一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應用，用以進行朊蛋白研究；該具體過程為：步驟a，準備用于免疫和篩選的朊蛋白抗原；步驟b，骨髓瘤細胞SP2/0的準備；步驟c，動物免疫與細胞融合；步驟d，陽性雜交瘤細胞的篩選與腹水單抗制備；步驟e，單抗成份鑒定；步驟f，單抗應用。本發(fā)明中，制備的單抗只與羊腦組織中的PrPC(Ov-PrPC)反應，不與牛腦組織中的PrPC(Bo-PrPC)反應，能夠?qū)Σ煌锓N朊蛋白進行鑒別。
【專利說明】一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因檢測領域，尤其涉及一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]傳染性海綿狀腦病(TransmissibleSpongiform Encephalopathies, TSE),又稱月元毒體病，是感染人和動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類慢性、退化性、致死性疾病。引起TSE的蛋白質(zhì)稱為朊蛋白(Prion)，分為細胞型(PrPC)和致病型(PrPSc)。
[0003]TSE是由于PrPC轉(zhuǎn)變成PrPSc所致。該病除了可以在物種內(nèi)傳播外，目前已知羊癢病病原PrPSc可誘導牛的PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，引起瘋牛?。慌５腜rPSc可以誘導人的PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，弓丨起人的新型克雅氏癥，但是該病的跨物種傳播以及PrPC和PrPSc之間的轉(zhuǎn)變機制并不清楚，朊蛋白的特異性單抗在該病的研究中發(fā)揮了重要的作用。例如，Brun等制備的單抗2A11能檢測到IHC中PK酶(Protease K)消化后的PrP27_30，但檢測不到未經(jīng)PK酶消化的PrPSc和正常牛腦切片中的PrPC，揭示了 2A11的結(jié)合位點位于PrPSc和PrPC內(nèi)部，經(jīng)PK酶消化后暴露在了 PrPSc表面，該發(fā)現(xiàn)對于朊蛋白高級結(jié)構的研究具有促進作用。 [0004]本發(fā)明創(chuàng)作者利用發(fā)明的方法制備了一株能鑒別牛羊朊蛋白的單克隆抗體并進行了應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應用，用以進行研究朊蛋白研究。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的制備方法，該具體過程為:
[0007]步驟a，準備用于免疫和篩選的朊蛋白抗原；
[0008]步驟b，骨髓瘤細胞SP2/0的準備；
[0009]步驟C，動物免疫與細胞融合；
[0010]步驟d，陽性雜交瘤細胞的篩選與腹水單抗制備；
[0011]步驟e,單抗成份鑒定；
[0012]步驟f,單抗應用。
[0013]進一步，在上述步驟a中，重組表達牛和羊PrPC核心片段，以羊PrPC核心片段作為用于免疫的朊蛋白抗原。以牛和羊PrPC核心片段作為篩選包被抗原。
[0014]進一步，在上述步驟b中，細胞融合前一周復蘇凍存于液氮中的SP2/0，在20%小牛血清HT培養(yǎng)基和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察生長狀況，融合前調(diào)整至對數(shù)生長期。
[0015]進一步，在上述步驟c中，將步驟a中制備的羊朊蛋白抗原與等量弗氏完全佐劑充分乳化后，在其腹部皮下多點注射6周齡PrP基因敲除小鼠，20 μ g/只；2周后腹部皮下多點注射相同劑量弗氏不完全佐劑充分乳化的朊蛋白抗原；14d后腹腔追加注射5μ g朊蛋白抗原，3d后無菌取脾臟進行細胞融合。
[0016]進一步，在上述步驟d中，采用間接ELISA方法對長有雜交瘤細胞的孔進行篩選，以純化的重組牛和羊PrPC核心片段為包被抗原分別包板；
[0017]檢測羊PrPC核心片段為陽性同時牛PrPC核心片段為陰性的孔，進行24孔板擴大培養(yǎng)；檢測仍符合上述條件的孔，采用有限稀釋法進行2次亞克??；取形態(tài)良好，生長旺盛的單克隆細胞6孔板擴大培養(yǎng)，一部分用于液氮凍存，另一部分用于單抗腹水的生產(chǎn)；取青壯年Balb/c小鼠，制備腹水單抗。
[0018]進一步，在上述步驟e中，比較牛、羊PrPC核心片段氨基酸序列，找出兩者存在差異的位置，以此位置為中心，人工合成10肽，以16 μ g/mL分別溶于CBS (pH9.6)，每孔加入100 μ L溶液，37 °C孵育2h，5 %脫脂乳4°C封閉過夜；
[0019]包被好的ELISA板與所得單抗進行標準ELISA反應，檢測所得單抗的特異性抗原結(jié)合位點，所述單克隆抗體的抗原結(jié)合位點為羊朊蛋白208位的異亮氨酸，該位點羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸；比較不同物種該位點的氨基酸，確定所得單抗與哪些物種PrPC核心片段能夠結(jié)合，與哪些物種PrPC核心片段不結(jié)合。
[0020]本發(fā)明還提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體，所述單克隆抗體的抗原結(jié)合位點為羊朊蛋白208位的異亮氨酸，該位點羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸，該單抗只與羊PrPC反應，不與牛PrPC反應。
[0021]本發(fā)明還提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的應用，取健康牛、羊腦組織勻漿、離心處理后， 進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5%脫脂奶4°C封閉過夜，TBST洗滌5次，3min/次；加入腹水單抗1.5h，TBST洗滌10次，3min/次；加入生物素標記二抗lh，TBST洗滌6次，3min/次，采用化學發(fā)光法進行X底片曝光。
[0022]與現(xiàn)有技術相比較本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明中，用羊PrPC核心片段免疫PrP基因敲除小鼠，然后采用常規(guī)方法制備單抗，然后用牛、羊PrPC核心片段同時對雜交瘤細胞進行篩選，容易獲得針對某一物種特異性的單抗；本發(fā)明中獲得的單抗，其抗原結(jié)合位點為羊朊蛋白208位的異亮氨酸。經(jīng)過比對分析Genbank上公布的牛羊朊蛋白氨基酸序列，該位點羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸，因此該單抗的特異性識別位點為208位異亮氨酸，該單抗只與羊PrPC反應，不與牛PrPC反應，通過分析某物種該位點的氨基酸，可以確定所得單抗能否與該物種朊蛋白反應，其能夠?qū)Σ煌锓N朊蛋白進行鑒別。
【具體實施方式】
[0023]以下，對本發(fā)明上述的和另外的技術特征和優(yōu)點作更詳細的說明。
[0024]本發(fā)明制備鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體及應用，所用試劑包括弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、高糖型DMEM粉、融合用PEG(MW4000);次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨基喋呤。
[0025]該具體過程為:
[0026]步驟a，重組表達牛和羊PrPC核心片段，以羊PrPC核心片段作為用于免疫的朊蛋白抗原。以牛和羊PrPC核心片段作為篩選包被抗原。
[0027]步驟b，細胞融合前一周復蘇凍存于液氮中的SP2/0，在20%小牛血清HT培養(yǎng)基和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察生長狀況，融合前調(diào)整至對數(shù)生長期。
[0028]步驟C，將步驟a中制備的羊朊蛋白抗原與等量弗氏完全佐劑充分乳化后，在其腹部皮下多點注射6周齡PrP基因敲除小鼠，20μ g/只；2周后腹部皮下多點注射相同劑量弗氏不完全佐劑充分乳化的朊蛋白抗原；14d后腹腔追加注射5yg朊蛋白抗原，3d后無菌取脾臟進行細胞融合。
[0029]步驟d，采用間接ELISA方法對長有雜交瘤細胞的孔進行篩選，以純化的重組牛和羊PrPC核心片段為包被抗原分別包板；
[0030]檢測羊PrPC核心片段為陽性同時牛PrPC核心片段為陰性的孔，進行24孔板擴大培養(yǎng)；檢測仍符合上述條件的孔，采用有限稀釋法進行2次亞克隆；取形態(tài)良好，生長旺盛的單克隆細胞6孔板擴大培養(yǎng)，一部分用于液氮凍存，另一部分用于單抗腹水的生產(chǎn)；取青壯年Balb/c小鼠，制備腹水單抗。
[0031]步驟e，比較牛、羊PrPC核心片段氨基酸序列，找出兩者存在差異的位置，以此位置為中心，人工合成10肽，以16 μ g/mL分別溶于CBS (pH9.6)，每孔加入100^溶液，371:孵育2h，5%脫脂乳4°C封閉過夜；
[0032]包被好的ELISA板與所得單抗進行標準ELISA反應，檢測所得單抗的特異性抗原結(jié)合位點。比較不同物種該位點的氨基酸，確定所得單抗與哪些物種PrPC核心片段能夠結(jié)合，與哪些物種PrPC核心片段不結(jié)合。
[0033]本發(fā)明鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的應用過程為:取健康牛、羊腦組織勻漿、離心處理后，進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5%脫脂奶4°C封閉過夜，TBST洗滌5次，3min/次；加入腹水 單抗1.5h，TBST洗滌10次，3min/次；加入生物素標記二抗lh，TBST洗滌6次，3min/次，采用化學發(fā)光法進行X底片曝光。
[0034]本發(fā)明所得到的單抗只與羊腦組織中的PrPC(Ov-PrPC)反應，不與牛腦組織中的PrPC(Bo-PrPC)反應，并確定單抗其抗原結(jié)合位點為羊朊蛋白208位的異亮氨酸。經(jīng)過比對分析Genbank上公布的牛羊朊蛋白氨基酸序列，該位點羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸，因此該單抗只與羊PrPC反應，不與牛PrPC反應，通過分析某物種該位點的氨基酸，可以確定本單抗能否與該物種朊蛋白反應，其能夠?qū)Σ煌锓N朊蛋白進行鑒別。
[0035]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，對發(fā)明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。本專業(yè)技術人員理解，在發(fā)明權利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改，甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【權利要求】
1.一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，該具體過程為: 步驟a，準備用于免疫和篩選的朊蛋白抗原； 步驟b，骨髓瘤細胞SP2/0的準備； 步驟C，動物免疫與細胞融合； 步驟d，陽性雜交瘤細胞的篩選與腹水單抗制備； 步驟e,單抗成份鑒定。
2.根據(jù)權利要求1所述的鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，在上述步驟a中，重組表達牛和羊PrPC核心片段，以羊PrPC核心片段作為用于免疫的朊蛋白抗原；以牛和羊PrPC核心片段作為篩選包被抗原。
3.根據(jù)權利要求2所述的鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，在上述步驟b中，細胞融合前一周復蘇凍存于液氮中的SP2/0，在20 %小牛血清HT培養(yǎng)基和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察生長狀況，融合前調(diào)整至對數(shù)生長期。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，在上述步驟c中，將步驟a中制備的羊朊蛋白抗原與等量弗氏完全佐劑充分乳化后，在其腹部皮下多點注射6周齡PrP基因敲除小鼠，20 μ g/只；2周后腹部皮下多點注射相同劑量弗氏不完全佐劑充分乳化的朊蛋白抗原；14d后腹腔追加注射5yg朊蛋白抗原，3d后無菌取脾臟進行細胞融合。
5.根據(jù)權利要求4所述的所述的鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，在上述步驟d中，采用間接ELISA方法對長有雜交瘤細胞的孔進行篩選，以純化的重組牛和羊PrPC核心片段為包被抗原分別包板； 檢測羊PrPC核心片段為陽性同時牛PrPC核心片段為陰性的孔，進行24孔板擴大培養(yǎng)；檢測仍符合上述條件的孔，采用有限稀釋法進行2次亞克??；取形態(tài)良好，生長旺盛的單克隆細胞6孔板擴大培養(yǎng)，一部分用于液氮凍存，另一部分用于單抗腹水的生產(chǎn)；取青壯年Balb/c小鼠，制備腹水單抗。
6.根據(jù)權利要求4所述的鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，在上述步驟e中，比較牛、羊PrPC核心片段氨基酸序列，找出兩者存在差異的位置，以此位置為中心，人工合成10肽，以leyg/mL分別溶于CBS (pH9.6)，每孔加入100^溶液，371:孵育2h，5%脫脂乳4°C封閉過夜； 包被好的ELISA板與所得單抗進行標準ELISA反應，檢測所得單抗的特異性抗原結(jié)合位點，所述單克隆抗體的抗原結(jié)合位點為羊朊蛋白208位的異亮氨酸，該位點羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸；比較不同物種該位點的氨基酸，確定所得單抗與哪些物種PrPC核心片段能夠結(jié)合，與哪些物種PrPC核心片段不結(jié)合。
7.一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的抗原結(jié)合位點為羊朊蛋白208位的異亮氨酸，該位點羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸，該單抗只與羊PrPC反應，不與牛PrPC反應。
8.一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的應用，其特征在于，取健康牛、羊腦組織勻漿、離心處理后，進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5 %脫脂奶4 V封閉過夜，TBST洗滌5次，3min/次；加入腹水單抗1.5h，TBST洗滌10次，3min/次；加入生物素標記二抗lh，TBST洗滌6次，3min/次，采用化學發(fā)光法進行X底片曝光。
【文檔編號】G01N33/68GK104017077SQ201410246788
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權日:2014年5月30日
【發(fā)明者】吳曉東, 張永強, 趙永剛, 李金明, 王志亮 申請人:中國動物衛(wèi)生與流行病學中心