Cyp6aa9作為蚊對(duì)溴氰菊酯抗性檢測(cè)靶標(biāo)的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了CYP6AA9作為蚊對(duì)溴氰菊酯抗性檢測(cè)靶標(biāo)的應(yīng)用。采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定待測(cè)品系CYP6AA9蛋白的OD值大于敏感品系OD值的1.18倍時(shí)，可認(rèn)為待測(cè)品系對(duì)溴氰菊酯具有抗性。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)蚊對(duì)溴氰菊酯抗性檢測(cè)的靶標(biāo)，對(duì)于蚊溴氰菊酯抗性的早期發(fā)現(xiàn)和治理具有重要價(jià)值。
【專利說(shuō)明】CYP6AA9作為蚊對(duì)溴氰菊酯抗性檢測(cè)靶標(biāo)的應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及CYP6AA9作為蚊對(duì)溴氰菊酯抗性檢測(cè)靶標(biāo)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蚊可以傳播瘧疾、登革熱、黃熱病、絲蟲病等多種蚊媒病，嚴(yán)重危害人類健康?？刂莆妹綄?duì)于預(yù)防蚊媒病具有重要意義?；瘜W(xué)防治一直作為蚊媒控制策略中的主要方法。但隨之產(chǎn)生的抗藥性成為蚊媒病控制的最大障礙。早期發(fā)現(xiàn)并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蚊現(xiàn)場(chǎng)種群對(duì)不同殺蟲劑的抗性水平，是蚊抗藥性治理的前提。尋找有效的抗藥性檢測(cè)靶標(biāo)對(duì)于抗藥性治理具有非常重要意義。目前，擬除蟲菊酯類殺蟲劑，如溴氰菊酯，是應(yīng)用最為廣泛的一類殺蟲劑，但由于缺乏相關(guān)的抗藥性檢測(cè)靶標(biāo)，所以相應(yīng)的分子生物學(xué)和免疫學(xué)測(cè)定方法至今尚未建立。因此，蚊擬除蟲菊酯類抗性檢測(cè)方法的建立一直是媒介防治研究的熱點(diǎn)課題。
[0003]細(xì)胞色素P450超家族(Cytochrome P450proteins，CYP)主要參與生物體內(nèi)源性物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化及外源性化合物的活化與降解等重要生理過(guò)程。有研究證實(shí)昆蟲體內(nèi)CYP參與殺蟲劑的代謝，是昆蟲對(duì)殺蟲劑(尤其是擬除蟲菊酯類殺蟲劑)產(chǎn)生高水平抗性的主要原因。昆蟲體內(nèi)CYP種類呈現(xiàn)多樣性，根據(jù)氨基酸同源性分析，可分為CYP4、CYP6、CYP9、CYP12等67個(gè)家族，其中CYP6家族被證實(shí)與外源性物質(zhì)代謝有關(guān)，因此與殺蟲劑抗性的關(guān)系也最為密切。本發(fā)明中的抗藥性檢測(cè)靶標(biāo)CYP6AA9蛋白屬于CYP6家族，在本實(shí)驗(yàn)室溴氰菊酯抗性品系中高表達(dá)，可能參與了蚊抗藥性的產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供CYP6AA9蛋白的新用途。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:CYP6AA9蛋白作為蚊對(duì)溴氰菊酯抗性檢測(cè)靶標(biāo)的應(yīng)用。
[0006]
【發(fā)明者】根據(jù)CYP6AA9基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成實(shí)時(shí)定量PCR引物，并利用實(shí)時(shí)定量PCR方法比較了 CYP6AA9基因在敏感品系DS和抗性品系DR2中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP6AA9基因在DR2品系中高表達(dá)，為DS品系中的23.65倍，提示CYP6AA9基因與蚊擬除蟲菊酯抗性相關(guān)。
[0007]針對(duì)CYP6AA9蛋白的氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成了 2個(gè)肽段，經(jīng)多次免疫新西蘭大白兔，成功制備CYP6AA9蛋白的多克隆抗體。
【發(fā)明者】進(jìn)一步通過(guò)Western blot方法顯示CYP6AA9蛋白在DR2品系中的表達(dá)量高于DS品系，證實(shí)CYP6AA9蛋白與蚊擬除蟲菊酯抗性相關(guān)。
[0008]基于CYP6AA9蛋白，
【發(fā)明者】采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定了 DS品系、DR1品系和DR2品系中CYP6AA9蛋白的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DR1品系和DR2品系的OD值分別是DS品系OD值的1.18倍和1.79倍。
[0009]本發(fā)明公開了測(cè)定淡色庫(kù)蚊CYP6AA9蛋白的表達(dá)量來(lái)判斷蚊對(duì)溴氰菊酯的抗性。具體是:選取國(guó)內(nèi)通用的淡色庫(kù)蚊敏感品系(LC5tl為0.02mg/L)作為參照，通過(guò)雙抗體夾心ELISA法測(cè)定待測(cè)品系和敏感品系中CYP6AA9的表達(dá)量，當(dāng)待測(cè)品系OD值大于敏感品系OD值的1.18倍以上時(shí)，即可認(rèn)定待測(cè)品系對(duì)溴氰菊酯具有抗性。
[0010]本發(fā)明提供了一種新的淡色庫(kù)蚊擬除蟲菊酯抗性檢測(cè)的靶標(biāo)，對(duì)于檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)種群的抗性水平及抗藥性治理具有重要價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1實(shí)時(shí)定量PCR方法比較CYP6AA9基因在DS品系和DR2品系雌蚊中的表達(dá)。
[0012]圖2Western blot方法比較CYP6AA9蛋白在DS品系和DR2品系雌蚊中的表達(dá)。
[0013]圖3雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)CYP6AA9蛋白在DS品系、DR1品系和DR2品系雌蚊中的表達(dá)。
[0014]除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，一般為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
[0015]下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0016]在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0017]實(shí)施例1CYP6AA9基因在DR2品系雌蚊中表達(dá)量高于DS品系。
[0018]本發(fā)明中使用的淡色庫(kù)蚊敏感品系(DS品系)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)，期間未接觸任何殺蟲劑，經(jīng)幼蟲浸潰法測(cè)定其對(duì)溴氰菊酯的半數(shù)致死濃度(LC5tl)為0.02mg/L，符合國(guó)內(nèi)通用的敏感品系標(biāo)準(zhǔn)，且該品系使用情況已經(jīng)在國(guó)際雜志上公開發(fā)表(SunY, Zou P, Yu XY, Chen C，Yu J, et al.(2012)Functional characterization of anarrestin gene on insecticide resistance of Culex pipiens pallens.ParasitVectors5:134)(Hong S, Zhou D, Chen C, Wang ff, Lv Y, et al.(2013)Ribose-phosphatepyrophosphokinasel(PRPSl) associated with deltamethrin resistance in Culexpipiens pallens.Parasitol Resll2:847_854.)?？剐云废?DR1 和 DR2 是由 DS 品系在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)一定濃度溴氰菊酯篩選至第18代和32代，測(cè)定其對(duì)溴氰菊酯的LC5tl分別為0.1Smg/L 和 0.85mg/L。
[0019]
【發(fā)明者】根據(jù)CYP6AA9基因的核苷酸序列(NCBI ID:ΧΜ_001847353)，設(shè)計(jì)合成實(shí)時(shí)定量 PCR 引物，序列如下:F5’ GCTGGCAGTTCATGGTGGT3，(SEQ ID N0.1)和 R5’ AGACGATAGCTGATAGGGTTGGT3’ (SEQ ID N0.2);并以淡色庫(kù)蚊 β -actin 基因(NCBI ID:AY100005)作為內(nèi)參，其引物序列如下:F5’AGCGTGAACTGACGGCTCTTG3’ (SEQ ID N0.3)和R5’ ACTCGTCGTACTCCTGCTTGG3’ (SEQ ID N0.4)。分別提取 DS 品系和 DR2 品系雌蚊(羽化后2?3d)階段的總RNA。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法比較CYP6AA9基因在DS品系和DR2品系中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP6AA9基因在DR2品系中高表達(dá)，表達(dá)量為DS品系中的23.65倍(Ρ〈0.05)(圖1)。
[0020]實(shí)施例2CYP6AA9蛋白在DR2品系雌蚊中表達(dá)量高于DS品系。
[0021 ]
【發(fā)明者】針對(duì)CYP6AA9蛋白的氨基酸序列(NCBI ID:ΧΡ_001847405)，設(shè)計(jì)合成 2 個(gè)肽段，序列如下:肽段 1NH2-DPDIYPNPSQFDPDRC-C0NH2 (SEQ ID N0.5)和肽段2NH2-RNVPHEPGQFPMGSLC-C0NH2 (SEQ ID N0.6)。根據(jù)獲得的2個(gè)肽段，分別經(jīng)多次免疫新西蘭大白兔，成功制備了 2種CYP6AA9多克隆抗體，分別命名為:CYP6AA9-1和CYP6AA9-2抗體。
【發(fā)明者】分別提取了 DS品系和DR2S系雌蚊(羽化后2?3d)階段的總蛋白，并通過(guò)Western blot方法進(jìn)一步比較了 CYP6AA9蛋白在DS品系和DR2品系雌蚊中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP6AA9蛋白在DR2品系中明顯高表達(dá)(圖2)。
[0022]實(shí)施例3CYP6AA9蛋白可作為蚊抗藥性檢測(cè)的靶抗原。
[0023]
【發(fā)明者】分別提取了 DS品系、DR1品系和DR2品系雌蚊(羽化后2?3d)階段的總蛋白，并稀釋至相同蛋白質(zhì)濃度4 μ g/μ I。對(duì)實(shí)施例2中獲得的CYP6AA9-1抗體進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(用作酶標(biāo)抗體)。通過(guò)雙抗體夾心ELISA法測(cè)定DS品系、DR1品系和DR2品系中CYP6AA9蛋白的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP6AA9蛋白在DR1品系和DR2品系中的讀值為DS 品系中的 1.18 倍(Ρ〈0.05)和 1.79 倍(Ρ〈0.05)(圖 3)。
【權(quán)利要求】
1.CYP6AA9作為蚊對(duì)溴氰菊酯抗性檢測(cè)靶標(biāo)的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，具體方法是:通過(guò)檢測(cè)雌蚊中CYP6AA9表達(dá)量來(lái)判斷蚊對(duì)溴氰菊酯的抗性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于具體是:采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)待測(cè)品系CYP6AA9蛋白的OD值大于敏感品系OD值的1.18倍時(shí)，待測(cè)品系對(duì)漠氰!菊醋具有抗性。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103969448SQ201410217550
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】沈波, 王衛(wèi)杰, 呂園, 方福瑾, 過(guò)琴, 孫立新, 楊慶貴, 周丹, 張東輝, 孫艷, 馬磊, 朱昌亮 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)