庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、壬烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉任意一種或多種的混合物;
所述的烷基磺酸鈉的濃度可以是庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、壬烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉一種或多種的混合物的濃度總和;
4、流動(dòng)相的準(zhǔn)備:以乙腈-上述烷基磺酸鈉溶液(10:90)為流動(dòng)相A,乙腈-上述烷基磺酸鈉溶液(52:48)為流動(dòng)相B ;
5、采用梯度洗脫,洗脫時(shí)間及流動(dòng)相A體積比程序?yàn)?.01~60 min從60% — 25%、60 ~60.5min 再?gòu)?25%— 60%、60%運(yùn)行至 65min ;
6、樣品溶液的配置:精密稱取樣品適量,用流動(dòng)相溶解并稀釋至每ml約含艾塞那肽
0.4~1.6mg/ml 溶液;
7、精密吸取樣品溶液40μ 1,注入液相色譜儀測(cè)定,并記錄色譜圖,在得到的色譜圖中,各雜質(zhì)與主峰均達(dá)到良好分離,艾塞那肽的保留時(shí)間為26.272min,各雜質(zhì)Exenatidefragment3_39、Acetyl Exenatide、L-Glu13 Exenatide、D-Ser8 Exenatide、D-Ser11Exenatide、Met [0] Exenatide、D-His1 Exenatide、Des-Gly2 Exenatide 的保留時(shí)間分別為:8.787min、10.935min、12.109min、13.085min、23.204min、24.855min、28.458min、29.407min,相對(duì)保留時(shí)間分別為:0.33,0.42,0.46,0.50,0.88,0.95、1.08、1.12。
[0005]本發(fā)明通過(guò)合理的方法設(shè)計(jì),與現(xiàn)有的方法技術(shù)相比,具有明顯的優(yōu)點(diǎn):使分離的已結(jié)構(gòu)確證的雜質(zhì)達(dá)到8個(gè);各雜質(zhì)的專屬性、線性及范圍、回收率、精密度、耐用性等試驗(yàn)均良好;儀器設(shè)備為已普及的高效液相色譜儀;且流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低等。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0006]圖1是艾塞那肽與各雜質(zhì)液相分離圖。
【具體實(shí)施方式】
[0007]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述,但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于實(shí)施例。
[0008]實(shí)施例1本發(fā)明方法的建立過(guò)程:
1、儀器與試劑
儀器:Waters 2489檢測(cè)器,Waters e2695泵,Empower色譜工作站;
試劑:乙腈(色譜純);庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、壬烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉、三氟乙酸、磷酸(分析純);注射用水。
[0009]2、艾塞那肽雜質(zhì)測(cè)定方法的建立
(I)波長(zhǎng)的選擇:艾塞那肽及其雜質(zhì)(Exenatide fragment3_39、Acetyl Exenatide、L-Glu13 Exenatide、D-Ser8 Exenatide、D-Ser11 Exenatide、Met [0] Exenatide、D-His1Exenatide, Des-Gly2 Exenatide)紫外光吸收具有自身的特性。我們測(cè)定了它的在25%乙腈溶液在紫外下的吸收?qǐng)D譜,艾塞那肽及其各雜質(zhì)在214nm波長(zhǎng)下均有較強(qiáng)的紫外吸收,因此我們選用214nm作為本品的檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0010](2)溶解性試驗(yàn):
將艾塞那肽在水和25%乙腈中的溶解性對(duì)比試驗(yàn),結(jié)果顯示:艾塞那肽在25%的乙腈中的溶解度能達(dá)到 1.6mg/ml 以上,其雜質(zhì)(Exenatide fragment3_39、Acetyl Exenatide、L-Glu13 Exenatide、D-Ser8 Exenatide、D-Ser11 Exenatide、Met [0] Exenatide、D-His1Exenatide、Des-Gly2 Exenatide)在25%乙腈中也能達(dá)到0.5mg/ml以上,表明,用25%乙腈作為分析艾塞那肽及其雜質(zhì)能滿足高效液相分析的測(cè)定的靈敏度的要求。
[0011](3)溶劑的干擾性試驗(yàn):
將艾塞那肽及其各雜質(zhì)用25%乙腈溶解后的測(cè)試溶液及溶劑(25%乙腈)進(jìn)行測(cè)試比較,以此判斷所選擇的溶劑(25%乙腈)是否干擾本項(xiàng)測(cè)定。
[0012]方法如下:取艾塞那肽約10mg,精密稱定,置IOml量瓶中,用25%乙腈溶解并定容至刻度,另取艾塞那妝各雜質(zhì)(Exenatide fragment3_39、Acetyl Exenatide、L-Glu13Exenatide、D-Ser8 Exenatide、D-Ser11 Exenatide、Met [0] Exenatide、D-His1 Exenatide、Des-Gly2 Exenatide)適量,用25%乙腈制成濃度為每Iml中約含各成分10 μ g的溶液,作為測(cè)定艾塞那肽及其雜質(zhì)的供試品溶液。
[0013]在上述色譜條件下,取供試品溶液及溶劑(25%乙腈)各40μ 1,注入色譜儀,記錄色譜圖。
[0014]結(jié)果顯示:艾塞那肽及其雜質(zhì)在本色譜條件下均能良好的檢出,且均互不干擾。因此,我們采用25%乙腈作為艾塞那肽及各雜質(zhì)測(cè)定用溶劑。
[0015](4)方法的專屬性
破壞性(酸、堿、雙氧水、熱、光破壞)試驗(yàn)下的分離:取艾塞那肽適量約10mg,置于酸(0.1mo I/ml HC1)、堿(0.1mo I/ml NaOH)、雙氧水(10%)、熱 45°C、光(4000?μΧ)的條件下破壞2小時(shí)(由于本品為多肽類藥物,其對(duì)氧化、熱、光均比較敏感,整個(gè)降解時(shí)間比較短)。結(jié)果表明艾塞那肽在這些條件下均有降解峰產(chǎn)生,且它們與主峰均能達(dá)到良好的分離。因此我們認(rèn)為本方法具有良好的專屬性。
[0016](5)與現(xiàn)有的方法的比較
在對(duì)專利(CN103293255A、CN103424496A)與本方法進(jìn)行比較后:本文中的方法能分離的已結(jié)構(gòu)確證雜質(zhì)數(shù)量達(dá)到8個(gè)(參見(jiàn)圖1),不僅比原有的技術(shù)(CN103293255A)多分離出兩個(gè)雜質(zhì),而且有六 個(gè)雜質(zhì)(Exenatide fragment3_39、Acetyl Exenatide、D-Ser8Exenatide、D-Ser11 Exenatide、D-His1 Exenatide、Des-Gly2 Exenatide)是新分離出的;原有的技術(shù)(CN103293255A)用到的是尚未普及的超高效液相色譜法,本文中的技術(shù)為已普及的高效液相色譜法。
[0017](6)進(jìn)樣精密度
取艾塞那肽雜質(zhì)測(cè)定中的各溶液,精密吸取40μ1進(jìn)樣,重復(fù)6次,記錄各主峰面積,計(jì)算該方法進(jìn)樣精密度。結(jié)果表明,艾塞那肽及其各雜質(zhì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%,表明本方法的進(jìn)樣精密度良好。
[0018](7)艾塞那肽各雜質(zhì)的回收率試驗(yàn)
供試品溶液:精密稱取艾塞那肽約10mg,9份,置于IOml的棕色容量瓶中,再相應(yīng)精密加入各雜質(zhì)對(duì)照品母液(含雜質(zhì) Exenatide fragment3_39、Acetyl Exenatide、L-Glu13Exenatide、D-Ser8 Exenatide、D-Ser11 Exenatide、Met [0] Exenatide、D-His1 Exenatide、Des-Gly2 Exenatide的濃度約為100Pg/ml) 0.5、1.0、1.5ml各三份,用25%乙腈溶解并定各,備用。
[0019]對(duì)照品溶液:精密吸取艾塞那肽各雜質(zhì)對(duì)照品母液(含雜質(zhì)的濃度約為IOOPg/ml) 1.0ml,置于IOml的棕色容量瓶中,25%乙腈稀釋定容,備用。
[0020]按照上述艾塞那肽及其各雜質(zhì)HPLC法測(cè)定。計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表1。
【權(quán)利要求】
1.一種高效液相色譜法測(cè)定艾塞那肽及其雜質(zhì)的方法,其特征在于,通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)色譜柱的準(zhǔn)備:所用色譜柱的填充劑為用辛烷基硅烷; (2)高效液相色譜儀的設(shè)置:檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為6°C,柱溫為40°C,流動(dòng)相流速為0.8?1.2ml/min ; (3)色譜流動(dòng)相水相的配置:稱取烷基磺酸鈉,用水溶解并稀釋成濃度總和為1.2?1.8mmol/L溶液,并用磷酸調(diào)pH至4.0?4.8 ; (4)流動(dòng)相的準(zhǔn)備:流動(dòng)相A為乙腈-上述烷基磺酸鈉溶液=10:90,流動(dòng)相B為乙腈-烷基磺酸鈉溶液=52:48 ; (5)梯度洗脫:洗脫時(shí)間及流動(dòng)相A體積比順序?yàn)?.01?60 min從60% — 25%、60?60.5min 再?gòu)?25%— 60%、60%運(yùn)行至 65min ; (6)樣品溶液的配置:稱取樣品,用流動(dòng)相溶解并稀釋至含艾塞那肽0.Π.6mg/ml溶液; (7)精密吸取樣品溶液40μ 1,注入液相色譜儀測(cè)定,并記錄色譜圖,艾塞那肽的保留時(shí)間為26.272min,各雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間分別為:Exenatide fragment3_39:0.33,AcetylExenatide:0.42, L-Glu13 Exenatide:0.46, D-Ser8Exenatide:0.50, D-Ser11 Exenatide:0.88, Met[0] Exenatide:0.95, D-His1 Exenatide:1.08, Des-Gly2Exenatide:1.12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效液相色譜法測(cè)定艾塞那肽及其雜質(zhì)的方法,其特征在于,步驟(3)中所述的烷基磺酸鈉選用庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、壬烷磺酸鈉或癸烷磺酸鈉中的一種或多種的混合物。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103995062SQ201410205748
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】彭忠華 申請(qǐng)人:浙江圣兆醫(yī)藥科技有限公司