一種測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置與方法，裝置包括96孔板以及與96孔板相匹配的蓋子，所述蓋子上分布有192孔，蓋子上每?jī)蓚€(gè)孔對(duì)應(yīng)96孔板上的一個(gè)孔，所述兩個(gè)孔為不同內(nèi)徑的圓柱形的孔，內(nèi)徑較大的孔對(duì)應(yīng)96孔板每個(gè)孔的中央，粘結(jié)有中空纖維膜；內(nèi)徑較小的孔位于中央孔的旁邊。該裝置用于測(cè)定化合物油水分配系數(shù)集中空纖維膜液相微萃取的優(yōu)勢(shì)與96孔板的特點(diǎn)于一體，既有中空纖維膜液相微萃取本身的基本優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)單、成本低、綠色環(huán)保，又有96孔板高通量的特點(diǎn)。本發(fā)明就是將96孔板與該方法相結(jié)合實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)定化合物的油水分配系數(shù)，從而大大提高藥物研發(fā)中藥物篩選的效率。
【專利說(shuō)明】一種測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，具體的說(shuō)涉及一種高通量測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著組合化學(xué)等技術(shù)的出現(xiàn)與不斷發(fā)展，每年產(chǎn)生成千上萬(wàn)個(gè)藥物候選化合物，這些化合物都需要經(jīng)過(guò)篩選才能最終成為藥物。而藥物篩選過(guò)程是極其復(fù)雜的，不僅要考慮所篩選出的化合物是否對(duì)相應(yīng)的作用靶點(diǎn)具有較高的生理活性，而且要考慮化合物的理化性質(zhì)，主要是其在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄及毒性等。因此，在藥物的高通量篩選中，需要對(duì)大量化合物進(jìn)行理化分析測(cè)試，其中包括化合物的溶解度、滲透性、蛋白結(jié)合率、油水分配系數(shù)的測(cè)定等。藥物的油水分配系數(shù)被定義為藥物在正辛醇和水之間的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)，通常被用作表征藥物親脂性的參數(shù)。藥物的親脂性是藥物的一個(gè)重要的理化性質(zhì)，它與藥物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程包括吸收、分布、代謝、排泄和毒理學(xué)，甚至和血腦屏障滲透性及藥物的清除都有重要的關(guān)系。
[0003]目前，測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的方法很多，包括搖瓶法、色譜法、中空纖維膜液相微萃取法等，其中，經(jīng)典方法為搖瓶法，常用方法為色譜法。搖瓶法雖然是最簡(jiǎn)單和常用的方法，但這種方法費(fèi)事、費(fèi)力，要求樣品有較高的純度和良好的穩(wěn)定性，并且在測(cè)定中會(huì)需消耗大量的有機(jī)試劑。另外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有機(jī)相和水相在震搖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致兩相在分離時(shí)不徹底會(huì)從而出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。測(cè)定油水分配系數(shù)的色譜法，包括薄層色譜法、反相高效液相方法、親水反應(yīng)色譜法、逆流色譜法和微乳電動(dòng)色譜法。這些方法都是基于建立化合物的保留特點(diǎn)與已知油水分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)值的一系列化合物的色譜系統(tǒng)的關(guān)系|吳型。
[0004]以上這些方法操作繁瑣且不容易實(shí)現(xiàn)高通量，而中空纖維膜微萃取方法是將微升體積的正辛醇置于中空纖維膜中后放在化合物水溶液中萃取，只需要測(cè)定化合物在正辛醇相和水相中分配平衡時(shí)的濃度即可計(jì)算出藥物的油水分配系數(shù)。另外，中空纖維膜將兩相隔開(kāi)，避免了萃取過(guò)程中的乳化現(xiàn)象進(jìn)而防止因乳化導(dǎo)致兩相難以徹底分離而出現(xiàn)測(cè)定結(jié)果誤差較大的弊端。但是現(xiàn)在中空纖維膜液相微萃取技術(shù)的通量不高，傳統(tǒng)的中空纖維膜液相微萃取測(cè)定化合物的油水分配系數(shù)時(shí)一次只能測(cè)定一個(gè)樣品，不能滿足化合物篩選高通量的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種高通量測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置和方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的方法操作繁瑣且不容易實(shí)現(xiàn)高通量的問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]一種測(cè)定化合物的油水分配系數(shù)的裝置，包括96孔板以及與96孔板相匹配的蓋子，所述蓋子上分布有192孔，蓋子上每?jī)蓚€(gè)孔對(duì)應(yīng)96孔板上的一個(gè)孔，所述兩個(gè)孔為不同內(nèi)徑的圓柱形的孔，內(nèi)徑較大的孔對(duì)應(yīng)96孔板每個(gè)孔的中央，粘結(jié)有中空纖維膜；內(nèi)徑較小的孔位于中央孔的旁邊。
[0008]所述中空纖維膜是由一定機(jī)械強(qiáng)度的并且與有機(jī)試劑相容性好的各種疏水性材質(zhì)，可以是聚丙烯、聚醚砜、聚四氟乙烯或聚偏氟乙烯。所述中空纖維膜長(zhǎng)度為lcm-4.5cm。
[0009]所述蓋子為有一定機(jī)械強(qiáng)度的各種材質(zhì)的塑料，可以為聚丙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚苯乙烯或聚苯硫醚。
[0010]所述96孔板為圓孔板或方孔板。
[0011]一種測(cè)定化合物的油水分配系數(shù)的方法，包括下列步驟:
[0012](I)將測(cè)定化合物的油水分配系數(shù)的裝置蓋子上懸掛的96根中空纖維膜對(duì)應(yīng)著插入96孔板的各孔中，使蓋子緊密地蓋在96孔板上；
[0013](2)通過(guò)蓋子上的小孔徑的孔往96孔板的孔內(nèi)加入化合物水溶液；
[0014](3)通過(guò)蓋子上的粘結(jié)有中空纖維膜的孔向膜內(nèi)加入水飽和的正辛醇，萃取開(kāi)始;
[0015](4)當(dāng)萃取達(dá)到平衡后，直接用微量進(jìn)樣器分別取出膜內(nèi)正辛醇和孔板內(nèi)的樣品溶液，用高效液相色譜法測(cè)定其濃度；
[0016](5)根據(jù)測(cè)得水相和正辛醇相中化合物的濃度按照公式計(jì)算出化合物的log D值。
[0017]所述步驟(4)中萃取平衡時(shí)間為300min以上。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明的裝置及方法操作簡(jiǎn)單、成本低、只需要消耗微升體積的有機(jī)溶劑。該裝置是高通量測(cè)定裝置，能夠同時(shí)測(cè)定多種化合物。
[0019]該裝置用于測(cè)定油水分配系數(shù)集中空纖維膜液相微萃取的優(yōu)勢(shì)與96孔板的特點(diǎn)于一體，既有中空纖維膜液相微萃取本身的基本優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)單、成本低、綠色環(huán)保，又有96孔板高通量的特點(diǎn)。本發(fā)明就是將96孔板與該方法相結(jié)合實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)定化合物的油水分配系數(shù)，從而大大提高藥物研發(fā)中藥物篩選的效率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為本發(fā)明裝置的剖面圖；
[0021]圖2為掛有96根中空纖維膜的96孔板蓋子正面結(jié)構(gòu)不意圖；
[0022]圖3為蓋子與96孔板結(jié)合在一起的示意圖；
[0023]圖4為96孔板示意圖；
[0024]圖5為96孔板配套的蓋子背面結(jié)構(gòu)示意圖；
[0025]圖6為96孔板高通量裝置測(cè)得的八種化合物的log D (pH7.4)與文獻(xiàn)參考值的擬合；
[0026]其中，1-蓋子；2_小孔道；3_大孔道；4_中空纖維膜；5_96孔板；6_96孔板的一個(gè)孔。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0028]本發(fā)明的裝置主要由兩大部分組成，上面是掛有中空纖維膜的蓋子，下面為96孔板。為了同時(shí)使用96根中空纖維膜用于測(cè)定并且與96孔板相匹配，我們?cè)O(shè)計(jì)了能夠同時(shí)懸掛96根中空纖維膜并且與96孔板匹配的蓋子。其正面如圖2，背面如圖5。蓋子可以為有一定機(jī)械強(qiáng)度的各種材質(zhì)的塑料，包括聚丙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚苯乙烯、聚苯硫醚。在蓋子上均勻分布著192孔，96孔板每個(gè)孔對(duì)應(yīng)的部位都有兩個(gè)不同內(nèi)徑的圓柱形的孔。其中，內(nèi)徑較大的孔位于96孔板每個(gè)孔的中央，用來(lái)粘結(jié)中空纖維膜并充當(dāng)往膜內(nèi)加入或吸出溶液的通道；而內(nèi)徑較小的孔位于中央孔的旁邊，用作往96孔板內(nèi)加入或吸出溶液的通道。整個(gè)裝置在使用時(shí)，蓋子和96孔板是緊密扣在一起的，其剖面圖如圖1。
[0029]中空纖維膜液相微萃取的過(guò)程是膜外水溶液中的化合物通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散穿過(guò)中空纖維膜進(jìn)入膜內(nèi)的過(guò)程，膜的性能會(huì)直接影響化合物進(jìn)入膜內(nèi)所需的時(shí)間，因此，中空纖維膜的選擇對(duì)萃取效率影響較大，裝置所用的中空纖維膜是該技術(shù)的核心部分。該裝置使用的中空纖維膜可以是由一定機(jī)械強(qiáng)度的并且與有機(jī)試劑相容性好的各種疏水性材質(zhì)，如聚丙烯、聚醚砜、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等。組裝裝置前，需要將中空纖維膜剪成長(zhǎng)度Icm到
4.5cm的小段，并將膜的一端熱封，然后將另一端粘接到蓋子相應(yīng)的孔上。
[0030]中空纖維膜液相微萃取是依據(jù)分子間相似相容的原理，化合物在兩相之間存在化學(xué)勢(shì)差，化合物在化學(xué)勢(shì)差的驅(qū)動(dòng)下被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入化學(xué)勢(shì)低的一相，直至化學(xué)勢(shì)相等。其動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)是化合物在有機(jī)相中的濃度從零開(kāi)始逐漸增加直至萃取達(dá)到平衡，有機(jī)相中化合物濃度不再隨時(shí)間變化?；衔锏挠退峙湎禂?shù)值由平衡時(shí)間點(diǎn)時(shí)化合物在兩相中的濃度計(jì)算出來(lái)的，所以化合物的平衡時(shí)間長(zhǎng)短是決定實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)短的主要依據(jù)。我們測(cè)定了舒必利、法莫替丁、甲硝唑、對(duì)乙酰氨基酚和醋酸地塞米松五種不同親脂性的藥物在正辛醇中的濃度-時(shí)間曲線，并觀察了它們的平衡時(shí)間，結(jié)果五種藥物的平衡時(shí)間在210min到300min不等，因此，我們可以推斷，絕大部分藥物在萃取300min后都能達(dá)到萃取平衡，我們沒(méi)有必要去繪制每個(gè)化合物的濃度-時(shí)間曲線去尋找其平衡點(diǎn)。這提供了 96孔板高通量裝置在同時(shí)測(cè)定多種未知化合物的油水分配系數(shù)我們何時(shí)取膜內(nèi)外兩相樣品去定量。
[0031]為了驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的裝置測(cè)定油水分配系數(shù)的重復(fù)性和準(zhǔn)確度。我們以甲硝唑?yàn)槭茉囁幬飳?duì)96孔板高通量裝置測(cè)定藥物log D(pH7.4)值進(jìn)行了精密度考察。日內(nèi)精密度考察實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了平行六組結(jié)果并計(jì)算RSD值。日間精密度考察實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了連續(xù)三天并計(jì)算RSD值。結(jié)果日內(nèi)和日間精密度為-8.9%和-4.4%，說(shuō)明中空纖維膜液相微萃取方法測(cè)定log D值精密度良好。為了考察96孔板高通量裝置測(cè)定log D值的準(zhǔn)確度，我們測(cè)定了舒必利、法莫替丁、甲硝唑、對(duì)乙酰氨基酚和醋酸地塞米松五種藥物的log D(pH7.4)值并將測(cè)得值與文獻(xiàn)查得的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性擬合。結(jié)果該裝置測(cè)定五種藥物的油水分配系數(shù)的測(cè)得值與文獻(xiàn)參考值相關(guān)擬合的相關(guān)系數(shù)為0.9908，接近1，說(shuō)明該方法測(cè)定準(zhǔn)確度較高。
[0032]實(shí)施例
[0033]應(yīng)用該裝置同時(shí)測(cè)定了具有不同油水分配系數(shù)的八種化合物(諾氟沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氟康唑、磺胺甲噁唑)的log D(pH7.4)對(duì)該裝置進(jìn)行應(yīng)用。為了考察裝置的精密度，設(shè)計(jì)每個(gè)藥物平行測(cè)定十二次，每種藥物隨機(jī)分配在96孔板的任意一排中，總共96個(gè)樣品，具體的操作步驟如下:
[0034]1、在實(shí)驗(yàn)之前將中空纖維膜液相微萃取高通量裝置安裝好；
[0035]2、通過(guò)蓋子上的小孔徑的孔往96孔板的孔內(nèi)加入1.8mL的藥物水溶液；
[0036]3、通過(guò)蓋子上的粘結(jié)有中空纖維膜的孔向膜內(nèi)加入50 μ L水飽和的正辛醇，萃取開(kāi)始；
[0037]4、當(dāng)萃取達(dá)到平衡后，直接用微量進(jìn)樣器分別取出膜內(nèi)正辛醇和孔板內(nèi)的樣品溶液，用高效液相色譜法測(cè)定其濃度；
[0038]5、根據(jù)測(cè)得水相和正辛醇相中藥物的濃度按照公式計(jì)算出藥物的log D值。
[0039]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。將測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)參考值擬合以考察裝置的準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)圖6。
[0040]表1 96孔板裝置測(cè)定藥物的log D (pH7.4)值與文獻(xiàn)參考值的對(duì)比
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置，包括96孔板以及與96孔板相匹配的蓋子，其特征在于，所述蓋子上分布有192孔，蓋子上每?jī)蓚€(gè)孔對(duì)應(yīng)96孔板上的一個(gè)孔，所述兩個(gè)孔為不同內(nèi)徑的圓柱形的孔，內(nèi)徑較大的孔對(duì)應(yīng)96孔板每個(gè)孔的中央，粘結(jié)有中空纖維膜；內(nèi)徑較小的孔位于中央孔的旁邊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置，其特征在于，所述中空纖維膜是由一定機(jī)械強(qiáng)度的并且與有機(jī)試劑相容性好的各種疏水性材質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置，其特征在于，所述中空纖維膜材質(zhì)為聚丙烯、聚醚砜、聚四氟乙烯或聚偏氟乙烯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置，其特征在于，所述中空纖維膜長(zhǎng)度為lcm-4.5cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置，其特征在于，所述蓋子為有一定機(jī)械強(qiáng)度的各種材質(zhì)的塑料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置，其特征在于，所述蓋子材質(zhì)為聚丙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚苯乙烯或聚苯硫醚。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的裝置，其特征在于，所述96孔板為圓孔板或方孔板。
8.一種測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的方法，其特征在于包括下列步驟: (1)將權(quán)利要求1所述裝置蓋子上懸掛的96根中空纖維膜對(duì)應(yīng)著插入96孔板的各孔中，使蓋子緊密地蓋在96孔板上； (2)通過(guò)蓋子上的小孔徑的孔往96孔板的孔內(nèi)加入化合物水溶液； (3)通過(guò)蓋子上的粘結(jié)有中空纖維膜的孔向膜內(nèi)加入水飽和的正辛醇，萃取開(kāi)始； (4)當(dāng)萃取達(dá)到平衡后，直接用微量進(jìn)樣器分別取出膜內(nèi)正辛醇和孔板內(nèi)的樣品溶液，用高效液相色譜法測(cè)定其濃度； (5)根據(jù)測(cè)得水相和正辛醇相中化合物的濃度按照公式計(jì)算出藥物的logD值。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的方法，其特征在于，所述步驟(4)中萃取平衡時(shí)間為300min以上。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK104007200SQ201410236069
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】李優(yōu)鑫, 包建民, 劉曉靜 申請(qǐng)人:天津大學(xué)