一種基于受體的檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素的免疫層析試紙條及其制備方法
【專利摘要】一種基于受體的檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素的免疫層析試紙條及其制備方法，屬于免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明試紙條包括PVC背襯，PVC背襯前端設(shè)置樣品墊，樣品墊與硝酸纖維素膜前端連接，硝酸纖維素膜后端與吸水墊連接；結(jié)合微孔板上含有抗β-內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物和小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物的混合物；硝酸纖維素膜上依次包被有氨芐西林-BSA檢測(cè)線和羊抗鼠IgG控制線。本發(fā)明適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的免疫層析色譜檢測(cè)法，能實(shí)現(xiàn)至少十五種β-內(nèi)酰胺類抗生素的多殘留檢測(cè)；檢測(cè)快速，僅需要5-10min；便攜，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；操作簡(jiǎn)便，不需要專業(yè)技術(shù)人員。
【專利說明】—種基于受體的檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素的免疫層析試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于受體的檢測(cè)β -內(nèi)酰胺類抗生素的免疫層析試紙條及其制備方法，屬于免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]因?yàn)楝F(xiàn)有獸藥種類繁多，就β內(nèi)酰胺類抗生素也有很多種，僅是單殘留檢測(cè)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)獸藥濫用而導(dǎo)致的藥物殘留的很好檢測(cè)。運(yùn)用抗原抗體反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)一小部分的β內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)，但仍難以滿足多殘留檢測(cè)的需要。現(xiàn)有的能實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)的方法主要是儀器分析，其中包括高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和TTC法等。但這些檢測(cè)方法需要昂貴的儀器設(shè)備，操作需要專業(yè)技術(shù)人員，且不能適應(yīng)高通量、現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。因此實(shí)現(xiàn)具有快速，便攜優(yōu)點(diǎn)的免疫檢測(cè)方法的多殘留檢測(cè)具有現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種基于受體的能夠同時(shí)檢測(cè)十五種β_內(nèi)酰胺類抗生素的免疫層析試紙條及其制備方法，該方法是基于針對(duì)該類抗生素的受體的。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種基于受體的檢測(cè)內(nèi)酰胺類抗生素的免疫層析試紙條，包括PVC背襯，在PVC背襯前端設(shè)置樣品墊，樣品墊為德國(guó)Schleicher&Schuell公司的Glass24墊，樣品墊與硝酸纖維素膜前端連接，硝酸纖維素膜后端與吸水墊連接，吸水墊材料是吸水紙；硝酸纖維素膜上依次包被有氨芐西林-BSA檢測(cè)線和羊抗鼠IgG控制線；與其配套使用的結(jié)合微孔板，結(jié)合微孔板上的微孔中含有抗β_內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物和小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物的混合物。
[0005]所述基于受體的檢測(cè)β -內(nèi)酰胺類抗生素的免疫層析試紙條的制備方法，制備步驟為:
(1)氨芐西林-BSA偶聯(lián)物的制備:將氨芐西林(AMP)與碳二亞胺(EDC)以1: 3摩爾比溶于pH 5,0.0lmol/L 2_(N_嗎啉代)乙磺酸(MES)溶液中，室溫?cái)嚢杌罨痩h，按摩爾比AMP: BSA=50: I稱取BSA溶解在0.01M、pH7.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液中，將AMP的活化物逐滴滴入BSA溶液中，室溫反應(yīng)4h，用生理鹽水4°C透析3天，形成氨芐西林-BSA偶聯(lián)物；
(2)制備膠體金顆粒:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20-40nm膠體金顆粒；
(3)抗β-內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物的制備:取步驟(2)制備的4mL膠體金調(diào)至pH 9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的抗β -內(nèi)酰胺類抗生素受體0.4mL，放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%,放置至少30min后，10000 rpm離心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩沖液4mL重懸兩次，最后用該硼酸鹽緩沖液0.4mL重懸，得到穩(wěn)定的抗β -內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物。[0006](4)小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物的制備:將步驟(3)中的抗β -內(nèi)酰胺類抗生素受體替換為陰性小鼠的純化血清，重復(fù)步驟(3)，得到小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物。
[0007](5)制作配套使用的結(jié)合微孔板:將步驟(3)和步驟(4)得到的抗內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物和小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物按體積比1:1混合后，取10 μ L混合物包被在96微孔板上；
(6)硝酸纖維素膜的處理:將氨芐西林-BSA偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應(yīng)墊的硝酸纖維素膜上，依次作為檢測(cè)線和控制線，在37°C烘箱干燥；
(7)試紙條的組裝:將樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依次黏附在PVC背襯上，用切條機(jī)切割成3mm寬的細(xì)條，即得到用于檢測(cè)的免疫層析試紙條，4°C冷藏備用。
[0008]所述基于受體的檢測(cè)β -內(nèi)酰胺類抗生素的免疫膠體金試紙條的應(yīng)用，其特征在于可以檢測(cè)至少15種β內(nèi)酰胺類抗生素；分別為阿莫西林，氨芐西林、青霉素G、青霉素V、鄰氯青霉素，雙氯青霉素，萘夫西林、苯唑西林、頭孢克洛，頭孢替唑、頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢哌酮、頭孢硫脒，頭孢吡肟。
[0009]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種便攜、快速、適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的免疫層析色譜檢測(cè)法(gold immunochromatography assay;GICA),能實(shí)現(xiàn)至少十五種β_內(nèi)酰胺類抗生素的多殘留檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)快速，僅需要5-10min ;便攜，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；操作簡(jiǎn)便，不需要專業(yè)技術(shù)人員。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1組裝完成的免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)。1、PVC背襯；2、樣品墊，3、硝酸纖維素膜，
4、吸水墊，5、檢測(cè)線，6、控制線。
[0011]圖2該試紙條對(duì)氨芐西林等十五種β -內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1
如圖1所示，PVC背襯I 一端依次粘貼樣品墊2、硝酸纖維素膜3，另一端粘附吸水墊4，硝酸纖維素膜3上包被了氨芐西林-BSA作為檢測(cè)線5，和羊抗鼠IgG作為控制線6。配套使用的微孔板上包被了抗β-內(nèi)酰胺類抗生素的簇特異性抗體-膠體金標(biāo)記物和小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物。
[0013]按以下步驟制備:
(1)氨芐西林-BSA偶聯(lián)物的制備:將氨芐西林與EDC以1: 3摩爾比溶于MES(0.0lmol/L、pH 5)，室溫?cái)嚢杌罨痩h，之后將活化物逐滴加入溶解了 BSA的HEPES(0.01mol/L、pH 7)中，BSA和氨芐西林的摩爾比為1:50，反應(yīng)4h，用生理鹽水4°C透析3天，形成氨芐西林-BSA偶聯(lián)物；
(2)制備膠體金顆粒:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；
(3)抗β-內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物的制備:取步驟(2)制備的4mL膠體金調(diào)至pH 9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的抗β-內(nèi)酰胺類抗生素受體
0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min后，10000 rpm離心50min，并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩沖液4mL重懸兩次，最后用該硼酸鹽緩沖液0.4mL重懸，得到穩(wěn)定的抗β -內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物；
(4)小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物的制備:將步驟(3)中的抗β_內(nèi)酰胺類抗生素受體替換為陰性小鼠的純化血清，重復(fù)步驟(3)，得到小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物；
(5)制作配套使用的結(jié)合微孔板:將步驟(3)和步驟(4)得到的抗β_內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物和小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物按體積比1:1混合后，取IOyL混合物包被在96微孔板上；
(6)硝酸纖維素膜的處理:將氨芐西林-BSA偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應(yīng)墊的硝酸纖維素膜上，依次作為檢測(cè)線和控制線，在37°C烘箱干燥；
(7)試紙條的組裝:將樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依次黏附在PVC背襯上，用切條機(jī)切割成3mm寬的細(xì)條。即得到用于檢測(cè)的免疫層析試紙條，4°C冷藏備用。
[0014]應(yīng)用實(shí)施例1
將陰性的純牛奶與0.0lM PBS按1:9混合得到牛奶混合液(A液)，用0.0lM PBS:DMF=I: I的混合溶液分別配制lmg/mL的阿莫西林，氨芐西林，青霉素G，青霉素V，鄰氯青霉素，雙氯青霉素，萘夫西林，苯唑西林，頭孢克洛，頭孢替唑，頭孢噻肟，頭孢噻呋，頭孢哌酮，頭孢硫脒，頭孢吡肟，頭孢氨芐，頭孢羥氨芐，頭孢拉定，頭孢呋辛，頭孢地嗪。用A液稀釋得到濃度為Wg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0015]檢測(cè)時(shí)取50 μ L lPg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液,加入已經(jīng)包有金標(biāo)受體和金標(biāo)小鼠陰性血清的微孔板中，反應(yīng)3min，然后將試紙條樣品墊一端浸入樣本溶液，液面不得超過MARK線,5_15min內(nèi)可以判定結(jié)果,30min后結(jié)果無效。
[0016]結(jié)果判斷:若檢測(cè)線和控制線同時(shí)出現(xiàn)紅色條帶，則說明該受體不能識(shí)別該種抗生素，或者靈敏度過低。若控制線沒有紅色條帶出現(xiàn)則表示該試紙條無效。
[0017]將上述檢測(cè)線不出現(xiàn)紅色條帶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液繼續(xù)用A液稀釋到合適梯度，用多個(gè)試紙條同時(shí)進(jìn)行上述檢測(cè)步驟，至檢測(cè)線出現(xiàn)有梯度的紅色條帶為止，得到合適的梯度條帶后，拍照保存。
[0018]如圖2所示，每根試紙條測(cè)試內(nèi)容如下:(I) Ong/mL阿莫西林；(2) Ing/mL阿莫西林；(3) 2ng/mL阿莫西林；(4) 2ng/mL氨節(jié)西林；(5) 5ng/mL氨節(jié)西林；(6) 0.5ng/mL青霉素 G ; (7) Ing/mL 青霉素 G ; (8) Ing/mL 青霉素 V ; (9) 2ng/mL 青霉素 V ; (10) 5ng/mL鄰氯青霉素；(11) 10ng/mL鄰氯青霉素；(12) 10ng/mL雙氯青霉素；(13) 20ng/mL雙氯青霉素；(14) 5ng/mL萘夫西林；(15) 10ng/mL萘夫西林；(16) 20ng/mL苯唑西林；(17)50ng/mL 苯唑西林；(18) 50ng/mL 頭孢克洛；(19) IOOng /mL 頭孢克洛；(20) I Ong/mL 頭孢替唑；(21) 25ng/mL頭孢替唑；(22) 250ng/mL頭孢噻廂；(23) 500ng/mL頭孢噻月虧；(24) 25ng/mL 頭孢噻呋；(25) 50ng/mL 頭孢噻呋；(26) 5 ng/mL 頭孢哌酮；(27) 10 ng/mL頭孢哌酮；(28) 25 ng/mL頭孢硫脒；(29) 50 ng/mL頭孢硫脒；(30) 10 ng/mL頭孢批月虧；
(31)25 ng/mL頭孢卩比月虧。
【權(quán)利要求】
1.一種基于受體的檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素的免疫層析試紙條，其特征在于:包括PVC背襯(1)，在PVC背襯(I)前端設(shè)置樣品墊(2),樣品墊為德國(guó)Schleicher&Schuell公司的Glass24墊，樣品墊(2)與硝酸纖維素膜(3)前端連接，硝酸纖維素膜(3)后端與吸水墊(4)連接，吸水墊材料是吸水紙；硝酸纖維素膜(3)上依次包被有氨芐西林-BSA檢測(cè)線(5)和羊抗鼠IgG控制線(6);與其配套使用的結(jié)合微孔板，結(jié)合微孔板上的微孔中含有抗β_內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物和小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物的混合物。
2.權(quán)利要求1所述基于受體的檢測(cè)內(nèi)酰胺類抗生素的免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于制備步驟為: (1)氨芐西林-BSA偶聯(lián)物的制備:將氨芐西林與碳二亞胺EDC以1: 3摩爾比溶于0.0lmol/L、pH 5的2-(N-嗎啉代)乙磺酸MES中，室溫?cái)嚢杌罨痩h，之后將活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.0lmol/L、pH 7.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES中，牛血清蛋白BSA和氨芐西林的摩爾比為1: 50，室溫反應(yīng)4h，用生理鹽水4°C透析3天，形成氨芐西林-BSA偶聯(lián)物； (2)制備膠體金顆粒:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20-40nm膠體金顆粒； (3)抗β-內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物的制備:取步驟(2)制備的4mL膠體金調(diào)至pH 9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的抗β -內(nèi)酰胺類抗生素受體0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%,放置至少30min后，IOOOOrpm離心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩沖液4mL重懸兩次，最后用該硼酸鹽緩沖液0.4mL重懸，得到穩(wěn)定的抗β-內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物； (4)小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物的制備:將步驟(3)中的抗β_內(nèi)酰胺類抗生素受體替換為陰性小鼠的純化血清，重復(fù)步驟(3)，得到小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物； (5)制作配套使用的結(jié)合微孔板:將步驟(3)和步驟(4)得到的抗β_內(nèi)酰胺類抗生素受體-膠體金標(biāo)記物和小鼠陰性血清-膠體金標(biāo)記物按體積比1:1混合后，取10 μ L混合物包被在96微孔板上； (6)硝酸纖維素膜的處理:將氨芐西林-BSA偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應(yīng)墊的硝酸纖維素膜上，依次作為檢測(cè)線和控制線，在37°C烘箱干燥； (7)試紙條的組裝:將樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依次黏附在PVC背襯上，用切條機(jī)切割成3mm寬的細(xì)條，即得到用于檢測(cè)的免疫層析試紙條，4°C冷藏備用。
3.權(quán)利要求1所述基于受體的檢測(cè)內(nèi)酰胺類抗生素的免疫膠體金試紙條的應(yīng)用，其特征在于可以檢測(cè)至少15種β內(nèi)酰胺類抗生素；分別為阿莫西林，氨芐西林、青霉素G、青霉素V、鄰氯青霉素，雙氯青霉素，萘夫西林、苯唑西林、頭孢克洛，頭孢替唑、頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢哌酮、頭孢硫脒，頭孢吡肟。
【文檔編號(hào)】G01N33/532GK103983775SQ201410254564
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】匡華, 胥傳來, 郭靖男, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:無錫杰圣杰康生物科技有限公司, 江南大學(xué)