口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中化學成分測定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中兩種成分的確定及其含量測定方法，含量測定方法是采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，在所建立的檢測方法下對口服熱淋清顆粒后尿液和糞便中兩種成分沒食子酸和原兒茶酸進行含量測定。本發(fā)明含量測定方法的精密度高，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性好，測定結(jié)果準確，可對有效評價熱淋清顆粒中的沒食子酸和原兒茶酸在生物體內(nèi)的排泄情況。
【專利說明】口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中化學成分測定
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中成藥體內(nèi)代謝研究【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及及一種口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中兩種成分的確定及其含量測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]熱淋清顆粒是以苗藥頭花寥為原料制成的單方制劑，收載于《中國藥典》2010版。具清熱解毒、利尿通淋的功效。用于濕熱蘊結(jié)，小便黃赤，淋漓澀痛之癥，尿路感染，腎盂腎炎見上述證候者。對泌尿系統(tǒng)感染具有確切的療效?！盁崃芮孱w粒”為國家中藥保護品種、國家社保藥物，并為唯一進入2010版《中國藥典》的苗藥，獲國家發(fā)改委單獨定價權(quán)。
[0003]根據(jù)文獻報道，熱淋清顆粒中主要的化學成分為酚酸類化合物和黃酮類化合物?，F(xiàn)熱淋清顆粒收載于《中國藥典》2010版，該標準【含量測定】項以沒食子酸為指標成分。為明確熱淋清顆粒中中主要有效成分在體內(nèi)的代謝過程，必須建立合理的尿液和糞便中熱淋清顆粒主要有效成分的含量測定方法，以利于有效評價熱淋清顆粒主要有效成分的排泄情況，為熱淋清顆粒的更深入開發(fā)提供依據(jù)。
[0004]本發(fā)明以熱淋清顆粒中的主要化學成分沒食子酸和原兒茶酸為指標，建立了大鼠尿液和糞便中沒食子酸和原兒茶酸的含量測定方法，并用該方法對大鼠口服熱淋清顆粒后沒食子酸和原兒茶酸在尿液和糞便中的排泄情況進行了研究。
[0005]通過文獻發(fā)現(xiàn)，目前對于沒食子酸在動物體內(nèi)的排泄研究都是在對其代謝產(chǎn)物的定性研究，而關(guān)于其在尿液和糞便中含量測定方法研究未見文獻報道。對于原兒茶酸的排泄研究，有文獻(黃勇等，UPLC-ES1-MS/MS法研究注射用復(fù)方葒草在大鼠體內(nèi)的排泄，中成藥，2012)對其在尿液中的含量測定方法進行了研究，但對其在糞便中的含量測定方法文獻中沒有描述。本發(fā)明所建立的尿液中原兒茶酸含量測定方法與文獻的區(qū)別在于以下兩個方面:
[0006](I)在尿液樣品處理方法上，文獻采用的是直接沉淀蛋白法，而本發(fā)明對直接沉淀蛋白和液液萃取兩種方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)液液萃取提取效果較好，峰形較好，無基質(zhì)干擾(見表2)。
[0007](2)在線性范圍方面，文獻中的線性范圍是31~7470ng/mL，而本發(fā)明是10~1000ng/mL，可以看出本方法的定量限更低，相對文獻而言，能更客觀地反應(yīng)原兒茶酸在大鼠尿液中的排泄情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于:提供一種口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中兩種成分的確定及其含量測定方法。本發(fā)明通過對口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中兩種成分沒食子酸及原兒茶酸進行含量測定研究，為研究熱淋清顆粒中沒食子酸及原兒茶酸的排泄過程提供依據(jù)。
[0009]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:[0010]提供一種大鼠口服熱淋清顆粒后尿液和糞便中兩種成分的測定方法，其包括以下步驟:
[0011](I)尿液測試樣品的制備:
[0012](a)取熱淋清顆粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(體重230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg ；
[0013](b)分別在O?48h采集大鼠尿液，記錄尿量，將尿液樣品3000?5000r/min轉(zhuǎn)速離心5?30min后，取上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中；
[0014](c)加入內(nèi)標巖白菜素母液IOyL,然后用乙酸乙酯萃取，尿液與乙酸乙酯的體積比為1:4?1:8，萃取時間2?5min，渦旋混勻30?60s后，在O?10°C恒溫下以10000?12000r/min 離心 5 ?15min ；
[0015](d)上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，于30?50°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，潤旋混勻30?60s后,在O?10°C恒溫下以10000?12000r/min離心5?15min,取上清液即為尿液供試品溶液；
[0016](e)按步驟(b)至步驟(d)的方法對未服用藥物的空白尿液進行處理，得到尿液空白溶液；
[0017](2)糞便測試樣品的制備:
[0018](a)取熱淋清顆粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給予大鼠(體重230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg ；
[0019](b)分別收集48h內(nèi)大鼠糞便，將大鼠糞便烘干，稱重，取0.5g樣品加入10倍量水制成混懸液，將樣品3000?5000r/min轉(zhuǎn)速離心5?30min后，取上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP
管中；
[0020](c)加入內(nèi)標巖白菜素母液IOyL,然后用乙酸乙酯萃取，尿液與乙酸乙酯的體積比為1:4?1:8，萃取時間2?5min，渦旋混勻30?60s后，在O?10°C恒溫下以10000?12000r/min 離心 5 ?15min ；
[0021](d)上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，于30?50°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，潤旋混勻30?60s后,在O?10°C恒溫下以10000?12000r/min離心5?15min,取上清液即為糞便供試品溶液；
[0022](e)按步驟(b)至步驟⑷的方法對未服用藥物的空白糞便進行處理，得到糞便空白溶液；
[0023](f)對照品溶液的制備:分別精密稱取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01?Img,各自加純甲醇定容至IOml,即得三種母液,分別取三種母液適量至同一量瓶中，加甲醇稀釋至所需濃度，即為對照品溶液；
[0024](3) LC-MS/MS分析的色譜條件和檢測條件:
[0025]色譜柱為反相色譜柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O?20:80?100 (體積比)為流動相，流速為0.1?0.5mL/min,柱溫為20?40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2000?3000V，霧化溫度為300?500°C，鞘氣壓力為30?50mTorr，輔助氣壓力為5?15mTorr，毛細管溫度為200?400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.05%?0.5 %，所述酸選自甲酸、乙酸或其組合);
[0026](4)測定法:分別精密吸取對照品溶液、尿液空白溶液、糞便空白溶液、尿液供試品溶液、糞便供試品溶液5?20 μ L，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，即得。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(I)之(a)中，通過灌胃給藥方式給大鼠(230?270g)熱淋清顆粒水溶液2?4ml。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)之(a)中，通過灌胃給藥方式給大鼠(230?270g)熱淋清顆粒水溶液2?4ml。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟⑴之(b)中，分別在2h，12h，24h后采集大鼠尿液。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)之(b)中，分別在24h、48h后采集大鼠糞便。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(I)之(b)中，將尿液樣品于低速離心機4000r/min離心IOmin0
[0032]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)之(b)中，將尿液樣品于低速離心機4000r/min離心IOmin0
[0033]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(I)之(C)中，所述乙酸乙酯中添加0.2%?2%酸，例如添加0.5%?1%酸。在一個實施方案中，所述的酸選自甲酸、乙酸及其組合。在一個實施方案中，所述的酸是甲酸和乙酸二者以體積比2:1的混合酸。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟⑵之(C)中，所述乙酸乙酯中添加0.2%?2%酸，例如添加0.5%?1%酸。在一個實施方案中，所述的酸選自甲酸、乙酸及其組合。在一個實施方案中，所述的酸是甲酸和乙酸二者以體積比2:1的混合酸。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟⑴之(C)中，尿液與乙酸乙酯(優(yōu)選地該乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以體積比2:1的混合酸)的體積比為1:6，萃取時間4min。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)之(C)中，尿液與乙酸乙酯(優(yōu)選地該乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以體積比2:1的混合酸)的體積比為1:6，萃取時間4min。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(I)之(C)中，萃取后渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉(zhuǎn)速 12000r/min,離心 lOmin。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)之(C)中，萃取后渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉(zhuǎn)速 12000r/min,離心 lOmin。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中檢測的兩種成分是沒食子酸和原兒茶酸。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(I)之(d)中，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)之(d)中，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(I)之(d)中，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻 60s 后 12000r/min, 4°C恒溫,離心 IOmin0
[0043]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)之(d)中，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻 60s 后 12000r/min, 4°C恒溫,離心 IOmin0
[0044]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(3)中，色譜柱為C18色譜柱。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(3)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.1%。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(3)中,流速為0.2ml/min，柱溫為30°C。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(3)中，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr，毛細管溫度為300°C。
[0048]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(3)中，使用梯度洗脫，洗脫液的變化為:開始時，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相98%，穩(wěn)定3min ;接著至第IOmin時，酸性乙腈相線性增加至10%，酸性水溶液相90% ;第10.1min時，酸性乙腈相改為2 %，酸性水溶液相98%，穩(wěn)定7min。
[0049]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(4)中，各溶液的進樣量均為10yL。
[0050]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中尿液供試品溶液包括以下操作步驟:取熱淋清顆粒0.5?4g用5?10倍水溶解，配成水溶液，通過灌胃給藥方式給大鼠(230?270g)熱淋清顆粒水溶液2?4mL，分別在2h，12h，24h后采集大鼠尿液，將尿液于低速離心機4000r/min離心IOmin后，取上層液體轉(zhuǎn)移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按體積比1:4萃取5min，渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉(zhuǎn)速12000r/min，離心lOmin，重復(fù)3次，合并上清液，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min，4°C恒溫，離心IOmin后取10 μ L進樣，空白尿液按同樣方法處理。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中糞便供試品溶液包括以下操作步驟:取熱淋清顆粒
0.5?4g用5?10倍水溶解，配成水溶液，通過灌胃給藥方式給大鼠(230?270g)熱淋清顆粒水溶液2?4mL，分別在24h、48h采集大鼠糞便，將大鼠糞便烘干，稱重，取0.5g樣品加入10倍量水制成混懸液，于低速離心機4000r/min離心IOmin后,取上層液體轉(zhuǎn)移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按體積比1:4萃取5min，渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉(zhuǎn)速12000r/min，離心lOmin，重復(fù)3次，合并上清液，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min，4°C恒溫，離心IOmin后取10 μ L進樣，空白糞便按同樣方法處理。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的方法，以上處理好的樣品，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀按以下條件進行:
[0053]色譜條件和質(zhì)譜條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸0.1 % )乙腈:酸性(甲酸0.1% )水=O?20:80?100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.2mL.min—1，柱溫為30°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為300°C ；
[0054]對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品
0.01?lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10mL，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
[0055]測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液5 μ L，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，即得。
[0056]前述流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的變化為:開始時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定3min ;第IOmin時，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定7min。
[0057]前述質(zhì)譜檢測為多反應(yīng)監(jiān)測模式，反應(yīng)離子對及形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Tube Lens Offset) 71V，碰撞壓力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原兒茶酸 I52.918 — 109.244,補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(CollisionPressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,內(nèi)標 326.922 — 192.167,補償電壓(Tube Lens Offset) 100V,碰撞壓力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的方法，其基本上是提供了一種口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中兩種成分的確定及其含量測定方法，其特征在于:
[0059]取熱淋 清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg，分別在O~48h，采集大鼠尿液，將大鼠尿液樣品3000~5000r/min轉(zhuǎn)速離心5~30min后，取上層液體轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，加入內(nèi)標巖白菜素10μ L,然后按1:4~1:8體積比乙酸乙酯萃取,萃取時間2~5min,潤旋混勻30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒溫,離心5~15min,上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，重復(fù)萃取I~3次，合并乙酸乙酯部分有機相，于30~50°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，潤旋混勻30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒溫,離心5~15min后取5~20 μ L進樣,空白尿液按同樣方法處理；
[0060]取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg，分別收集48h大鼠糞便，將大鼠糞便烘干，稱重，取0.1~Ig樣品加入5~10倍量水制成混懸液，3000~5000r/min轉(zhuǎn)速離心5~30min后，取上層液體轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，加入內(nèi)標巖白菜素10 μ L，然后按1:4~1:8體積比乙酸乙酯萃取，萃取時間2~5min,潤旋混勻30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒溫，離心5~15min，上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，重復(fù)萃取I~3次，合并乙酸乙酯部分有機相，于30~50°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，渦旋混勻30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒溫,離心5~15min后取5~20 μ L進樣，空白糞便按同樣方法處理；
[0061]以上處理好的樣品，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀按以下條件進行:
[0062]色譜條件和質(zhì)譜條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05^^0.5%)乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5%)水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.1~0.5mL/min,柱溫為20~40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2000~3000V，霧化溫度為300~500°C，鞘氣壓力為30~50mTorr，輔助氣壓力為5~15mTorr，毛細管溫度為200~400°C ；
[0063]對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10mL，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于尿液和糞便樣品按以下步驟操作:
[0065]取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg，分別在O~48h采集大鼠尿液，記錄尿量，將尿液樣品4000r/min轉(zhuǎn)速離心10min后，取上層液體轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，加入內(nèi)標巖白菜素10 μ L，然后按1:4體積比用乙酸乙酯萃取，萃取時間5min，渦旋混勻后12000r/min離心5min,上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，重復(fù)3次，于40°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，4°C恒溫，12000r/min離心10min后取10 μ L進樣，空白尿液按同樣方法處理；
[0066]取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg，分別收集48h內(nèi)大鼠糞便，將大鼠糞便烘干，稱重，取0.5g樣品加入10倍量水制成混懸液，將樣品4000r/min轉(zhuǎn)速離心IOmin后，取上層液體轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，加入內(nèi)標巖白菜素10 μ L，然后按1:4體積比用乙酸乙酯萃取，萃取時間5min，渦旋混勻后12000r/min離心5min，上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，重復(fù)3次，于40°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，4°C恒溫，12000r/min離心IOmin后取10 μ L進樣，空白糞便按同樣方法處理。
[0067]根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于色譜柱規(guī)格為2.1 X 150mm，填料粒徑為1.7μπι，以甲酸0.1 %乙腈Α:甲酸0.1 %水B為流動相，按以下條件梯度洗脫:0?3min2%A, 3.0 ?3.1min2% A—10% A, 3.I ?10.0minl0% A, 10.0 ?10.1minl0% -2% A, 10.1 ?17.0min2% A。
[0068]根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于質(zhì)譜噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為350°C。
[0069]根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于:質(zhì)譜檢測為多反應(yīng)監(jiān)測模式，反應(yīng)離子對分別為:沒食子酸 169.181 — 125.268，原兒茶酸 152.918 — 109.244，內(nèi)標 326.922 — 192.167。
[0070]以下是本發(fā)明人對口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中兩種成分的確定及其含量測定進行研究的過程:
[0071]一、口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中兩種成分的確定
[0072]本發(fā)明人對于有關(guān)熱淋清顆粒及其原料藥的文獻進行了大量的研究，而且根據(jù)發(fā)明人所在課題組前期對頭花寥展開的化學成分分析研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸和原兒茶酸為頭花寥中的生物活性成分，因此選取熱淋清顆粒中的沒食子酸和原兒茶酸為指標進行了 口服熱淋清顆粒后大鼠尿液中和糞便中兩種成分的確定研究。
[0073]取熱淋清顆粒0.5?4g用5?10倍水溶解，配成水溶液，通過灌胃給藥方式給大鼠(230?270g)熱淋清顆粒水溶液2?4mL，分別分別在2h，12h，24h后采集大鼠尿液，將尿液于低速離心機4000r/min離心IOmin后,取上層液體轉(zhuǎn)移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按體積比1:4萃取5min,潤旋均勻30s后4°C恒溫離心,轉(zhuǎn)速12000r/min,離心IOmin,重復(fù)3次，合并上清液，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min,4°C恒溫,離心IOmin后取10 μ L進樣，空白尿液按同樣方法處理。
[0074]取熱淋清顆粒0.5?4g用5?10倍水溶解，配成水溶液，通過灌胃給藥方式給大鼠(230?270g)熱淋清顆粒水溶液2?4mL，分別在給藥后24h、48h收集大鼠糞便，將大鼠糞便烘干，稱重，取0.5g樣品加入10倍量水制成混懸液，將糞便于低速離心機4000r/min離心IOmin后，取上層液體轉(zhuǎn)移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按體積比1:4萃取5min，渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉(zhuǎn)速12000r/min，離心lOmin，重復(fù)3次，合并上清液，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min，4°C恒溫，離心IOmin后取10 μ L進樣，空白糞便按同樣方法處理。
[0075]以上處理好的樣品，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀按以下條件進行:
[0076]色譜條件和質(zhì)譜條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸0.1 % )乙腈:酸性(甲酸0.1 % )水=O?20:80?100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.2mL/min,柱溫為30°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為300°C ；
[0077]對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01?lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10mL，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
[0078]測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液5 μ L，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，即得。
[0079]前述流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的變化為:開始時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定3min ;第IOmin時，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定7min。
[0080]前述質(zhì)譜檢測為多反應(yīng)監(jiān)測模式，反應(yīng)離子對及形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Tube Lens Offset) 71V，碰撞壓力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原兒茶酸 I52.918 — 109.244,補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(CollisionPressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,內(nèi)標 326.922 — 192.167,補償電壓(Tube Lens Offset) 100V,碰撞壓力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0081]測定結(jié)果如圖1-7所示，從圖可以看出，沒食子酸和原兒茶酸為口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中存在的化學成分。
[0082]二、口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中沒食子酸和原兒茶酸的含量測定方法的
建立
[0083]1、儀器與試藥
[0084]TSQ Quantum超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)，包括:三重四級桿質(zhì)量分析器,ESI離子源,Xcalibur工作站,液相部分為Thermo Accela UPLC,包括:Accela PDA檢測器，Accela自動進樣器，ACCelal250輸液泵(美國賽默飛世爾科技有限公司)、十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、KQ5200E型超聲波清洗(昆明市超聲儀器有限公司)。
[0085]乙腈(色譜純，美國“天地”試劑公司)、甲醇(色譜純，美國“天地”試劑公司)；水(重蒸水，臨用前制備)；甲酸(色譜純，美國Roe Scientific公司)、乙酸(色譜純，美國 Roe Scientific 公司)；
[0086]沒食子酸、原兒茶酸及巖白菜素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)。
[0087]2、儀器操作條件
[0088]液相色譜條件:PhenomenexKinetexXB_C18 色譜柱(2.1 X 150mm, 1.7 μ m),流動相A為乙腈(含0.1 %甲酸)，B為水(含0.1%甲酸)，梯度洗脫:0?3min2%A，3.0?
3.1min2 % A—10 % A, 3.I ?10.0minlO % A, 10.0 ?10.1minlO % -2 % A, 10.1 ?17.0min2% A，流速 0.2mL/min，進樣量為 5 μ L,
[0089]質(zhì)譜條件:采用ESI離子源；負離子檢出模式；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測方式(MRM);用于定量分析的監(jiān)測離子見表I。離子源參數(shù):鞘氣流速:40Arb，輔助氣流速:IOArb ;毛細管溫度:350°C ;毛細管電壓:30V ;霧化溫度為350°C ;噴霧電壓:2500V ;掃描頻率:0.1s。[0090]表1以SRM模式優(yōu)化GA、PA、內(nèi)標(IS)形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量
[0091]
【權(quán)利要求】
1.大鼠口服熱淋清顆粒后尿液和糞便中兩種成分的測定方法，其包括以下步驟: (1)尿液測試樣品的制備: (a)取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(體重230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg ； (b)分別在O~48h采集大鼠尿液，記錄尿量，將尿液樣品3000~5000r/min轉(zhuǎn)速離心5~30min后，取上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中； (c)加入內(nèi)標巖白菜素母液IOyL,然后用乙酸乙酯萃取，尿液與乙酸乙酯的體積比為1:4~1:8，萃取時間2~5min,潤旋混勻30~60s后，在O~10°C恒溫下以10000~12000r/min 離心 5 ~15min ； (d)上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，于30~50°C氮氣流吹干，殘留物用100μ L流動相溶解，潤旋混勻30~60s后，在O~10°C恒溫下以10000~12000r/min離心5~15min,取上清液即為尿液供試品溶液； (e)按步驟(b)至步驟(d)的方法對未服用藥物的空白尿液進行處理，得到尿液空白溶液； (2)糞便測試樣品的制備: (a)取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給予大鼠(體重230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg ； (b)分別收集48h內(nèi)大鼠糞便，將大鼠糞便烘干，稱重，取0.5g樣品加入10倍量水制成混懸液，將樣品3000~5000r/min轉(zhuǎn)速離心5~30min后，取上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中； (c)加入內(nèi)標巖白菜素母液IOyL,然后用乙酸乙酯萃取，尿液與乙酸乙酯的體積比為1:4~1:8，萃取時間2~5min,潤旋混勻30~60s后，在O~10°C恒溫下以10000~12000r/min 離心 5 ~15min ； (d)上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，于30~50°C氮氣流吹干，殘留物用100μ L流動相溶解，潤旋混勻30~60s后,在O~10°C恒溫下以10000~12000r/min離心5~15min,取上清液即為糞便供試品溶液； (e)按步驟(b)至步驟(d)的方法對未服用藥物的空白糞便進行處理，得到糞便空白溶液； (f)對照品溶液的制備:分別精密稱取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~Img,各自加純甲醇定容至IOml,即得三種母液,分別取三種母液適量至同一量瓶中，加甲醇稀釋至所需濃度，即為對照品溶液； (3)LC-MS/MS分析的色譜條件和檢測條件: 色譜柱為反相色譜柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，流速為0.1~0.5mL/min，柱溫為20~40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2000~3000V，霧化溫度為300~500°C，鞘氣壓力為30~50mTorr，輔助氣壓力為5~15mTorr，毛細管溫度為200~400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.05^-0.5%,所述酸選自甲酸、乙酸或其組合); (4)測定法:分別精密吸取對照品溶液、尿液空白溶液、糞便空白溶液、尿液供試品溶液、糞便供試品溶液5~20 μ L，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 步驟(1)之(a)中，通過灌胃給藥方式給大鼠(230~270g)熱淋清顆粒水溶液2~4m I ； 步驟(2)之(a)中，通過灌胃給藥方式給大鼠(230~270g)熱淋清顆粒水溶液2~4m I ； 步驟(1)之(b)中，分別在2h，12h，24h后采集大鼠尿液； 步驟⑵之(b)中，分別在24h、48h后采集大鼠糞便； 步驟(1)之(b)中，將尿液樣品于低速離心機4000r/min離心10min ;和/或 步驟⑵之(b)中，將尿液樣品于低速離心機4000r/min離心10min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 步驟⑴之(c)中，所述乙酸乙酯中添加0.2%~2%酸，例如添加0.5%~1%酸；例如，所述的酸選自甲酸、乙酸 及其組合；例如，所述的酸是甲酸和乙酸二者以體積比2:1的混合酸； 步驟⑵之(c)中，所述乙酸乙酯中添加0.2%~2%酸，例如添加0.5%~1%酸；例如，所述的酸選自甲酸、乙酸及其組合；例如，所述的酸是甲酸和乙酸二者以體積比2:1的混合酸； 步驟⑴之(c)中，尿液與乙酸乙酯(優(yōu)選地該乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以體積比2:1的混合酸)的體積比為1:6，萃取時間4min ； 步驟⑵之(c)中，尿液與乙酸乙酯(優(yōu)選地該乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以體積比2:1的混合酸)的體積比為1:6，萃取時間4min ； 步驟(1)之(c)中，萃取后渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉(zhuǎn)速12000r/min，離心10min ；和/或 步驟(2)之(c)中，萃取后渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉(zhuǎn)速12000r/min，離心10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 口服熱淋清顆粒后大鼠尿液和糞便中檢測的兩種成分是沒食子酸和原兒茶酸； 步驟(1)之(d)中，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干； 步驟(2)之(d)中，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干； 步驟⑴之⑷中，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min，4°C恒溫，離心10min ;和/或 步驟⑵之⑷中，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min，4°C恒溫，離心10min0
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 步驟(3)中，色譜柱為C18色譜柱； 步驟(3)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.1% ； 步驟⑶中，流速為0.2ml/min，柱溫為30°C ； 步驟(3)中，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為300°C ； 步驟(3)中，使用梯度洗脫，洗脫液的變化為:開始時，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相98%,穩(wěn)定3min ;接著至第IOmin時,酸性乙腈相線性增加至10%,酸性水溶液相90% ;第.10.1min時，酸性乙腈相改為2%，酸性水溶液相98%，穩(wěn)定7min ； 步驟(4)中，各溶液的進樣量均為10 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 尿液供試品溶液包括以下操作步驟:取熱淋清顆粒0.5~4g用5~10倍水溶解,配成水溶液，通過灌胃給藥方式給大鼠(230~270g)熱淋清顆粒水溶液2~4mL，分別在2h，12h, 24h后采集大鼠尿液,將尿液于低速離心機4000r/min離心10min后,取上層液體轉(zhuǎn)移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按體積比1:4萃取5min，渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉(zhuǎn)速12000r/min，離心10min，重復(fù)3次，合并上清液，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min, 4°C恒溫，離心10min后取10 μ L進樣，空白尿液按同樣方法處理；和/或 糞便供試品溶液包括以下操作步驟:取熱淋清顆粒0.5~4g用5~10倍水溶解，配成水溶液，通過灌胃給藥方式給大鼠(230~270g)熱淋清顆粒水溶液2~4mL，分別在24h、48h采集大鼠糞便，將大鼠糞便烘干，稱重，取0.5g樣品加入10倍量水制成混懸液，于低速離心機4000r/min離心10min后,取上層液體轉(zhuǎn)移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按體積比1:4萃取5min,潤旋均勻30s后4°C恒溫離心,轉(zhuǎn)速12000r/min,離心10min,重復(fù)3次，合并上清液，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min,4°C恒溫,離心10min后取10 μ L進樣,空白糞便按同樣方法處理。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 處理好的樣品，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀按以下條件進行: 色譜條件和質(zhì)譜條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸0.1%)乙腈:酸性(甲酸.0.1% )水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.2mL.min—1，柱溫為30°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為300°C ； 對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10mL，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度； 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液5 μ L，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，即得； 前述流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的變化為:開始時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定3min ;第IOmin時，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min時，甲酸乙腈相2 %，甲酸水溶液相98 %，穩(wěn)定7min ； 前述質(zhì)譜檢測為多反應(yīng)監(jiān)測模式，反應(yīng)離子對及形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸 169.181 — 125.268，補償電壓(Tube Lens Offset) 71V，碰撞壓力(CollisionPressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原兒茶酸 152.918 — 109.244,補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV，內(nèi)標 326.922 — 192.167，補償電壓(Tube Lens Offset) 100V,碰撞壓力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 22eV0
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg，分別在O~48h，采集大鼠尿液，將大鼠尿液樣品3000~5000r/min轉(zhuǎn)速離心5~30min后,取上層液體轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，加入內(nèi)標巖白菜素10 μ L,然后按1:4~1:8體積比乙酸乙酯萃取,萃取時間2~5min,潤旋混勻30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒溫,離心5~15min,上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，重復(fù)萃取I~3次，合并乙酸乙酯部分有機相，于30~50°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，渦旋混勻30~60s后10000~12000r/min，O~10°C恒溫，離心5~15min后取5~20 μ L進樣，空白尿液按同樣方法處理； 取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg，分別收集48h大鼠糞便，將大鼠糞便烘干，稱重，取0.1~Ig樣品加入5~10倍量水制成混懸液，3000~5000r/min轉(zhuǎn)速離心5~30min后，取上層液體轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，加入內(nèi)標巖白菜素IOyL,然后按1:4~1:8體積比乙酸乙酯萃取，萃取時間2~5min,潤旋混勻30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒溫，離心5~15min,上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，重復(fù)萃取I~3次，合并乙酸乙酯部分有機相，于30~50°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，渦旋混勻30~60s后10000~12000r/min，O~10°C恒溫,離心5~15min后取5~20 μ L進樣,空白糞便按同樣方法處理； 以上處理好的樣品，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀按以下條件進行: 色譜條件和質(zhì)譜條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.1~0.5 mL/min,柱溫為20~40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2000~3000V，霧化溫度為300~500°C，鞘氣壓力為30~50mTorr，輔助氣壓力為5~15mTorr，毛細管溫度為200~400°C ； 對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~lmg，精密稱定，加純甲 醇定容至10mL，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg，分別在O~48h采集大鼠尿液，記錄尿量，將尿液樣品4000r/min轉(zhuǎn)速離心10min后，取上層液體轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，加入內(nèi)標巖白菜素10yL，然后按1: 4體積比用乙酸乙酯萃取,萃取時間5min,潤旋混勻后12000r/min離心5min,上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，重復(fù)3次，于40°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，4°C恒溫，12000r/min離心10min后取10 μ L進樣,空白尿液按同樣方法處理； 取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10mL/kg，分別收集48h內(nèi)大鼠糞便，將大鼠糞便烘干，稱重，取0.5g樣品加入10倍量水制成混懸液，將樣品4000r/min轉(zhuǎn)速離心10min后，取上層液體轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，加入內(nèi)標巖白菜素10 μ L，然后按1:4體積比用乙酸乙酯萃取，萃取時間5min，渦旋混勻后12000r/min離心5min，上層液轉(zhuǎn)移至新空白EP管中，重復(fù)3次，于40°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ L流動相溶解，4°C恒溫，12000r/min離心10min后取10μ L進樣，空白糞便按同樣方法處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 所述色譜柱規(guī)格為2.1 X 150mm,填料粒徑為1.7 μ m ; 以甲酸0.1 %乙腈A:甲酸0.1 %水B為流動相，按以下條件梯度洗脫:0~3min2%A, 3.0 ~3.lmin2% A—10% A, 3.1 ~10.0minl0% A, 10.0 ~10.1minl0% -2% A, 10.1 ~。17.0min2% A ； 所述質(zhì)譜噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為.1OmTorr,毛細管溫度為350°C ； 所述質(zhì)譜檢測為多反應(yīng)監(jiān)測模式，反應(yīng)離子對分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，原兒茶酸 152.918 — 109.244，內(nèi)標 326.922 — 192.167。
【文檔編號】G01N30/88GK103983750SQ201410249780
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】周欣, 龔小見, 陳華國, 馬風偉, 趙楊, 梁斌, 楊槐, 張麗艷 申請人:貴州威門藥業(yè)股份有限公司