一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，所述試劑盒中包括：（1）鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原；（2）標準陽性血清；（3）標準陰性血清；（4）稀釋液；并提供了其應用。本發(fā)明提供的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒及其應用，其有益效果包括以下方面：試劑盒操作簡單方便，適合在各基層獸醫(yī)有關(guān)單位以及養(yǎng)殖場廣泛推廣使用，本發(fā)明中的試劑盒在檢測樣品時只需要使用幾種簡單耗材以及溫箱，不需要任何其它設備，即使在條件比較簡陋的養(yǎng)鴨場也可以使用；結(jié)果判定直觀，眼觀即可；操作人員不需要專業(yè)知識，不必接受專業(yè)培訓，只參照說明書就可進行檢測；成本低廉，經(jīng)濟實惠，大多使用者均可接受。
【專利說明】一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒及其應用
[0001]
【技術(shù)領域】
[0002]本發(fā)明涉及檢測試劑盒，具體涉及一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒及其應用。
【背景技術(shù)】
[0003]鴨疫里默氏桿菌iRiemerella anatipestifer, RA)是鴨疫里氏桿菌病的病原，可引起家鴨、鵝、火雞及多種家禽和野禽發(fā)病，導致的鴨的疾病稱為鴨傳染性漿膜炎(duckinfectious serositis)。發(fā)病鴨比較明顯的病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎等。類似的病理變化也見于火雞和其它禽類。本病最早于1932年在美國紐約州的長島發(fā)現(xiàn)，隨后迅速蔓延至世界各地。我國在1982年首次證實本病存在，目前各養(yǎng)鴨省區(qū)均有發(fā)生，且發(fā)病率和死亡率很高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。
[0004]RA血清型眾多，目前報道確認的有21個血清型，各血清型間缺乏有效的交叉免疫保護，給疫苗預防帶來了很大難度。我們從山東、河南以及廣東的鴨場中分離到87株RA，用玻板凝集試驗和試管凝集試驗對其血清型進行了鑒定。其中血清I型27株，血清2型25株，血清10型18株，其它血清型17株，說明目前我國流行的優(yōu)勢RA血清型為1、2和10型。
[0005]用試劑盒檢測RA抗體是診斷RA感染進而開展RA流行病學調(diào)查的有效手段。瓊脂擴散試驗可檢測RA血清抗體，但敏感性較低。另外，間接ELISA方法研究的較多，使用的抗原種類有滅活全菌體、超聲波破碎菌體后的裂解物、脂多糖、表達的重組蛋白等。絕大多數(shù)報道僅僅初步建立了 ELISA方法，并沒有進一步對所建立的方法進行優(yōu)化，也沒有開展臨床試驗，驗證ELISA方法的實際應用效果。到目前為止，沒有一種實現(xiàn)商品化的檢測RA血清抗體的試劑盒，在國內(nèi)外都是空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，鑒于目前我國流行的優(yōu)勢RA血清型為1、2和10型，提供了一種可簡單快速的檢測RA血清1、2和10型抗體的試劑盒，用來開展大范圍的RA流行病學調(diào)查和免疫水平監(jiān)測。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒,所述試劑盒中包括:
(O鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原；
(2)標準陽性血清；
(3)標準陰性血清；
(4)稀釋液。
[0008]進一步的，上述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，所述制備鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原的鴨疫里默氏桿菌菌株為田間分離株，分別為血清I型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6。
[0009]進一步的，上述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，所述鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原是將鴨疫里默氏桿菌菌株WF2、WF7和XY6進行增菌培養(yǎng)后，進行超聲破碎，再離心取上清后，作為抗原致敏鞣酸處理過的綿羊紅細胞得到的。
[0010]進一步的，上述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，所述鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原的制備方法，包括以下步驟:
1)靜脈采集綿羊紅細胞，保存于滅菌阿氏液中，在4°C靜置3-5天后，按常規(guī)方法對綿羊紅細胞進行洗滌、戊二醛固定和1/40000的鞣酸處理，所用的溶液均為PH 7.2的磷酸鹽緩沖液，制備好的綿羊紅細胞用PH7.2的磷酸鹽緩沖液懸浮至10%濃度，得到綿羊紅細胞懸液；
2)將鴨疫里默氏桿菌菌株WF2、WF7和XY6的菌液于冰浴中超聲破碎20min，然后凍融I次，再超聲破碎I次，將破碎后的菌液6000r/min離心15min，取上清，即為用于致敏綿羊紅細胞的抗原；
3)以步驟2)得到的三種用于致敏綿羊紅細胞的抗原致敏步驟I)得到的綿羊紅細胞懸液，得到鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原，三種抗原致敏紅細胞的終濃度為50 μ g/ml-100 μ g/ml ο
[0011]進一步的，上述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，述標準陽性血清的制備方法為:取-75 °C凍存的鴨疫里默氏桿菌甘油菌血清I型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6，用接種環(huán)蘸取菌液，劃線接種于含5%綿羊血的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上，置于37°C、5% CO2箱中培養(yǎng)15-20小時，再挑取單克隆菌株接種于IOml含5%小牛血清的營養(yǎng)肉湯中，37°C,200r/min培養(yǎng)15-18小時，然后把IOml菌液轉(zhuǎn)接到200ml含5%小牛血清的營養(yǎng)肉湯中，繼續(xù)在37°C搖床中200r/min培養(yǎng)12-15小時，培養(yǎng)完畢后，將全部菌液以6000r/min離心15min，用PH7.2磷酸鹽緩沖液將菌體沉淀洗滌3遍，最后用IOml緩沖液懸浮菌體，吹散混勻，得到超聲破碎用鴨疫里默氏桿菌菌液；再將其置于碎冰中，在超聲破碎儀中，按常規(guī)破碎程序超聲破碎20min，然后凍融I次，再超聲破碎I次，將破碎后的菌液6000r/min離心15min，取上清與弗氏完全佐劑等體積混勻，免疫兔，得到分離血清，效價達25及以上即為標準陽性血清。
[0012]進一步的，上述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，所述標準陰性血清的制備方法為:收集體重2.5公斤的健康新西蘭白兔的頸動脈血，室溫過夜，再以離心轉(zhuǎn)速3000r/min離心15min,取上清即得到標準陰性血清。
[0013]進一步的，上述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，所述稀釋液的制備方法為:配制PH7.2的磷酸鹽緩沖液，即稱取206.21克Na2HPO4.12H20，30.46克KH2PO4,68克NaCl，加去離子水，定容至8000ml，高壓滅菌，冷卻后加入體積百分比為1%的兔血清和質(zhì)量體積百分比為0.01%的疊氮鈉，即為稀釋液。具體制備量可根據(jù)實際需要調(diào)整。
[0014]本發(fā)明的第二個目的是提供了上述一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒在檢測鴨疫里默氏桿菌血清I型、血清2型和血清10型抗體效價中的應用。
[0015]進一步的，上述的應用，所述鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒的使用方法為:
a)在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1_12孔，第8排的1_8孔各加稀釋液50μ I ；
b)在血凝板1-6排的第I孔各加I份待檢血清,每份血清50μ 1，用排槍從血凝板1-6排的第I孔開始依次往后作2倍倍比稀釋，直至第8孔；在第7排的第I孔加50 μ I標準陽性血清，依次往后作2倍倍比稀釋，至第12孔；在第8排的第I孔加50 μ I標準陰性血清，依次2倍倍比稀釋至第4孔，第5-8孔為空白對照；
c)每孔加入充分搖勻的間接血凝抗原25μI ;
d)血凝板置于微量振蕩器上振蕩1-2分鐘，充分混勻，室溫或37°C靜置1.5-2小時；
e)根據(jù)細胞凝集程度判定待檢血清效價，以出現(xiàn)50%紅細胞凝集時的血清稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗體效價。
[0016]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒及其應用，其優(yōu)越性包括以下方面:
a.試劑盒操作簡單方便，適合在各基層獸醫(yī)有關(guān)單位以及養(yǎng)殖場廣泛推廣使用，本發(fā)明中的試劑盒在檢測樣品時只需要110°血凝板、移液器、移液器槍頭和玻璃蓋板等簡單耗材以及溫箱，不需要任何其它設備，即使在條件比較簡陋的養(yǎng)鴨場也可以使用；
b.結(jié)果判定直觀，眼觀即可；
c.操作人員不需要專業(yè)知識，不必接受專業(yè)培訓，只參照說明書就可進行檢測；
d.成本低廉，經(jīng)濟實惠，大多使用者均可接受。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為RA血清I型間接血凝抗原檢測標準陽性、陰性血清以及大腸桿菌、沙門氏菌和巴氏桿菌的陽性血清。
[0018]圖2為RA血清2型間接血凝抗原檢測標準陽性、陰性血清以及大腸桿菌、沙門氏菌和巴氏桿菌的陽性血清。
[0019]圖3為RA血清10型間接血凝抗原檢測標準陽性、陰性血清以及大腸桿菌、沙門氏菌和巴氏桿菌的陽性血清。
[0020]圖1-3中，“ + ”表示檢測標準陽性血清，“-”表示檢測標準陰性血清，“空白”表示不加血清的空白對照，“大腸”表示檢測大腸桿菌的陽性血清，“沙門”表示檢測沙門氏菌的陽性血清，“巴氏”表示檢測巴氏桿菌的陽性血清。RA血清I型、2型和10型間接血凝抗原分別檢測同型標準陽性血清，檢測到的血清抗體效價分別為211 (圖1).21° (圖2)和29 (圖
3);檢測陰性血清、空白對照均成立；檢測大腸桿菌、沙門氏菌和巴氏桿菌的陽性血清均呈現(xiàn)陰性反應。
[0021]圖4為瓊脂擴散試驗檢測RA血清I型標準陽性血清。
[0022]圖5為瓊脂擴散試驗檢測RA血清2型標準陽性血清。
[0023]圖6為瓊脂擴散試驗檢測RA血清10型標準陽性血清。
[0024]圖4-6中，RA血清I型、2型和10型抗原分別檢測同型標準陽性血清,檢測到的血清抗體效價分別為27 (圖4)、25 (圖5)和25 (圖6)。
【具體實施方式】
[0025]實施例1: 本發(fā)明涉及的檢測鴨疫里默氏桿菌(RA)血清1、2和10型抗體效價的間接血凝試劑盒中包括:
RA抗原I瓶(凍干)，-20°C凍存；
標準陽性血清I瓶(0.5ml)，-20°C凍存；
標準陰性血清I瓶(0.5ml)，-20°C凍存；
稀釋液3瓶(10ml/瓶)，4°C保存。
[0026]試劑盒可檢測40-50份血清，保存期為I年。
[0027]用來制備抗原的RA菌株為田間分離株，共3株:WF2(血清I型，2010年分離)，WF7(血清2型，2010年分離)，XY6 (血清10型，2010年分離)，保存于中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室。
[0028]本發(fā)明的試劑盒中各種試劑的制備方法是:
1.間接血凝抗原:
將WF2、WF7、XY6菌株增菌培養(yǎng)，超聲破碎后，再離心取上清，作為抗原致敏鞣酸處理后的綿羊紅細胞；
2.標準陽性血清:
將WF2、WF7、XY6菌株增菌培養(yǎng)，滅活后與佛氏佐劑混合，免疫健康新西蘭白兔，獲得高效價的血清抗體；
3.標準陰性血清:
采自健康新西蘭白兔的血清；
4.稀釋液:
PH7.2的磷酸鹽緩沖液(0.1M/L)，含1%兔血清和0.01%疊氮鈉。
[0029]本發(fā)明的試劑盒的使用方法是:
a.在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1-12孔，第8排的1-8孔各加稀釋液50μ I ；
b.在血凝板1-6排的第I孔各加I份待檢血清,每份血清50μ 1，用排槍從血凝板1-6排的第I孔開始依次往后作2倍倍比稀釋，直至第8孔，在第7排的第I孔加50 μ I標準陽性血清，依次往后作2倍倍比稀釋，至第12孔，在第8排的第I孔加50 μ I標準陰性血清，依次2倍倍比稀釋至第4孔，第5-8孔為空白對照；
c.每孔加入充分搖勻的間接血凝抗原25μI ;
d.血凝板置于微量振蕩器上振蕩1-2分鐘，充分混勻，室溫或37°C靜置1.5-2小時；
e.根據(jù)細胞凝集程度判定待檢血清效價，以出現(xiàn)50%紅細胞凝集時的血清稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗體效價。
[0030]本發(fā)明的具體實施方法為:
一、RA間接血凝抗體檢測試劑盒組成:
試劑盒中包括RA抗原I瓶(凍干)，-20°C凍存；標準陽性血清I瓶(0.5ml)，-20°C凍存；標準陰性血清I瓶(0.5ml), -20°C凍存；稀釋液3瓶(IOml/瓶)，4°C保存，試劑盒可檢測40-50份血清，保存期為I年，檢測RA血清1、2和10型血清抗體的試劑盒分別組裝。
[0031]二、RA間接血凝抗體檢測試劑盒的制備:
1.標準陽性血清的制備: 首先取出_75°C凍存的RA甘油菌WF2 (血清I型)、WF7 (血清2型)和XY6 (血清10型)，用接種環(huán)蘸取少量菌液，劃線接種于含5%綿羊血的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上，置于37°C、5% CO2箱中培養(yǎng)15-20小時，再挑取單克隆菌株接種于IOml含5%小牛血清的營養(yǎng)肉湯中，37°C，200r/min培養(yǎng)15-18小時，然后把IOml菌液轉(zhuǎn)接到200ml含5%小牛血清的營養(yǎng)肉湯中，繼續(xù)在37°C搖床中200r/min培養(yǎng)12-15小時；培養(yǎng)完畢后，將全部菌液6000r/min離心15min，用PH7.2磷酸鹽緩沖液將菌體沉淀洗滌3遍，最后用IOml緩沖液懸浮菌體，吹散混勻，作為超聲破碎用菌體；
將上述制備的RA菌液置于碎冰中，再放到超聲破碎儀中，按常規(guī)破碎程序超聲破碎20min，然后凍融I次，再超聲破碎I次，將破碎后的菌液6000r/min離心15min，取上清；測定上述制備的上清中的蛋白濃度:經(jīng)紫外分光光度計檢測，WF2、WF7和XY6菌液上清中的蛋白濃度分別為10.49mg/ml、12.43 mg/ml和11.28 mg/ml，這些上清液作為制備RA陽性血清用抗原，以及后續(xù)致敏綿羊紅細胞的抗原，凍存于_75°C備用；
將上述制備的WF2抗原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸部皮下免疫5只體重2.5公斤左右的健康新西蘭白兔，接種抗原量200 μ g/只，2周后用同等劑量的抗原(與等體積弗氏不完全佐劑混合)加強免疫I次，間隔2周后再加強免疫I次，第3次免疫后2周，兔耳靜脈采血分離血清，用瓊脂擴散試驗檢測血清抗體效價，效價達25及以上為合格陽性血清，若達不到標準，可繼續(xù)加強免疫，直至血清效價符合標準；
同時制備WF7血清2型、XY6血清10型標準陽性血清，所用的方法與制備WF2血清I型標準陽性血清的方法相同；
經(jīng)瓊脂擴散試驗檢測，所制備的RA菌株1、2和10型標準陽性血清的抗體效價均達到25及以上，符合標準。
[0032]2.標準陰性血清的制備:
選取體重2.5公斤左右的健康新西蘭白兔，頸動脈放血直至死亡，將血液收集至大離心管中，旋緊蓋子，室溫過夜，然后3000r/min離心15min，取上清即為標準陰性血清；
3.稀釋液的制備:
配制PH7.2的磷酸鹽緩沖液，即稱取206.21克Na2HPO4.12H20，30.46克KH2PO4,68克NaCl，加去離子水，定容至8000ml，高壓滅菌，冷卻后加入體積百分比為1%的兔血清和質(zhì)量體積百分比為0.01%的疊氮鈉，即為稀釋液。具體制備量可根據(jù)實際需要調(diào)整。
[0033]4.RA間接血凝抗原制備:
靜脈采集綿羊紅細胞，保存于滅菌阿氏液中，在4°C靜置3-5天后，按常規(guī)方法對細胞進行洗滌、戊二醛固定、1/40000的鞣酸處理，此過程中所用的溶液均為PH7.2的磷酸鹽緩沖液，制備好的紅細胞用PH7.2的磷酸鹽緩沖液懸浮至10%濃度；
致敏用抗原與制備標準陽性血清中所用的抗原相同，即為WF2、WF7和XY6菌液的超聲裂解上清，蛋白濃度分別為10.49mg/ml、12.43 mg/ml和11.28 mg/ml,抗原制備方法與步驟I “標準陽性血清的制備”相同；
首先確定致敏綿羊紅細胞的最佳抗原量，取制備好的10%濃度的紅細胞5份，每份5ml，取制備好的WF2菌株(血清I型)抗原，以終濃度25 μ g/ml, 50 μ g/ml, 100 μ g/ml, 150 μ g/ml, 200 μ g/ml分別致敏紅細胞，致敏時放于37°C水浴中，致敏時間為30min，期間每隔5min混勻一次，以防細胞沉淀，致敏后用PH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌4遍，再用稀釋液洗滌I遍，最后用稀釋液將紅細胞懸浮至50ml，細胞終濃度為1%。共得到5種不同終濃度的蛋白致敏的間接血凝抗原，分別標記為AG1、AG2、AG3、AG4和AG5。
[0034]檢測抗原質(zhì)量:取2塊110°血凝板，在第I塊板的第1-5排的1_12孔、第2塊板的第1-5排的1-8孔，分別加入稀釋液，50 μ I/孔，然后在第I塊板的第1-5排的第I孔，分別加入50 μ I標準陽性血清，用排槍依次往后作2倍倍比稀釋，直至第12孔，在第2塊板的第1-5排的第I孔，分別加入50 μ I標準陰性血清，用排槍依次往后作2倍倍比稀釋，直至第4孔，第5-8孔為空白對照，最后加入充分搖勻的間接血凝抗原，25 μ I/孔。2塊板的第I排均加入AG1，第2排加入AG2，第3排加入AG3，第4排加入AG4，第5排加入AG5。然后將血凝板置于微量振蕩器上振蕩1-2分鐘，充分混勻，室溫或37°C靜置1.5-2小時；
結(jié)果判定:以出現(xiàn)50%紅細胞凝集時的血清稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗體效價。
[0035]與制備WF2間接血凝抗原相同的方法，制備WF7、XY6間接血凝抗原，并檢測抗原質(zhì)量。
[0036]5種不同濃度的抗原致敏紅細胞，得到的間接血凝抗原檢測標準陽性、陰性血清的結(jié)果如表1所示。
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括: (1)鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原； (2)標準陽性血清； (3)標準陰性血清； (4)稀釋液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述制備鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原的鴨疫里默氏桿菌菌株為田間分離株，分別為血清I型WF2、血清2 型WF7和血清10型XY6。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原是將鴨疫里默氏桿菌菌株WF2、WF7和XY6進行增菌培養(yǎng)后，進行超聲破碎，再離心取上清后，作為抗原致敏鞣酸處理過的綿羊紅細胞得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原的制備方法，包括以下步驟: 1)靜脈采集綿羊紅細胞，保存于滅菌阿氏液中，在4°C靜置3-5天后，按常規(guī)方法對綿羊紅細胞進行洗滌、戊二醛固定和1/40000的鞣酸處理，所用的溶液均為PH 7.2的磷酸鹽緩沖液，制備好的綿羊紅細胞用PH7.2的磷酸鹽緩沖液懸浮至10%濃度，得到綿羊紅細胞懸液； 2)將鴨疫里默氏桿菌菌株WF2、WF7和XY6的菌液于冰浴中超聲破碎20min，然后凍融I次，再超聲破碎I次，將破碎后的菌液6000r/min離心15min，取上清，即為用于致敏綿羊紅細胞的抗原； 3)以步驟2)得到的三種用于致敏綿羊紅細胞的抗原致敏步驟I)得到的綿羊紅細胞懸液，得到鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗原，三種抗原致敏紅細胞的終濃度為50 μ g/ml-100 μ g/ml ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述標準陽性血清的制備方法為:取_75°C凍存的鴨疫里默氏桿菌甘油菌血清I型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6，用接種環(huán)蘸取菌液，劃線接種于含5%綿羊血的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上，置于37°C、5% CO2箱中培養(yǎng)15-20小時，再挑取單克隆菌株接種于IOml含5%小牛血清的營養(yǎng)肉湯中，370C，200r/min培養(yǎng)15-18小時，然后把IOml菌液轉(zhuǎn)接到200ml含5%小牛血清的營養(yǎng)肉湯中，繼續(xù)在37°C搖床中200r/min培養(yǎng)12-15小時，培養(yǎng)完畢后，將全部菌液以6000r/min離心15min，用PH7.2磷酸鹽緩沖液將菌體沉淀洗滌3遍，最后用IOml緩沖液懸浮菌體，吹散混勻，得到超聲破碎用鴨疫里默氏桿菌菌液；再將其置于碎冰中，在超聲破碎儀中，按常規(guī)破碎程序超聲破碎20min，然后凍融I次，再超聲破碎I次，將破碎后的菌液6000r/min離心15min，取上清與弗氏完全佐劑等體積混勻，免疫兔，得到分離血清，效價達25及以上即為標準陽性血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述標準陰性血清的制備方法為:收集體重2.5公斤的健康新西蘭白兔的頸動脈血，室溫過夜，再以離心轉(zhuǎn)速3000r/min離心15min，取上清即得到標準陰性血清。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述稀釋液的制備方法為:配制PH7.2的磷酸鹽緩沖液(0.1M/L)，即稱取206.21克Na2HPO4.12H20,30.46克KH2PO4,68克NaCl，加去離子水，定容至8000ml，高壓滅菌，冷卻后加入體積百分比為1%的兔血清和質(zhì)量體積百分比為0.01%的疊氮鈉，即為稀釋液。
8.如權(quán)利要求1-7任一所述的一種鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒在檢測鴨疫里默氏桿菌血清I型、血清2型和血清10型抗體效價中的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌間接血凝抗體檢測試劑盒的使用方法為: a)在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1_12孔，第8排的1_8孔各加稀釋液50μ I ； b)在血凝板1-6排的第I孔各加1份待檢血清,每份血清50μ 1，用排槍從血凝板1-6排的第I孔開始依次往后作2倍倍比稀釋，直至第8孔；在第7排的第I孔加50 μ I標準陽性血清，依次往后作2倍倍比稀釋，至第12孔；在第8排的第I孔加50 μ I標準陰性血清，依次2倍倍比稀釋至第4孔，第5-8孔為空白對照； c)每孔加入充分搖勻的間接血凝抗原25μI ; d)血凝板置于微量振蕩器上振蕩1-2分鐘，充分混勻，室溫或37°C靜置1.5-2小時； e)根據(jù)細胞凝集程度判定待檢血清效價，以出現(xiàn)50%紅細胞凝集時的血清稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗 體效價。
【文檔編號】G01N33/531GK104007269SQ201410214701
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】劉永生, 鄭福英, 宮曉煒, 陳啟偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所