鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測微囊藻毒素-lr的方法
【專利摘要】鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測微囊藻毒素-LR的方法，屬免疫分析化學【技術(shù)領(lǐng)域】。以Pd納米顆粒為晶種子制備出具有中空結(jié)構(gòu)的Pd-Au雙金屬納米籠，用于標記微囊藻毒素-LR單克隆抗體噴涂到結(jié)合墊，于檢測線上噴涂BSA偶聯(lián)微囊藻毒素-LR，以羊抗鼠IgG噴涂控制線制得用于快速檢測水體中微囊藻毒素-LR的免疫層析片條，用競爭免疫層析法，通過讀取檢測線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對試樣中微囊藻毒素-LR進行定量分析。由于合金中兩種金屬元素的協(xié)同作用，Pd-Au合金對蛋白質(zhì)分子中的巰基和氨基結(jié)合力高于單金屬金納米籠的結(jié)合力，因此在用Pd-Au合金納米籠標記微囊藻毒素抗體時，比用金納米籠標記時更容易，形成的Pd-Au合金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物更穩(wěn)定。
【專利說明】鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測微囊藻毒素-LR的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬免疫分析化學【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]富營養(yǎng)化嚴重的淡水湖泊，每年夏天氣溫上升均要引起藍藻爆發(fā)，造成嚴重污染。在藍藻大家族中，有一些種類會分泌較強的毒素[見史紅星，曲久輝，王愛民等，官廳水庫藍綠藻及藻毒素初步研究，高等學?；瘜W學報，2005, 26 (9): 1650-1652]，而微囊藻毒素(microcystins，MCs)是其中的典型代表。其中2，4位上含亮氨酸和精氨酸的MCs-LR是已知的最易出現(xiàn)和毒性最強的環(huán)狀七肽肝毒素，是淡水藻類植物中的促癌因子[見Yu
S.Z., Chen G., Zhi X.L., et al.Primary liver cancer:natural toxins and prevention inChina (J).Toxicol Sci, 1998, 23 (Suppl2): 143-148 ；以及見俞順章，趙寧,資曉林等，飲水中微囊藻毒素與我國原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究，(J).中華腫瘤雜志，2001，23(2):96-99]，具有腎毒性、免疫毒性和明顯的肝毒性，動物飲用藻類毒素污染的水可發(fā)生中毒甚至死亡[見 Carmichael ff.ff., Jones C.L.A., Mahmood N.A., et al.Algal toxins and waterbased disease (J).CRC Crit, Rev.Environ.Control 1985 ； 15:275-313]。同時，微囊藻毒素是蛋白磷酸酶的抑制劑，它能夠激活人體內(nèi)的癌基因，同時抑制抗癌基因，使抗癌基因失活，使癌癥發(fā)生的可能性提高近10倍。有研究表明，長期通過喝水接觸此類毒素可能會誘發(fā)原發(fā)性肝癌，提高腫瘤的活性引發(fā)死亡[見陳剛，俞順章，衛(wèi)國榮等.肝癌高發(fā)區(qū)飲用水型中微囊藻毒素含量調(diào)查(J)中華預防醫(yī)學雜志，1996 ;30(1):6-9;以及見Gupta N., Pant S.C., Vijayaraghavan R., et al, Comparative toxicity evaluation ofcyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants(LR, RR, YR)in mice (J), Toxicology, 2003, 188 (2-3): 285 - 296.以及 Puerto M, Pichardo S, Jos A, et al, Comparisonof the toxicity induced by microcystin-RR and microcystin—YR in differentiated andundifferentiated Caco_2cells (J), Toxicon, 2009, 54 (2): 161-169.]。而自來水廠的氯消毒過程不僅不能除去藻類毒素，反而有可能增加其致突活性[見崔瑩，徐祖信，尹海龍.水中藻類污染物及其藻毒素分析方法研究進展(J).安徽農(nóng)業(yè)科學.2008，36 (29):12873-12875，12878]。WHO和我國限定飲用水中微囊藻毒素MC-LR含量不得大于l.0yg/mL(GB5749-2006)。因此，建立靈敏、特異的水中微囊藻毒素檢測方法具有重要的意義。
[0003]微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR)，分子式為C49H74NltlO12,分子量為9%D(道爾頓)，其結(jié)構(gòu)式見圖1。
[0004]微囊藻毒素的檢測方法可分為生物測試法、化學分析法、生化分析法等。；化學檢測包括毛細管電泳(CE)、核磁共振(NMR)、色質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等，其中使用最為廣泛和成熟的方法是高效液相色譜(HPLC)。生化分析法包括酶聯(lián)免疫吸附法和蛋白磷酸酶抑制法，如Camp'as等采用競爭酶聯(lián)免疫法和絲網(wǎng)印刷電極實現(xiàn)了對微囊藻毒素的安培檢測。鞠煶先等將抗體共價結(jié)合到富含羧基的碳納米角上構(gòu)建了靈敏的競爭型微囊藻毒素電化學免疫傳感器。以上方法不僅依賴大型儀器設(shè)備，而且需要具有專門操作技術(shù)人員，不能用于現(xiàn)場分析，限制了這些方法的普及應(yīng)用。
[0005]近幾年隨著生化免疫技術(shù)以及酶聯(lián)免疫技術(shù)的進一步發(fā)展，快速、簡便、易操作的免疫層析技術(shù)法開始被廣泛地應(yīng)用到水體中微囊藻素的檢測中。但所用標記物金溶膠存在容易團聚，不易保存等缺點。
[0006]本專利 申請人:在此以前申請?zhí)枮?01310610348.8的中國專利申請，公開了一種免疫層析試紙條檢測微囊藻毒素-LR的方法，通過一步制備法制得具有中空結(jié)構(gòu)的金納米籠(Au NCs)，將其標記到Anti MC-LR上制得金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物,將BSA偶聯(lián)的微囊藻毒素-LR、IgG分別噴涂于硝酸纖維素膜上作檢測線以及控制線制得免疫層析片條；利用競爭免疫層析法，通過讀取檢測線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對試樣中微囊藻毒素-LR進行定量分析。不但克服了試紙條技術(shù)中金溶膠不易保存的缺點，而且操作簡單，抗體的修飾需要的時間較短。由于技術(shù)在不斷進步，還需要在此基礎(chǔ)上進一步開發(fā)出更好的免疫層析試紙條檢測微囊藻毒素-LR的方法。
[0007]合金納米材料又稱二元或多元金屬納米材料，是由兩種或兩種以上的金屬或非金屬所組成的具有金屬特性的物質(zhì)。由于合金中兩種金屬元素的協(xié)同作用而導致合金的催化活性大大增加并且具有許多獨特的性能，近年來引起了國內(nèi)外眾多研究者的興趣。Zhang等首先利用水熱法合成了平均由147個Pd原子組成的Pd納米顆粒，然后在N2的保護下將Au原子從溶液中置換到Pd納米顆粒上，成功合成的Pd-Au雙金屬納米顆粒，它的化學催化性能和生物相容性比單一的Pd、Au金屬納米顆粒的更加令人滿意[Zhang H, Watanabe T, Okumura M, et al.Catalytically highly active top gold atom onpalladium nanocluster [J].Nature materials, 2012, 11 (I):49-52.]。Xia 等通過相繼將HAuCl4和Na2PdCl4加到Ag納米立方體中還原得到Ag/Au/Pd三金屬納米籠[Cobley, C.M.；Campbell, D.J.;Xia，Y.Tailoring the optical and catalytic properties of gold-silvernanoboxes and nanocages by introducing palladium.Adv.Mater.2008，20(4): 748-752]。他們還通過先合成Pd納米立方體，以此為晶種子，再加入HAuCl4用抗壞血酸在Pd晶種子上還原出金制得Pd-Au合金納米立方體[Lim B.K., Li Z.Y., Xia Y., et.al.Synthesisof Pd-Au bimetallic nanocrystals via controlled overgrowth[J].J.Am.Chem.Soc.2010, 132(8): 2506-2507.]。但到目前為止，未見有將Pd-Au合金納米顆粒應(yīng)用于免疫層析技術(shù)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是克服目前常用著色標記物金納米顆粒溶膠不宜保存的缺點，提供相比申請?zhí)枮?01310610348.8的中國專利申請技術(shù)性能更好的方法，即一種鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測微囊藻毒素-LR的方法。
[0009]本發(fā)明方法如下:首先以Pd納米顆粒為晶種子制備出具有中空結(jié)構(gòu)的Pd-Au雙金屬納米籠，并用于標記微囊藻毒素-LR單克隆抗體噴涂到結(jié)合墊，于檢測線上噴涂BSA偶聯(lián)微囊藻毒素-LR，以羊抗鼠IgG噴涂控制線制得用于快速檢測水體中微囊藻毒素-LR的免疫層析片條，用競爭免疫層析法，通過讀取檢測線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對試樣中微囊藻毒素-LR進行定量分析。[0010]所說以Pd納米顆粒為晶種子制備具有中空結(jié)構(gòu)的Pd-Au雙金屬納米籠，其方法雖然為現(xiàn)有技術(shù)，但最好按如下過程進行:將54~56mL PVP, 298~302mgL_抗壞血酸、1498~1502mg KBr和284~286mg氯鈀酸混合并加熱至沸騰，在勻速攪拌下反應(yīng)2.9~3.5小時，冷卻到室溫后，離心分離產(chǎn)物，并用無水乙醇和去離子水反復沖洗三到五次，以除去其中溶解的溴化物，所得產(chǎn)物密封保存做下一步合成的種子；用以上一步合成的Pd納米籠作為晶種子合成Pd-Au納米籠顆粒,取19~21ml的去離子水,加入0.48~0.51ml已濃縮好的Pd納米立方體溶液，4.9~5.1mgPVP和2.9~3.1mgL^1抗壞血酸，將此混合液加熱到沸騰反應(yīng)19~21min，并保持勻速攪拌，將10_12mg氯金酸分散到1.9~2.1ml的去離子水中，并逐滴加入到上述反應(yīng)液中，再將該混合液加熱至沸騰狀態(tài)反應(yīng)14~16min，待溫度冷卻到室溫，離心分離產(chǎn)物，用無水乙醇和去離子水洗滌，濃縮即得。
[0011]考察了 Pd-Au NCs/Anti MC-LR結(jié)合物的用量以及檢測底液等條件對檢測結(jié)果的影響。在最優(yōu)條件下，片條對微囊藻毒素-LR濃度響應(yīng)范圍為0.1ng/mL至50ng/mL,檢測下限為 0.03ng/mL。
[0012]該方法操作簡單，無需大型儀器或?qū)I(yè)技術(shù)人員，可用于微囊藻毒素的現(xiàn)場快速檢測。
[0013]本發(fā)明方法與申請?zhí)枮?01310610348.8的中國專利申請技術(shù)使用性能對比如下=Pd-Au雙金屬納米籠狀顆粒的光吸收截面高于金納米籠的吸收截面，因此基于Pd-Au雙金屬納米籠狀顆粒制備的免疫層析片條檢測微囊藻毒素的靈敏度比申請?zhí)枮?01310610348.8的中國專利申請技術(shù)的靈敏度高，響應(yīng)信號明顯增強。圖2為不同標記物制作的免疫層析片條對相同濃度微囊藻毒素的灰度響應(yīng)值比較，從圖中可看出，Pd-Au雙金屬納米籠為標記物的片條的響應(yīng)明顯大于用金納米籠為標記物的片條的響應(yīng)。
[0014]本發(fā)明的有益效果:和申請?zhí)枮?01310610348.8的中國專利申請技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是:由于合金中兩種金屬元素的協(xié)同作用，Pd-Au合金對蛋白質(zhì)分子中的巰基和氨基結(jié)合力高于單金屬金納米籠的結(jié)合力，因此在用Pd-Au合金納米籠標記微囊藻毒素抗體時，比用金納米籠標記時更容易，形成的Pd-Au合金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物更穩(wěn)定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為微囊藻毒素結(jié)構(gòu)式。
[0016]圖2不同標記物的免疫層析片條對同濃度微囊藻毒素的響應(yīng)灰度值比較
[0017]圖3為實施例Pd-Au納米籠的透射電鏡圖。
[0018]圖4為免疫層析片條結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019]圖5為實施例不同濃度的MC-LR的測試圖片。
[0020]圖6為實施例免疫層析片條的校準曲線。
[0021]圖7為不同的展開底液對檢測結(jié)果的影響
[0022]圖8為檢測線噴涂次數(shù)對檢測結(jié)果的影響
[0023]圖9為Pd-Au納米籠標記單克隆抗體用量對檢測結(jié)果的影響。
【具體實施方式】[0024]實施例，其步驟為:
[0025]I鈀-金合金納米籠Pd-Au NCs的制備
[0026]鈀-金合金納米籠按下述方法制備:參照修改過的Xia等的方法制備金納米籠[Lim B.K., Li Z.Y., Xia Y., et.al.Synthesis of Pd-Au bimetallic nanocrystals viacontrolled overgrowth (J).J.Am.Chem.Soc.2010, 132 (8):2506-2507.]。將 55mL PVP(MW=38000)，300mgL-抗壞血酸、1500mg KBr和285mg氯鈀酸混合并加熱到80°C (至沸騰)，在勻速攪拌下反應(yīng)3小時，冷卻到室溫后，離心分離產(chǎn)物，并用無水乙醇和去離子水反復沖洗三到五次，以除去其中溶解的溴化物。所得產(chǎn)物密封保存做下一步合成的種子。
[0027]以上一步合成的Pd納米籠作為晶種子合成Pd-Au納米籠顆粒。取20ml的去離子水，加入0.5ml已濃縮好的Pd納米立方體溶液，5mgPVP和SmgI/1抗壞血酸。將此混合液加熱到沸騰反應(yīng)20min，并保持勻速攪拌。將10-12mg的氯金酸分散到2ml的去離子水中，并逐滴加入到上述反應(yīng)液中，再將該混合液加熱至沸騰狀態(tài)反應(yīng)15min。待溫度冷卻到室溫，離心分離產(chǎn)物，用無水乙醇和去離子水洗滌，濃縮5倍，密封保存以后待用。圖3為制得的Pd-Au納米籠的透射電鏡圖。
[0028]2鈀-金合金納米籠標記單克隆抗體結(jié)合物的制備及純化
[0029]通過參照Peng Zhaofeng 等[Gupta N., Pant S.C., Vijayaraghavan R., etal, Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxinmicrocystin variants (LR, RR, YR) in mice (J), Toxicology, 2003, 188 (2-3): 285 - 296.]的方法合成該結(jié)合物。將所合成的鈀-金合金納米籠用于標記單克隆抗體制得結(jié)合物(Pd-AuNCs-Anti MC-LR)。取125 μ L經(jīng)五倍濃縮過的Pd-Au NCs溶液，用200mM碳酸鈉調(diào)節(jié)pH為9。加入1.2mg/mL Anti MC-LR抗體5 μ L，每次加I μ L，間隔三分鐘，滴加完成后，室溫振搖2h。為封閉Pd-Au NCs的多余的結(jié)合位點，將12.5 μ L BSA (10% )滴加進混合溶液中繼續(xù)振搖0.5h。隨后以14000r/min轉(zhuǎn)速，低溫(12°C )離心15min，棄去上層清液，下層物質(zhì)用PBS洗滌兩次，最后分散在 0.5mL 洗脫液(20mmol/L Na3PO4.12H20, 5% BSA, 0.25% Tween20,和10%蔗糖)中。獲得的Pd-Au NCs/Anti MC-LR溶液4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0030]3免疫層析試紙條的制備
[0031]樣品墊GF-08裁剪成16mmX30cm長條，浸泡于預先配制好的樣品墊處理液中(0.25% Triton X-100, 0.05mol/L Tris - HCl,和 0.15mmol/L NaCl) 30min 后烘干備用。將玻璃纖維的金膠結(jié)合墊裁剪成0.8?1.0cmX 30cm長條，同時將吸收墊裁剪成1.7cmX30cm長條備用。
[0032]選取不同的硝酸纖維素膜Milliporel35或Milliporel80在噴條機BiodotXYZ3060上進行噴片操作。將二抗(羊抗鼠IgG)稀釋成2mg/mL后用噴片機噴涂在距硝酸纖維素膜邊緣Icm處做為控制線(C線)，然后將Microcystins-BSA稀釋成0.2mg/mL噴涂在距硝酸纖維素膜另一邊Icm處作為檢測線(T線)，噴涂不同次數(shù)時，每次都要在37 C供干后再嗔涂。最后嗔涂完成后于37 C供干2h。片條按圖2所不組裝,其中I為樣品墊，2為硝酸纖維素膜，3為PVC底板，4為吸收墊，5為檢測線(T線)，6為控制線(C線)，7為結(jié)合物釋放墊，箭頭表示流向(見圖4)。
[0033]4樣品的測定
[0034]測試之前將3 μ L Pd-Au NCs-Anti MC-LR滴在金膠結(jié)合墊上并干燥lOmin。將微囊藻毒素-LR用0.0lmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制成不同濃度的標準溶液，各取80 μ L，將片條放入溶液中展開lOmin。溶液中的微囊藻毒素-LR抗原與一部分Pd-Au納米籠/抗體結(jié)合物(Pd-Au NCs/Anti MC-LR)結(jié)合形成 Pd-Au NCs/Anti MC-LR/MC-LR 免疫復合物，由于毛細管作用帶動著未結(jié)合抗原的Pd-Au納米籠/抗體結(jié)合物(Pd-Au NCs/Anti MC-LR)一起流動到T線上，此時T線上固定的BSA-MC-LR與溶液中的MC-LR競爭結(jié)合Pd-Au NCs/Anti MC-LR，將還未結(jié)合抗原的Pd-Au NCs/Anti MC-LR捕獲在T線上形成Pd-Au NCs/AntiMC-LR/BSA-MC-LR免疫結(jié)合物，并在檢測線上聚積顯現(xiàn)出一條可見的色帶。Pd-Au NCs-AntiMC-LR結(jié)合溶液中抗原(MC-LR)所形成的Pd-Au NCs/Anti MC-LR/MC-LR免疫復合物繼續(xù)流動，到固定有二抗(羊抗鼠IgG)的C線上被捕獲。此時，再加入30 μ L PBS沖洗片條。將片條放入讀條機中，即可用讀取片條上T/C線的灰度值。測試溶液中微囊藻毒素-LR的含量越高，競爭結(jié)合Pd-Au NCs-Anti MC-LR的可能性越大，則T線上結(jié)合Pd-Au NCs-Anti MC-LR的可能性就越低，顏色越淺。與此相反，固定有二抗(羊抗鼠IgG)的C線捕獲免疫復合物(Pd-Au NCs/Anti MC-LR)的可能性越大，顏色越深。根據(jù)不同標準濃度的溶液對應(yīng)著不同灰度值，即可獲得檢測微囊藻藻毒素-LR的標準校正曲線，進而實現(xiàn)對未知水樣中的微囊藻毒素-LR進行定量分析。
[0035]圖5為不同濃度的MC-LR的測試圖片。圖6為免疫層析片條的校準曲線。
[0036]優(yōu)化條件的實驗
[0037]測試底液對檢測結(jié)果影響
[0038]考察了 PBS、PBS+BSA、PBS+Tween、PBS+BSA+Tween四種不同底液對片條檢測結(jié)果的影響，結(jié)果見圖7。從中可以看出，PBS做檢測底液時檢測效果最好，所以選取PBS為測試底液。
[0039]檢測線噴涂次數(shù)對檢測結(jié)果的影響
[0040]由于吸附在硝酸纖維素膜上的BSA-MC-LR總量受噴涂次數(shù)的影，進而對灰度值的檢測也有很大的影響。因此，實驗選取同一批次制作的、且檢測線分別噴涂I次、2次、3次的片條對同一濃度的微囊藻毒素-LR溶液進行測量，結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，噴涂次數(shù)為2次時灰度值最大，檢測結(jié)果最好，故選取T線噴涂兩次為最后條件。
[0041]Pd-Au納米籠標記單克隆抗體用量的影響
[0042]也考察了 Pd-Au納米籠標記單克隆抗體(Pd-Au NCs/Anti MC-LR結(jié)合物)的不同滴加量對同一濃度標準溶液檢測結(jié)果產(chǎn)生的影響。結(jié)果見圖9。由圖9可知，在金納米籠標記單克隆抗體量為3 μ L時，檢測灰度值已經(jīng)很大，為節(jié)約用量，固定每次測試時滴加的金納米籠標記單克隆抗體量為3 μ L。
[0043]硝酸纖維素膜的選擇
[0044]硝酸纖維素膜的不同，會影響檢測結(jié)果的靈敏度。實驗選取了 HF135和HF180兩種不同硝酸纖維素膜在相同的實驗條件下制作層析片條并對同一濃度的標準溶液進行了對比檢測實驗，結(jié)果見表I。由表I可知使用HF135的硝酸纖維素膜的片條檢測效果優(yōu)于使用HF180的硝酸纖維素膜的片條，相對標準偏差僅為4.77%。因此選取HF135型號的硝酸纖維膜制作片條。
[0045]表I兩種不同的硝酸纖維素膜檢測結(jié)果對比
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于:首先以Pd納米顆粒為晶種子制備出具有中空結(jié)構(gòu)的Pd-Au雙金屬納米籠，并用于標記微囊藻毒素-LR單克隆抗體噴涂到結(jié)合墊，于檢測線上噴涂BSA偶聯(lián)微囊藻毒素-LR，以羊抗鼠IgG噴涂控制線制得用于快速檢測水體中微囊藻毒素-LR的免疫層析片條，用競爭免疫層析法，通過讀取檢測線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對試樣中微囊藻毒素-LR進行定量分析。
2.如權(quán)利要求1所述的鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測微囊藻毒素-LR的方法,其特征在于:將54~56mL PVP, 298~302mgL_抗壞血酸、1498~1502mg KBr和284~286mg氯鈀酸混合并加熱至沸騰，在勻速攪拌下反應(yīng)2.9~3.5小時，冷卻到室溫后，離心分離產(chǎn)物，并用無水乙醇和去離子水反復沖洗三到五次，以除去其中溶解的溴化物，所得產(chǎn)物密封保存做下一步合成的種子；用以上一步合成的Pd納米籠作為晶種子合成Pd-Au納米籠顆粒，取19~21ml的去離子水，加入0.48~0.51ml已濃縮好的Pd納米立方體溶液，4.9~5.1mgPVP和2.9~3.1mgL^1抗壞血酸，將此混合液加熱到沸騰反應(yīng)19~21min,并保持勻速攪拌，將10_12mg氯金酸分散到1.9~2.1ml的去離子水中，并逐滴加入到上述反應(yīng)液中，再將該混合液加熱至沸騰狀態(tài)反應(yīng)14~16min，待溫度冷卻到室溫，離心分離產(chǎn)物，用無水乙醇和去離子 水洗滌，濃縮即得。
3.如權(quán)利要求2所述的鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于:以PBS為測試底液，T線噴涂兩次，每次測試時滴加的金納米籠標記單克隆抗體量為3 μ L，以HF135型號的硝酸纖維膜制作片條。
【文檔編號】G01N33/577GK103995122SQ201410262215
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】楊云慧, 王勤, 牛司朋, 唐賽賽, 尹寒蕊, 崔光鑫, 黃貴春, 鄭麗 申請人:云南師范大學