一種脂肪酶檢測試劑和脂肪酶快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乳品中脂肪酶快速檢測試劑，包括A液、B液和標準品，其中標準品是甲氧基試鹵靈，A液為PBS緩沖液，B液含有熒光底物、緩沖液、乳化劑和防腐劑。本發(fā)明還公開了使用該檢測試劑快速檢測乳品中脂肪酶的方法，包括標準曲線繪制、樣品熒光值讀取和脂肪酶活計算。本發(fā)明靈敏度高，操作簡單，工作量小，系統(tǒng)誤差小，多次試驗重復(fù)性好，方便快捷，可在20～60min內(nèi)得到檢測結(jié)果。
【專利說明】一種脂肪酶檢測試劑和脂肪酶快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及屬于食品監(jiān)測領(lǐng)域，涉及一種脂肪酶檢測試劑及使用其檢測脂肪酶的快速檢測方法，特別涉及乳品如牛奶中脂肪酶的快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳制品營養(yǎng)豐富，是人類理想的營養(yǎng)食品，但同時也是微生物的良好培養(yǎng)基，屬高危險性的食品原料。在眾多微生物污染中，嗜冷菌污染是影響乳品保質(zhì)期的主要因素。嗜冷菌在牛奶原料乳低溫儲存時會大量繁殖，雖然這些菌經(jīng)過巴氏殺菌和UHT滅菌階段可以被殺死，但它們中的某些菌屬如假單胞菌屬可產(chǎn)生極其耐熱的脂肪酶，即使經(jīng)過140°C的超高溫滅菌處理，仍會有少量的殘留。這些殘留的耐熱脂肪酶在乳制品儲藏的過程中被激活，水解乳制品中的脂肪球，從而導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)發(fā)生變化，如脂肪上浮分層，出現(xiàn)苦味、腐敗味、脂肪氧化味，嚴重影響乳品品質(zhì)。消費者購買到此類問題產(chǎn)品時，也常會投訴公司產(chǎn)品質(zhì)量問題。每年因此類問題引發(fā)的產(chǎn)品質(zhì)量事故，不僅給公司帶來了巨大的經(jīng)濟損失，同時對企業(yè)品牌帶來了負面影響。快速篩查原料乳中脂肪酶酶活，控制高酶活力的原料乳進入乳制品尤其是UHT乳生產(chǎn)環(huán)節(jié)，可以有效地降低嗜冷菌大量繁殖所帶來的產(chǎn)品質(zhì)量隱患，提高整體產(chǎn)品質(zhì)量，提升公司經(jīng)濟效益。
[0003]目前對脂肪酶的檢測方法主要是采用氫氧化鈉標準溶液滴定(QB/T1803-1993)，采用橄欖油和聚乙烯醇的乳化液作為底物，檢測方法十分復(fù)雜，耗時較長，但結(jié)果變化大，容易產(chǎn)生誤差。此外脂肪酶的常見檢測方法還包括銅皂法和對硝基苯酚法。銅皂法是依據(jù)脂肪酸和Cu2+形成綠色絡(luò)合物，在710nm波長處測定吸光度來進行酶活定量，銅皂法精確度較高，但是操作繁瑣、穩(wěn)定性不高，并且由于該方法使用大量的苯進行銅皂的萃取，容易造成污染和對人體造成傷害；對硝基苯酚法采用對硝基苯酚酯作為底物，脂肪酶水解后產(chǎn)生有顏色的對硝基苯酚，在420nm波長下測定吸光度進行酶活定量，對硝基苯酚法測定酶活較低的脂肪酶時偏差較大，且對硝基苯酚有毒，不適于食品檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是針對現(xiàn)有技術(shù)方法的不足，旨在提供一種方便、快速、安全和高靈敏度的脂肪酶快速檢測試劑及其檢測方法，尤其用于檢測乳品如牛奶中的脂肪酶。
[0005]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種基于熒光方法的脂肪酶的檢測試劑，其包括A液、B液和標準品，其中
標準品是甲氧基試鹵靈；
A 液為 PBS 緩沖液，配方為:137mM NaCl, 2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4 和水，pH為 7.4;
B液含有熒光底物、緩沖液、乳化劑和防腐劑。
[0006]其中，所述熒光底物為1，2-氧-二月桂基-(±)丙三醇基-戊二酸-6 ’ -甲基-試鹵靈酯(CAS號為110033-82-4)，濃度可以為10 μ M?200 μ M，優(yōu)選50 μ M?100 μ Μ。[0007]所述B液中的緩沖液選自酒石酸緩沖液、醋酸鈉緩沖液、檸檬酸鈉緩沖液和甘氨酸緩沖液的一種或多種；乳化劑選自Tween (吐溫)20、Tween 40、Tween 60和Tween 80的一種或多種；防腐劑選自Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300和疊氮化鈉的一種或多種。
[0008]所述檢測試劑中，A液與B液的體積比優(yōu)選地可以為2:1?4:1。
[0009]在本發(fā)明中，所述檢測試劑的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)根據(jù)技術(shù)常識確定，當使用液體形式時，可采用不同濃度的標準品甲氧基試鹵靈，比如0.1?4mM，比如100 μ M。
[0010]在一個實施方案中，所述B液中的緩沖液為醋酸鈉緩沖液，乳化劑為Tween (吐溫)20，防腐劑為 Proclin 300。
[0011]所述B液中緩沖液的濃度為ImM?20mM，優(yōu)選的濃度為1.5mM?IOmM ;pH為3.0?6.0，優(yōu)選的pH為4.0?5.0。所述的乳化劑的濃度為1/5000?1/500，優(yōu)選的濃度為1/2000?1/800。所述防腐劑的濃度為1/10000?1/1000，優(yōu)選的濃度為1/5000?1/2000。
[0012]在一個實施方案中，所述B液中緩沖液的濃度為5mM，pH為4.0，乳化劑的濃度為1/1000，防腐劑的濃度為1/5000。
[0013]本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包括上述任一種方案中所述的檢測試劑。
[0014]本發(fā)明所述的檢測試劑或試劑盒，用于檢測乳品中的脂肪酶，所述乳品可以選自原料乳、巴氏乳、UHT乳、復(fù)原乳及乳粉。
[0015]在本發(fā)明中，原料乳是指從符合國家有關(guān)要求的健康奶畜乳房中擠出的無任何成分改變的常乳。巴氏乳是指僅以生牛(羊)乳為原料，經(jīng)巴氏殺菌等工序制得的液體產(chǎn)品。UHT乳是指以生牛(羊)乳為原料，添加或不添加復(fù)原乳，在連續(xù)流動的狀態(tài)下，加熱到至少132°C并保持很短時間的滅菌，再經(jīng)無菌灌裝等工序制成的液體產(chǎn)品。復(fù)原乳是指煉乳或/和全脂乳粉與水勾兌成的原料乳。乳粉是指以生牛(羊)乳為原料，經(jīng)加工制成的粉狀產(chǎn)品。
[0016]本發(fā)明還提供了一種使用前述檢測試劑檢測乳品中脂肪酶酶活的方法，其包括以下步驟:
1)將A液與B液按2:1?4:1的體積比例混合，配制成工作液C；
2)分別加入5，10，15，20μ L標準品到96孔酶標板中，每孔中再分別加入100?200 μ L工作液C，混合均勻，空白對照為對應(yīng)體積的工作液C ；
3)將酶標板放入25?37°C預(yù)熱好的熒光酶標儀中，用激發(fā)波長510?550nm，優(yōu)選520?540nm激發(fā)，在發(fā)射波長580?620nm,優(yōu)選590nm?610nm處檢測，讀取突光值，記錄為Aig,空白對照記錄為As,以標準品熒光值(Aig-As)為縱坐標(單位為RFU),以標準品的體積為橫坐標(單位為μ L)，繪制標準曲線；
4)加入2?20μ L乳品樣品到96孔酶標板中，每孔中再分別加入100?200 μ L工作液C，混合均勻，空白對照為對應(yīng)體積的工作液C ；
5)將酶標板放入25?37°C預(yù)熱好的熒光酶標儀中，用激發(fā)波長510?550nm，優(yōu)選520?540nm激發(fā)，在發(fā)射波長580?620nm,優(yōu)選590nm?610nm處檢測，讀取突光值，記錄為Al樣,空白對照記錄為Al s，孵育20?60min，優(yōu)選30?60min之后再次讀取熒光值，記錄為A2樣,空白對照記錄為A2 s ；
6)將樣本的熒光值[A#= (A2#-A2S)-(A1#-A1S)]代入標準曲線中，從標準曲線上讀出該樣品所對應(yīng)的標準品體積，帶入下述計算公式即得到樣品脂肪酶酶活；
計算公式為:
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪酶檢測試劑，其包括A液、B液和標準品，其中 標準品是甲氧基試鹵靈；
A 液為 PBS 緩沖液，配方為:137mM NaCl, 2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4 和水，pH為 7.4 ; B液含有熒光底物、緩沖液、乳化劑和防腐劑，其中熒光底物為1，2-氧-二月桂基_(±)丙三醇基-戊二酸_6’ -甲基-試鹵靈酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑，其中所述B液中的緩沖液選自:酒石酸緩沖液、醋酸鈉緩沖液、檸檬酸鈉緩沖液和甘氨酸緩沖液中的一種或多種；乳化劑選自=Tween 20、Tween 40、Tween 60和Tween 80 中的一種或多種；防腐劑選自 Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300和疊氮化鈉中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項所述的檢測試劑，其中所述熒光底物的濃度為ΙΟμΜ~200 μ Μ，優(yōu)選50μΜ~100 μ M ;Β液中的緩沖液的濃度為ImM~20mM，優(yōu)選1.5mM~IOmM ；乳化劑的濃度為1/5000~1/500，優(yōu)選1/2000~1/800。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的檢測試劑，其中所述B液中的緩沖液的pH為3.0~6.0，優(yōu)選的pH為4.0~5.0 ;防腐劑的濃度為1/10000~1/1000，優(yōu)選1/5000~1/2000。
5.根據(jù)權(quán)利要求 1-4中任一項所述的檢測試劑，用于檢測乳品中的脂肪酶，所述乳品選自原料乳、巴氏乳、UHT乳、復(fù)原乳及乳粉。
6.一種使用權(quán)利要求1-5中任一項所述的脂肪酶快速檢測試劑檢測乳品中脂肪酶酶活的方法，包括: 將A液與B液按2:1~4:1的體積比例混合，配制成工作液C ； 分別加入5，10，15，20 μ L標準品到96孔酶標板中，每孔中再分別加入100~200 μ L工作液C，混合均勻，空白對照為對應(yīng)體積的工作液C ； 將酶標板放入25~37°C預(yù)熱好的熒光酶標儀中，用激發(fā)波長510~550nm，優(yōu)選520~540nm激發(fā)，在發(fā)射波長580~620nm,優(yōu)選590nm~610nm處檢測，讀取突光值，記錄為Ag，空白對照記錄為As,以標準品的熒光值(Aig-As)為縱坐標:單位為RFU,以標準品的體積為橫坐標:單位為μ L，繪制標準曲線； 加入2~20 μ L乳品樣品到96孔酶標板中，每孔中再分別加入100~200 μ L工作液C,混合均勻； 將酶標板放入25~37°C預(yù)熱好的熒光酶標儀中，用激發(fā)波長510~550nm，優(yōu)選520~540nm激發(fā)，在發(fā)射波長580~620nm,優(yōu)選590nm~610nm處檢測，讀取突光值，記錄為Al樣’空白對照記錄為Al s，孵育20~60min，優(yōu)選30~60min之后再次讀取熒光值，記錄為A2樣，空白對照記錄為A2空； 將樣本的熒光值[A# = (A2#-A2S)-(A1#-A1S)]代入標準曲線中，從標準曲線上讀出該樣品所對應(yīng)的標準品體積，帶入下述計算公式即得到樣品脂肪酶酶活； 計算公式為:

7.試劑盒,其包括權(quán)利要求1-5中任一 項所述的檢測試劑。
【文檔編號】G01N21/64GK103983626SQ201410215727
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】周娟作 申請人:周娟作, 金京華, 鄭朋, 周越, 王江云