奇數(shù)和支鏈脂肪酸作為鑒別動物種屬乳標志物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了奇數(shù)和支鏈脂肪酸作為鑒別動物種屬乳標志物中的用途，包括：(1)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法獲取各檢測樣品中奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量及各組成成分含量數(shù)據(jù)；(2)通過分析奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量的數(shù)據(jù)，將各檢測樣品進行區(qū)分。本發(fā)明采用GC-MS方法獲得各檢測樣品中OBCFA總量以及各組成成分含量的數(shù)據(jù)，對這些數(shù)據(jù)進行包括主成分分析、聚類分析等將各檢測樣品進行準確區(qū)分。本發(fā)明方法不僅能準確將奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳進行區(qū)分，還能為乳中OBCFA的實際應(yīng)運和乳脂肪的進一步研究提供基礎(chǔ)信息。
【專利說明】奇數(shù)和支鏈脂肪酸作為鑒別動物種屬乳標志物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種動物乳的區(qū)分方法，尤其涉及一種采用GC-MS區(qū)分奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳的方法，屬于動物種屬乳的鑒別領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]動物乳中的乳脂肪是一種高質(zhì)量的天然脂肪，乳脂肪以小球或小液滴狀分散在乳中脂肪球由位于中心的非極性的甘油三酯和膽固醇酯等與外層極性的磷脂、膽固醇、蛋白和酶等組成。乳脂肪的主要成分是甘油三酯、磷脂和留醇；與甘油三酯相結(jié)合的脂肪酸有400 多種，常見的有 20 多種(JENSEN R G.The composit1n of bovine milk lipids: Januaryl995toDecember2000[J], J Dairy Sci, 2002，85(2):295-350.)。乳脂肪除提供營養(yǎng)外，也具有許多生理活性，特別是乳脂中的中短鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸對人體健康有益，此外還含有大量的脂溶性維生素。
[0003]奇數(shù)和支鏈脂肪酸(OBCFA)包括奇數(shù)碳原子中的直鏈脂肪酸(如C15:0)和支鏈脂肪酸(如isoC15:0)以及偶數(shù)碳原子中的支鏈脂肪酸(如isoC14:0);另外，無論是奇數(shù)還是偶數(shù)碳原子中的支鏈脂肪酸又包括異構(gòu)支鏈脂肪酸(如isoC15:0、isoC14:0)和反異構(gòu)(也叫前異構(gòu)支鏈脂肪酸，如inteisoC15:0)。OBCFA的種類繁多，不同種類之間的含量差異較大。
[0004]最近的研究結(jié)果表明，OBCFA具有抗癌作用。通過從發(fā)酵大豆制品中提取的isoC15:0，在體內(nèi)和體外試驗中均抑制了多種癌細胞的生長(Yang等，2000)。隨后進一步的體外試驗研究表明，支鏈脂肪酸均可抑制癌細胞的生長合成；此外，OBCFA還可作為動態(tài)內(nèi)源指示劑，通過測定乳脂中的OBCFA含量即可估算出進入十二指腸中微生物尤其是細菌蛋白流量，又可反映瘤胃發(fā)酵模式的變化。
[0005]迄今為止，未有將OBCFA作為標志物應(yīng)用于鑒別動物種屬乳的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是將動物乳中奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總含量以及各組成成分的含量作為鑒別動物種屬乳的標志物；在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種準確、快速的區(qū)分奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳的方法；
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0008]一種奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳的方區(qū)分法，包括以下步驟:(I)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法獲得各檢測樣品中奇數(shù)和支鏈脂肪酸(OBCFA)的總量以及各組成成分含量的數(shù)據(jù)；(2)通過分析奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量的數(shù)據(jù)，將各檢測樣品進行區(qū)分。
[0009]其中，將各檢測樣品的奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量進行聚類分析(Cluster);牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳和山羊乳聚為一類，其中，山羊乳又獨立聚一小類；駱駝乳和馬乳聚為另一大類。
[0010]聚類分析是指所研究的樣本或者變量之間存在程度不同的相似性，要求設(shè)法找出一些能夠度量它們之間相似程度的統(tǒng)計量作為分類的依據(jù)，再利用這些量將樣本或者變量進行分類。聚類分析的原理是將一定數(shù)量的樣品或指標各自看成一類，然后根據(jù)樣品(或指標)的親疏度，將親疏度最高的兩類進行合并。然后考慮合并后的類與其他類之間的親疏度，再進行合并。重復(fù)這一過程，直至將所有的樣品(或指標)合并為一類。
[0011]為了達到更好的檢測效果，本發(fā)明進一步將各檢測樣品的奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量的數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA) (PC1:79.09% ；PC2:11.39% )以實現(xiàn)更好的區(qū)分效果；具體的，由圖1可以看出，在PCl聚為一組的是馬乳、奶牛乳和牦牛乳；其中，牦牛乳單獨聚在一起，并在PCl上較其他物種乳距離較遠且無交叉，在PCl牦牛乳上能夠與其它物種乳進行區(qū)分；在PC2方向聚為一組的是娟姍牛乳和水牛乳。
[0012]為了達到更好的檢測效果，本發(fā)明通過分析各檢測樣品中奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量，可以準確的將奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳進行區(qū)分:如果待檢測樣品中奇數(shù)和支鏈脂肪酸的組成中含量最高的是iso C15:0,其次高的是C15:0，那么待檢測的樣品屬于奶牛乳、牦牛乳、水牛乳或娟姍牛乳中的一種；其中，牦牛乳中OBCFA的總量最高，在其組成成分中除anteiso C17:0外，其余組成成分的含量均為最高；在剩下的檢測樣品(即:馬乳、駱駝乳和山羊乳)中，anteisOC17:0的含量最高，C15:0的含量其次高的待檢測樣品為山羊乳；anteisOC17:0的含量最高，iso C15:0含量其次高的檢測樣品是駱駝乳；iso C15:0的含量最高，anteiso C17:0的含量其次高的檢測樣品是馬乳，且馬乳中奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量最低。
[0013]本發(fā)明將檢測樣品的OBCFA總量以及各組成成分含量的數(shù)據(jù)通過PCA和Cluster分析均可較好的區(qū)分奶牛乳、水牛乳、牦牛乳、娟姍牛乳、山羊乳、駱駝乳和馬乳。由于OBCFA組分具有抗癌作用，本發(fā)明通過GC-MS方法對奶牛乳、水牛乳、牦牛乳、娟姍牛乳、山羊乳、駱駝乳和馬乳中OBCFA含量以及各組成成分的含量進行測定分析，不僅能夠準確的將奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳進行區(qū)分，還能為乳中OBCFA的實際應(yīng)運提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為乳脂肪的進一步研究提供基礎(chǔ)信息。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1奶牛、牦牛、水牛、娟姍牛、駱駝、馬和山羊乳中OBCFA組分含量PCA分析。
[0015]圖2奶牛、牦牛、水牛、娟姍牛、駱駝、馬和山羊乳中OBCFA組分含量Cluster分析(-1.19-1.19)。

【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，這些實施例僅是范例性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0017]實驗例I本發(fā)明奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳的區(qū)分方法的建立
[0018]1、試驗方法
[0019]1.1 試劑
[0020]1.1.lNaOCH3/Methanol (氫氧化鈉甲醇溶液)
[0021]將2g氫氧化鈉溶于10ml含水不超過0.5%的甲醇中，溶液放置一段時間后，可能產(chǎn)生碳酸鈉白色沉淀而失效，此時重新配制。溶液冷藏保存。
[0022]1.1.2鹽酸/甲醇溶液
[0023]1ml乙酰氯慢慢加入到10ml無水甲醇中，冷藏保存。
[0024]1.1.3Na2S04 溶液
[0025]6.67g Na2SO4 溶于 10ml 純水中。
[0026]1.1.4正己烷/異丙醇混合溶液
[0027]正己烷/異丙醇以3:2比例混合，冷藏保存。
[0028]1.1.5 正己烷
[0029]使用色譜純正己燒。
[0030]1.2操作過程
[0031]①取2ml待檢測的奶樣加4ml正己烷/異丙醇溶液，再加Na2SO4溶液2ml，室溫離心 5300rpm,20min。
[0032]②提取上清液在20ml水解管中，混合后氮氣吹干。
[0033]③加入2mlNa0CH3/Methanol在50°C水浴15min，冷卻后加入2ml鹽酸/甲醇溶液在 80°C水浴 1.5hr。
[0034]④冷卻到室溫，加入3ml水和6ml正己烷，震蕩，靜置或離心分層。
[0035]⑤吸取上層液體(盡量吸凈)，氮氣吹干，加入Iml正己燒,鏇渦震蕩Imin,將溶液吸取至2ml離心管中，10000rmp/min離心2min，取上層清液上機測定。
[0036]1.3儀器設(shè)備
[0037]氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent, 7890A-5975B, America),帶有EI離子源。
[0038]1.3.1氣相色譜條件
[0039]a.色譜柱:HP-88 (J&W Scientific, Folsom, CA, USA)，10mX 0.25mmX 0.25 μ m
[0040]b.柱溫:120°C保持 lOmin，1.5°C /min 升溫至 230°C，保持 35min。
[0041]c.載氣:氮氣(純度99.999% ),流速1.0mL/min,恒流模式。
[0042]d.進樣量:1 μ L，不分流進樣。
[0043]e.進樣口溫度:250°C
[0044]外標法定量。
[0045]1.3.2質(zhì)譜條件
[0046]MS 接口溫度:280°C
[0047]EI 溫度:70ev
[0048]離子源溫度:230°C
[0049]四極桿溫度:150 °C
[0050]分析模式:Scan (全離子掃描)
[0051]2.數(shù)據(jù)分析
[0052]數(shù)據(jù)采用SAS9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC)進行統(tǒng)計分析及鄧肯多重比較分析。OBCFA所有組分的數(shù)據(jù)進一步通過UnscrambIer9.8 (CAM0 SOFTWAREAS, Oslo, Norway)和 Gene Cluster3.0 (USA)中的 Average Linkage 進行主成分分析(PCA)和聚類分析(Cluster)。
[0053]3.試驗結(jié)果
[0054]試驗通過氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)測定奶牛、水牛、牦牛、娟姍牛、駱駝、馬和山羊乳中奇數(shù)碳鏈支鏈脂肪酸(OBCFA)，分析不同物種乳中OBCFA的表達模式。試驗分別采集奶牛乳樣20份(北京)，山羊乳樣20份(河北)，水牛乳樣20份(云南)和牦牛乳樣20份(青海)，娟姍牛乳樣20份(河北)，駱駝乳樣8份(新疆)和馬乳樣8份(新疆)于-80°C保存至測樣，采用氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)測定。
[0055]結(jié)果顯示，在四種?？祁愇锓N:奶牛、水牛、牦牛和娟姍牛乳脂肪中OBCFA組成中含量最高的是iso C15:0，其次高的是C15:0 ;而在山羊乳則是anteiso C17:0最高，其次是C15:0 ;駱駝乳中則是anteiso C17:0含量最高，iso C15:0含量其次高；馬乳中則是isoC15:0含量最高，其次是anteiso C17:0 ;均呈現(xiàn)物種特異性。且所有物種乳中anteisoC13:0的含量均最低。無論是OBCFA總含量還是各組分含量除了 anteiso C17:0外，牦牛乳中含量最高，而anteiso C17:0的含量僅略低于駱駝乳，馬乳中的總OBCFA含量最低。
[0056]表I不同物種乳中OBCFA組分含量(g/100g FA)
[0057]
Speciescowyakbuffalojerseygoatcamelhorse
anteisoC13:0 0.007±0.0002Ef 0.052^0,0012^ 0.047±(K0018ABb 0.016±0.0007Ue 0‘026±0‘001]Ld 0.042±0,0024^ 0.009±0.0009Ef^ isoC14:00.0?4±0.0030Et 0.682 士 0.0104^ 0.335±0.014?Bb 0.251±0.0079Ct; 0.171±0.0066Dd 0.321±0.0099Bb 0.063±0,0049Et
anteisoC15:0 0:049+0,0016Cl 0.295*0.0075^ 0.171±0.0053Bb 0.173 士0.0063 lBfc 0.080±0.0042Cl 0.185±0.0138ABb 0.004±0,0003Cl isoC15:0L042+0.0275DEe 3.348±0.0431u 2.901±0.1298Bb 3.070?±0.1112ABab 1.370±0.0363Dd 2.268±0.1287α 0.§13±0,0§715t
C15:00.699i0.0198Bt 3.320^0.0439 ^ 2,190±0.0477Bb 1.981+0.0303Cl 1.942±0.0563CD1- 1.76S±0.0659Dd 0.308±0.0153Ff
isoC16:00.183i0.0057M 1.270^0.0312^ 0.493±0.0192BCb 0-5343+0.0234Bb 0.400±0.0406Cl; 0.516i0.0282Bb 0.137±0.0112DJ
anteisoC17 0 0.636+0.0222Ff 2.220^0.0304Bb 1,086±0.0215E￡ 1.415 士0.0665Dd 2.000±0.06S3Cl- 2.892±0.1334Ya 0.784土 0.0430Ff isoC17:00.348±0.0119Ff 1.362^0.01560,616±0.0136Dd 0.789 士0.03051^ 0.535士 0.0198Et1.021±0.0220Bb 0.213±0.0125Gs
C17:00.616±0.0244Dd 3.020±0.0618Ad 1.139±0.0352Cl 1.198±0.0391Cl; 1.503±0.0329Bb1.412±0.0369Bb 0 280±0 0214Et
[0058]a_g肩標表示差異顯著(P〈0.05)，A_e肩標表示差異極顯著(P〈0.01).
[0059]表2不同物種乳中OBCFA含量(g/100g FA)
SpeciesOBCFASD
Jersey9.426903c0.198727
buffalo8.978631c0.214429
camel10.4245580.343682
[0060]cow3.655732e0.076905
goat8.026277°0.123998
horse2.610363F0.134965
yak15.56929'0.138487
[0061]A_F肩標表示差異極顯著(Ρ〈0.01).
[0062]通過PCA (Principal Component Analysis) (PC1: 79.09% ;PC2:11.39% )對不同物種乳中OBCFA各組分含量進行分析得出，馬乳和奶牛乳在PCl上聚為一組，牦牛乳在PCl上可以很好的與其它物種乳進行區(qū)分，而駱駝乳和山羊乳則可較好的在PC2上與其它物種進行區(qū)分，娟姍牛乳和水牛乳在PC2方向聚為一組?？傮w來講，PCA可以很好的將牦牛乳和其它物種乳進行區(qū)分，而馬乳、奶牛乳、駱駝乳和山羊乳的區(qū)分效果較好，但通過PCA無法將水牛乳和娟珊牛乳進行區(qū)分。
[0063]通過Cluster聚類分析不同物種乳中OBCFA的結(jié)果得出，以上物種主要聚為兩大類，其中四種?？祁?奶牛乳、水牛乳、牦牛乳和娟姍牛乳聚為一類，山羊乳也聚在這一類，但又獨立聚一小類；而駱駝乳和馬乳聚為另一大類，具有一定的種屬特異性，與統(tǒng)計分析的結(jié)果相一致。且通過聚類分析，除娟姍牛乳外，其它物種乳均可較好的進行區(qū)分。
[0064]實驗例2采用本發(fā)明方法區(qū)分奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳的實際應(yīng)用實驗
[0065]分別采集奶牛乳樣30份(北京)，山羊乳樣30份(河北)，水牛乳樣30份(云南)、牦牛乳樣30份(青海)，娟姍牛乳樣30份(河北)，駱駝乳樣30份(新疆)和馬乳樣30份(新疆)于_80°C保存至測樣，采用氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)測定各樣品中奇數(shù)碳鏈支鏈脂肪酸(OBCFA)的以下各組成成分的含量:anteisoC13:0、isoC14:0、anteisoC15:0、isoC15:0、C15:0、isoC16:0、anteisoC17:0、isoC17:0 和 C17:0。
[0066]氣相色譜條件以及質(zhì)譜條件同實驗例I。
[0067]通過GC-MS分析了各檢測樣品中奇數(shù)碳鏈支鏈脂肪酸的含量以及各組成成分的含量；實驗結(jié)果證實:奶牛、水牛、牦牛和娟姍牛乳脂肪中OBCFA組成中含量最高的是isoC15:0，其次是C15:0 ;山羊乳則是anteiso C17:0的含量最高，其次高是C15:0 ;駱駝乳中則是anteiso C17:0含量最高，iso C15:0含量其次高；馬乳中則是iso C15:0含量最高，其次高的是anteiso C17:0 ;均呈現(xiàn)物種特異性。且這些物種乳中anteiso C13:0的含量均最低。無論是OBCFA總含量還是各組分含量除了 anteiso C17:0外，牦牛乳中含量最高，而anteiso C17:0的含量僅略低于駱駝乳，馬乳中的總OBCFA含量最低。
[0068]本實驗證實，通過分析檢測樣品中奇數(shù)碳鏈支鏈脂肪酸的含量以及各組成成分的含量，能夠準確的將奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳進行區(qū)分。
【權(quán)利要求】
1.動物乳中奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量作為鑒別動物種屬乳標志物中的用途。
2.按照權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于:所述的動物種屬乳是奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳。
3.—種區(qū)分奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法獲得各檢測樣品中奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量的數(shù)據(jù)；(2)通過分析奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量的數(shù)據(jù)，將各檢測樣品進行區(qū)分。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述的分析是將各檢測樣品的奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量進行聚類分析；牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳和山羊乳聚為一類，其中，山羊乳獨立聚一小類；駱駝乳和馬乳聚為另一大類。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述的分析是將各檢測樣品的奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量的數(shù)據(jù)進行主成分分析；在PCi方向聚為一組的是馬乳、奶牛乳和牦牛乳，其中，牦牛乳在PCl上與其它物種乳進行區(qū)分；在？02方向聚為一組的是娟姍牛乳和水牛乳。
6.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，通過分析各檢測樣品中奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量以及各組成成分含量將奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、娟姍牛乳、馬乳、駱駝乳和山羊乳進行區(qū)分:如果待檢測樣品中奇數(shù)和支鏈脂肪酸的組成成分中含量最高的是iso C15:0，其次高的是C15:0，那么待檢測的樣品屬于奶牛乳、牦牛乳、水牛乳或娟姍牛乳中的其中一種；anteisoC17:0的含量最高，C15:0的含量其次高的待檢測樣品為山羊乳；anteis0C17:0含量最高，iso C15:0含量其次高的檢測樣品是駱駝乳；奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量最低的檢測樣品是馬乳。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:奇數(shù)和支鏈脂肪酸的總量最高的檢測樣品是牦牛乳。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:isoC15:0含量最高，anteiso C17:0含量其次高的檢測樣品是馬乳。
【文檔編號】G01N30/86GK104198595SQ201410208475
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】卜登攀, 馬露, 王加啟, 南雪梅, 陳靜廷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所