一種蠶沙藥材的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于中藥材檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種蠶沙藥材的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法通過(guò)HPLC法測(cè)定1-脫氧野尻霉素的含量，進(jìn)而對(duì)蠶沙藥材進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法快速、全面、針對(duì)性強(qiáng)，有利于對(duì)該藥材的質(zhì)量進(jìn)行有效控制，有助于提高該藥材使用的安全性和穩(wěn)定性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種蠶沙藥材的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥材檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種蠶沙藥材的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蠶沙又稱(chēng)晚蠶沙、蠶屎、馬鳴肝、晚蠶矢、二蠶沙等，為蠶娥科昆蟲(chóng)家蠶的干燥糞便。干燥的蠶沙呈圓柱型小粒，微有青草氣，色黑，堅(jiān)實(shí)，均勻。臨床上，蠶沙具有祛風(fēng)除濕、活血定痛之功能，治療除風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢、頭風(fēng)頭痛、皮膚不仁、關(guān)節(jié)不遂、急劇吐瀉轉(zhuǎn)筋、腰腳冷涌、爛弦風(fēng)眼等癥。研究表明，蠶沙中主要有效部位是總生物堿，其代表成分為1-脫氧野尻霉素，該生物堿是一種天然糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，具有很高的a-葡萄糖苷酶抑制活性，可用于治療糖尿病、肥胖癥、病毒感染等疾病。
[0003]然而現(xiàn)有的蠶沙藥材的檢測(cè)方法通常采用茚三酮反應(yīng)或TLC鑒別或?qū)ε煽闪炙徇M(jìn)行檢測(cè)，不僅檢測(cè)的指標(biāo)較為單一，而且不能檢測(cè)其中的生物堿的含量，不利于從整體上對(duì)該藥材或者含有該藥材的藥物的質(zhì)量進(jìn)行有效控制。因此，建立一種快速、全面、針對(duì)性強(qiáng)的蠶沙藥材的質(zhì)量檢測(cè)及質(zhì)量控制的方法具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于現(xiàn)有的蠶沙藥材的檢測(cè)方法檢測(cè)的指標(biāo)較為單一，不能檢測(cè)其中的生物堿的含量，不利于從整體上對(duì)該藥材或者含有該藥材的藥物的質(zhì)量進(jìn)行有效控制，從而提出一種快速、全面、針對(duì)性強(qiáng)的蠶沙藥材的質(zhì)量檢測(cè)及質(zhì)量控制的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0006]本發(fā)明的一種蠶沙藥材的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括如下對(duì)1-脫氧野尻霉素的含量測(cè)定步驟:
[0007]精密稱(chēng)定1-脫氧野尻霉素對(duì)照品5-15mg,加水稀釋制成每mL含0.1-0.5mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取ImL所述對(duì)照品儲(chǔ)備液，并精密加入質(zhì)量濃度為1-3%的NaHCO3溶液l-4mL以及l(fā)-3mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液l_4mL，混勻并于30_60°C進(jìn)行水浴反應(yīng)20-40min，隨后以30-60%的乙腈定容至20_30mL，作為對(duì)照品溶液；
[0008]取待測(cè)藥材研細(xì)，并精密稱(chēng)取0.5-2.0g，加入用濃鹽酸調(diào)pH值為3_4的水30-60mL，攪拌均勻，超聲處理20-30min，并離心取上清液；殘?jiān)觩H值為3_4的水適量洗滌，離心合并上清液，并濃縮至10-20mL ;將濃縮液置于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，先用水洗脫，收集并棄去水洗脫液，再用0.5M氨水洗脫，并收集氨水洗脫液，濃縮至近干，隨后加水IOmL溶解，超聲處理1-5分鐘，并加水定容至20-30mL，得到供試品儲(chǔ)備液；精密量取ImL所述供試品儲(chǔ)備液，依次加入質(zhì)量濃度為1-3 %的NaHCO3溶液lmL、以及l(fā)_3mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混勻并于30°C進(jìn)行水浴反應(yīng)40min，隨后以30-60%的乙腈定容至20_30mL，作為供試品溶液；
[0009]照高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙睛為流動(dòng)相A、以0.2%的磷酸溶液為流動(dòng)相B按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫:0-8min，A:B為25%:75% ；8-40min, A:B 為 25%:75%— 50%:50% ；40-45min, A:B 為 50%:50% ;45_46min，A:B 為50%:50%^ 25%:75% ；46-75min, A:B 為 25%:75% ;控制流速 1.0mL/min，柱溫 25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)263nm，理論板數(shù)按1-脫氧野尻霉素峰計(jì)算應(yīng)不低于6000 ；
[0010]精密吸取所述對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。
[0011]本發(fā)明上述蠶沙藥材的檢測(cè)方法，所述對(duì)1-脫氧野尻霉素的含量進(jìn)行測(cè)定的步驟包括:
[0012]精密稱(chēng)定1-脫氧野尻霉素對(duì)照品10mg，加水稀釋制成每mL含0.2mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取ImL所述對(duì)照品儲(chǔ)備液，并精密加入質(zhì)量濃度為2%的NaHCO3溶液ImL以及2mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混勻并于30°C進(jìn)行水浴反應(yīng)40min，隨后以50%的乙腈定容至25mL，作為對(duì)照品溶液；
[0013]取待測(cè)藥材研細(xì)，并精密稱(chēng)取lg，加入用濃鹽酸調(diào)pH值為3-4的水50mL，攪拌均勻，超聲處理30min，并離心取上清液；殘?jiān)觩H值為3_4的水適量洗滌，離心合并上清液，并濃縮至20mL ;將濃縮液置于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，先用水洗脫，收集并棄去水洗脫液，再用0.5M氨水洗脫，并收集氨水洗脫液，濃縮至近干，隨后加水IOmL溶解，超聲處理2分鐘，并加水定容至25mL，得到供試品儲(chǔ)備液；精密量取ImL所述供試品儲(chǔ)備液，依次加入質(zhì)量濃度為2%的NaHCO3溶液lmL、以及l(fā)mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混勻并于30°C進(jìn)行水浴反應(yīng)40min，隨后以50%的乙腈定容至25mL，作為供試品溶液；
[0014]照高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙睛為流動(dòng)相A、以0.2%的磷酸溶液為流動(dòng)相B按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫:0-8min，A:B為25%:75% ；8-40min, A:B 為 25%:75%— 50%:50% ；40-45min, A:B 為 50%:50% ;45_46min，A:B 為50%:50%^ 25%:75% ；46-75min, A:B 為 25%:75% ;控制流速 1.0mL/min，柱溫 25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)263nm，理論板數(shù)按1-脫氧野尻霉素峰計(jì)算應(yīng)不低于6000 ；
[0015]精密吸取所述對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。
[0016]本發(fā)明上述蠶沙藥材的檢測(cè)方法，上述1-脫氧野尻霉素的含量測(cè)定步驟中，上述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱為DOOl-CC型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，樹(shù)脂體積為50mL，徑高比為1:8。
[0017]本發(fā)明蠶沙藥材的檢測(cè)方法，還包括將上述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行前處理的步驟，上述前處理具體包括如下步驟:用等體積的2M鹽酸浸泡DOOl-CC型離子交換樹(shù)脂4小時(shí)以上；再用4倍樹(shù)脂體積的2M鹽酸沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用5倍樹(shù)脂體積的2M NaOH溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用5倍樹(shù)脂體積的2M鹽酸溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用5倍樹(shù)脂體積的2M NaOH溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用3倍樹(shù)脂體積的2M鹽酸溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性，即可。
[0018]本發(fā)明上述蠶沙藥材的檢測(cè)方法，上述1-脫氧野尻霉素的含量測(cè)定步驟中，上述超聲處理的條件為:功率300W，頻率50KHz。
[0019]本發(fā)明上述蠶沙藥材的檢測(cè)方法，該方法還包括如下鑒別和/或含量測(cè)定的步驟中的至少一種:
[0020]A、茚三酮反應(yīng)
[0021]取待測(cè)藥材粉末0.1-0.3g，置具塞試管中，加熱水3_7mL，加塞振搖并濾過(guò)；取濾液lmL，加茚三酮試液3~4滴，搖勻，放入沸水浴中加熱，觀察溶液顏色變化；[0022]B、TLC 鑒別
[0023]取待測(cè)藥材粗粉約0.5-1.5g，加無(wú)水乙醇5_15mL，加熱回流半小時(shí)，放冷，濾過(guò)，濾液用少許活性炭脫色，濾過(guò)，濾液濃縮至約lmL，作為供試品溶液；
[0024]另取β -谷甾醇對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每ImL含0.5mg的溶液,作為對(duì)照品溶液；
[0025]照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μ L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以體積比為18-19.8:0.2-2.0的三氯甲烷-丙酮為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干；噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C烘干15分鐘，鑒別；
[0026]C、HPLC法測(cè)定派可林酸的含量
[0027]精密稱(chēng)定派可林酸對(duì)照品3-8mg，加水稀釋定容至50mL ;精密量取0.5-2.0mL溶液，依次加水0.5-2.0mL、加質(zhì)量濃度為0.8%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液l_3mL以及0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液l_3mL，于60-90 °C水浴反應(yīng)0.5-2.0小時(shí)，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為對(duì)照品溶液；
[0028]精密稱(chēng)定待測(cè)藥材0.3-0.8g，加水振搖后，于60-90°C水浴中加熱20_40分鐘，放冷后加水定容至10mL，搖勻并離心后，精密量取上清液l_3mL，并依次加入質(zhì)量濃度為0.8%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液l_3mL和0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液l_3mL，于60_90°C水浴反應(yīng)0.5-2.0小時(shí)，放冷后用pH7.0,0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為供試品溶液；
[0029]照高效液相色譜法試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為15-25:0.1-1:75-85的乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸鈉溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為390nm ;理論板數(shù)按派可林酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2500 ；
[0030]分別精密吸取對(duì)照品溶液4-6 μ L與供試品溶液5-15 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。
[0031]本發(fā)明上述蠶沙藥材的檢測(cè)方法，該方法還包括如下鑒別和/或含量測(cè)定的步驟中的至少一種:
[0032]Α、茚三酮反應(yīng)
[0033]取待測(cè)藥材粉末0.2g，置具塞試管中，加熱水5mL，加塞振搖5分鐘，濾過(guò)；取濾液lmL，加茚三酮試液3?4滴，搖勻，放入沸水浴中加熱，觀察溶液顏色變化；
[0034]B、TLC 鑒別
[0035]取待測(cè)藥材粗粉約lg，加無(wú)水乙醇10mL，加熱回流半小時(shí)，放冷，濾過(guò)，濾液用少許活性炭脫色，濾過(guò)，濾液濃縮至約lmL，作為供試品溶液；
[0036]另取β -谷甾醇對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每ImL含0.5mg的溶液,作為對(duì)照品溶液；
[0037]照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μ L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以體積比為19.5:0.5的三氯甲烷-丙酮為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干；噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C烘干15分鐘，鑒別；
[0038]C、HPLC法測(cè)定派可林酸的含量
[0039]精密稱(chēng)定派可林酸對(duì)照品5mg，加水稀釋定容至50mL ;精密量取ImL溶液，依次加水lmL、加質(zhì)量濃度為0.8%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液2mL以及0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液2mL，于60°C水浴反應(yīng)I小時(shí)，放冷后用pH7.0,0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為對(duì)照品溶液；
[0040]精密稱(chēng)定待測(cè)藥材0.4g，加水振搖后，于60°C水浴中加熱30分鐘，放冷后加水定容至10mL，搖勻并離心后，精密量取上清液2mL，并依次加入質(zhì)量濃度為0.8%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液2mL，于60°C水浴反應(yīng)I小時(shí)，放冷后用pH7.0,0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為供試品溶液；
[0041]照高效液相色譜法試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為21:0.5:79的乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸鈉溶液為流動(dòng)相，
[0042]檢測(cè)波長(zhǎng)為390nm ;理論板數(shù)按派可林酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2500 ；
[0043]分別精密吸取對(duì)照品溶液5 μ L與供試品溶液10 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。
[0044]本發(fā)明的上述蠶沙藥材的檢測(cè)方法，通過(guò)HPLC法測(cè)定1-脫氧野尻霉素的含量對(duì)蠶沙進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)方法快速、全面、針對(duì)性強(qiáng)，有利于對(duì)該藥材的質(zhì)量進(jìn)行有效控制，有助于提高該藥材使用的安全性和穩(wěn)定性。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中
[0046]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的1-脫氧野尻霉對(duì)照品色譜圖；
[0047]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的蠶沙供試品色譜圖；
[0048]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的試劑空白色譜圖；
[0049]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1的1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050]實(shí)施例1 HPLC法測(cè)定1-脫氧野尻霉素的含量
[0051]I儀器與試藥
[0052]Agilent-1200高效液相色譜儀包括:真空脫氣機(jī)，四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，二級(jí)管陣列檢測(cè)器(DAD), Agilent-Chemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Agilent公司)；超純水器(MilliQ-Gradient型);超聲波發(fā)生器(昆山KQ-300E型)。
[0053]1-脫氧野尻霉素對(duì)照品(購(gòu)于SIGMA公司)，芴甲氧羰酰氯(購(gòu)于SIGMA公司)，乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。
[0054]2方法與結(jié)果
[0055]2.1對(duì)照品溶液、供試品溶液與空白樣品溶液的制備
[0056]2.1.1對(duì)照品溶液的制備
[0057]取1-脫氧野尻霉素對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成每HiL含0.2mg的對(duì)照品溶液。精密量取lmL，至25mL量瓶中，加入2% NaHCO3溶液ImL,振搖10秒,精密加入2mg/mL的荷甲氧羰酰氯乙腈溶液(FMOC-Cl) 4mL,振搖10秒，30°C水浴反應(yīng)40min，用50%乙腈定容至25mL，即得。
[0058]2.1.2供試品溶液的制備
[0059]DOOl-CC型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的前處理:順次用等體積的2M鹽酸浸泡DOOl-CC型離子交換樹(shù)脂4小時(shí)以上，再用4倍樹(shù)脂體積的2M鹽酸沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用5倍樹(shù)脂體積的2M NaOH溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用5倍樹(shù)脂體積的2M鹽酸溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用5倍樹(shù)脂體積的2M NaOH溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；再用3倍樹(shù)脂體積的2M鹽酸溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性，備用。
[0060]取待測(cè)蠶沙藥材研細(xì)，取約lg，精密稱(chēng)定，置IOOmL燒杯中，加用濃鹽酸調(diào)pH值為3-4的水50mL，攪拌均勻，超聲處理(功率300W，頻率50KHz) 30min，離心10min (4000轉(zhuǎn)/min),分取上清液,殘洛加pH值為3_4的水適量洗漆,離心10min (4000轉(zhuǎn)/min),合并上清液，濃縮至約20mL。置已處理過(guò)的D001-CC型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱(樹(shù)脂體積50mL，徑(2.5cm)高比:1:8，H+),先用60mL水洗脫，棄去洗脫液，再用0.5M氨水600mL洗脫(洗脫速度為2.5mL/min)，收集氨水洗脫液，濃縮至近干，加水10mL，超聲處理(功率300W，頻率50KHz)2分鐘，轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取lmL，至25mL量瓶中，加入2% NaHCO3溶液ImL,振搖10秒,精密加入lmL/min的荷甲氧羰酰氯乙腈溶液(FMOC-Cl) 4mL，振搖10秒，30°C水浴反應(yīng)40min，用50%乙腈定容至25mL，即得。
[0061]2.1.3空白樣品溶液制備
[0062]按照2.1所列供試品溶液的制備方法，制備不含所述供試品的空白樣品溶液。
[0063]2.1.4空白試驗(yàn)
[0064]用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；選用Agilent Hypersil 0DS-C18色譜柱(4.0mmX 250mm，5 μ m)，二級(jí)管陣列檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)263nm);流動(dòng)相:乙睛-0.2%磷酸溶液；流速:1.0mL/min，進(jìn)樣量20yL，理論板數(shù)(按1_脫氧野尻霉素峰計(jì)算)應(yīng)不低于6000。
[0065]2.2色譜條件
[0066]用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜柱:Agilent Hypersil0DS-C18 (4.0mmX 250mm, 5um)，二級(jí)管陣列檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)263nm);流動(dòng)相:乙睛-0.2%磷酸溶液；流速:1.0mL/min,進(jìn)樣量20uL。梯度洗脫如下:
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種蠶沙藥材的檢測(cè)方法，其特征在于，該檢測(cè)方法包括如下對(duì)1-脫氧野尻霉素的含量測(cè)定步驟: 精密稱(chēng)定1-脫氧野尻霉素對(duì)照品5-15mg,加水稀釋制成每mL含0.1-0.5mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取ImL所述對(duì)照品儲(chǔ)備液，并精密加入質(zhì)量濃度為1-3%的NaHCO3溶液l-4mL以及l(fā)-3mg/mL的 芴甲氧羰酰氯乙腈溶液l_4mL，混勻并于30_60°C進(jìn)行水浴反應(yīng)20-40min，隨后以30-60%的乙腈定容至20_30mL，作為對(duì)照品溶液； 取待測(cè)蠶沙藥材研細(xì)，并精密稱(chēng)取0.5-2.0g，加入用濃鹽酸調(diào)pH值為3-4的水30-60mL,攪拌均勻，超聲處理20-30min，并離心取上清液；殘?jiān)觩H值為3_4的水適量洗滌，離心合并上清液，并濃縮至10-20mL ;將濃縮液置于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，先用水洗脫，收集并棄去水洗脫液，再用0.5M氨水洗脫，并收集氨水洗脫液，濃縮至近干，隨后加水IOmL溶解，超聲處理1-5分鐘，并加水定容至20-30mL，得到供試品儲(chǔ)備液；精密量取ImL所述供試品儲(chǔ)備液，依次加入質(zhì)量濃度為1-3 %的NaHCO3溶液lmL、以及l(fā)_3mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混勻并于30°C進(jìn)行水浴反應(yīng)40min，隨后以30-60%的乙腈定容至20_30mL，作為供試品溶液； 照高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙睛為流動(dòng)相A、以0.2%的磷酸溶液為流動(dòng)相B按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫:0-8min，A:B為25%:75% ；8-40min,A:B 為 25 %:75 % — 50 %:50 % ；40-45min, A:B 為 50 %:50 % ;45_46min，A:B 為 50 %:50%- 25%:75% ；46-75min, A:B 為 25%:75% ;控制流速 1.0mL/min，柱溫 25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)263nm，理論板數(shù)按1-脫氧野尻霉素峰計(jì)算應(yīng)不低于6000 ； 精密吸取所述對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶沙藥材的檢測(cè)方法，其特征在于，所述對(duì)1-脫氧野尻霉素的含量進(jìn)行測(cè)定的步驟包括: 精密稱(chēng)定1-脫氧野尻霉素對(duì)照品IOmg,加水稀釋制成每mL含0.2mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取ImL所述對(duì)照品儲(chǔ)備液，并精密加入質(zhì)量濃度為2%的NaHCO3溶液ImL以及2mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混勻并于30°C進(jìn)行水浴反應(yīng)40min，隨后以50%的乙腈定容至25mL，作為對(duì)照品溶液； 取待測(cè)藥材研細(xì)，并精密稱(chēng)取lg，加入用濃鹽酸調(diào)PH值為3-4的水50mL，攪拌均勻，超聲處理30min，并離心取上清液；殘?jiān)觩H值為3_4的水適量洗滌，離心合并上清液，并濃縮至20mL ;將濃縮液置于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，先用水洗脫，收集并棄去水洗脫液，再用0.5M氨水洗脫，并收集氨水洗脫液，濃縮至近干，隨后加水IOmL溶解，超聲處理2分鐘，并加水定容至25mL，得到供試品儲(chǔ)備液；精密量取ImL所述供試品儲(chǔ)備液，依次加入質(zhì)量濃度為2%的NaHCO3溶液lmL、以及l(fā)mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混勻并于30°C進(jìn)行水浴反應(yīng)40min，隨后以50%的乙腈定容至25mL，作為供試品溶液； 照高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙睛為流動(dòng)相A、以0.2%的磷酸溶液為流動(dòng)相B按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫:0-8min，A:B為25%:75% ；8-40min,A:B 為 25 %:75 % — 50 %:50 % ；40-45min, A:B 為 50 %:50 % ;45_46min，A:B 為 50 %:50%- 25%:75% ；46-75min, A:B 為 25%:75% ;控制流速 1.0mL/min，柱溫 25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)263nm，理論板數(shù)按1-脫氧野尻霉素峰計(jì)算應(yīng)不低于6000 ； 精密吸取所述對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蠶沙藥材的檢測(cè)方法，其特征在于，所述1-脫氧野尻霉素的含量測(cè)定步驟中，所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱為DOOl-CC型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，樹(shù)脂體積為50mL,徑高比為I:8o
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蠶沙藥材的檢測(cè)方法，其特征在于，還包括將所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行前處理的步驟，所述前處理具體包括如下步驟:用等體積的2Μ鹽酸浸泡DOOl-CC型離子交換樹(shù)脂4小時(shí)以上；再用4倍樹(shù)脂體積的2Μ鹽酸沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用5倍樹(shù)脂體積的2MNa0H溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用5倍樹(shù)脂體積的2M鹽酸溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用5倍樹(shù)脂體積的2M NaOH溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性；用3倍樹(shù)脂體積的2M鹽酸溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性，即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的蠶沙藥材的檢測(cè)方法，其特征在于，所述1-脫氧野尻霉素的含量測(cè)定步驟中，所述超聲處理的條件為:功率300W，頻率50KHz。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的蠶沙藥材的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法還包括如下鑒別和/或含量測(cè)定的步驟中的至少一種: A、茚三酮反應(yīng) 取待測(cè)藥材粉末0.1-0.3g，置具塞試管中，加熱水3-7mL，加塞振搖并濾過(guò)；取濾液lmL，加茚三酮試液3~4滴，搖勻，放入沸水浴中加熱，觀察溶液顏色變化； B、TLC鑒別 取待測(cè)藥材粗粉約0.5-1.5g，加無(wú)水乙醇5-15mL，加熱回流半小時(shí)，放冷，濾過(guò)，濾液用少許活性炭脫色，濾過(guò)，濾液濃縮至約lmL，作為供試品溶液； 另取β -谷甾醇對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每ImL含0.5mg的溶液,作為對(duì)照品溶液； 照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μ L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以體積比為18-19.8:0.2-2.0的三氯甲烷-丙酮為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干；噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C烘干15分鐘，鑒別； C、HPLC法測(cè)定派可林酸的含量 精密稱(chēng)定派可林酸對(duì)照品3-8mg，加水稀釋定容至50mL ;精密量取0.5-2.0mL溶液，依次加水0.5-2.0mL、加質(zhì)量濃度為0.8%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液l_3mL以及0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液l_3mL，于60-90°C水浴反應(yīng)0.5-2.0小時(shí)，放冷后用pH7.0,0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為對(duì)照品溶液； 精密稱(chēng)定待測(cè)藥材0.3-0.8g，加水振搖后，于60-90°C水浴中加熱20-40分鐘，放冷后加水定容至10mL，搖勻并離心后，精密量取上清液l_3mL，并依次加入質(zhì)量濃度為0.8%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液l_3mL和0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液l_3mL，于60_90°C水浴反應(yīng)0.5-2.0小時(shí)，放冷后用pH7.0,0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為供試品溶液； 照高效液相色譜法試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為15-25:0.1-1 =75-85的乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸鈉溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為390nm ;理論板數(shù)按派可林酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2500 ； 分別精密吸取對(duì)照品溶液4-6 μ L與供試品溶液5-15 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蠶沙藥材的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法還包括如下鑒別和/或含量測(cè)定的步驟中的至少一種: Α、茚三酮反應(yīng)取待測(cè)藥材粉末0.2g，置具塞試管中，加熱水5mL，加塞振搖5分鐘，濾過(guò)；取濾液lmL，加茚三酮試液3-4滴，搖勻，放入沸水浴中加熱，觀察溶液顏色變化； B、TLC鑒別 取待測(cè)藥材粗粉約lg，加無(wú)水乙醇IOmL,加熱回流半小時(shí)，放冷，濾過(guò)，濾液用少許活性炭脫色，濾過(guò)，濾液濃縮至約lmL，作為供試品溶液； 另取β -谷甾醇對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每ImL含0.5mg的溶液,作為對(duì)照品溶液； 照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μ L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以體積比為19.5:0.5的三氯甲烷-丙酮為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干；噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C烘干15分鐘，鑒別； C、HPLC法測(cè)定派可林酸的含量 精密稱(chēng)定派可林酸對(duì)照品5mg，加水稀釋定容至50mL ;精密量取ImL溶液，依次加水lmL、加質(zhì)量濃度為0.8%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液2mL以及0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液2mL,于60°C水浴反應(yīng)I小時(shí)，放冷后用pH7.0,0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為對(duì)照品溶液； 精密稱(chēng)定待測(cè)藥材0.4g，加水振搖后，于60°C水浴中加熱30分鐘，放冷后加水定容至10mL，搖勻并離心后，精密量取上清液2mL，并依次加入質(zhì)量濃度為0.8%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液2mL，于60°C水浴反應(yīng)I小時(shí)，放冷后用pH7.0、.0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為供試品溶液； 照高效液相色譜法試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為21:0.5:79的乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸鈉溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為390nm ;理論板數(shù)按派可林酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2500 ； 分別精密吸取對(duì)照品溶液5 μ L與供試品溶液10 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104007206SQ201410264691
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】潘杰, 于娟, 吳麗璇, 陳啟蘭 申請(qǐng)人:漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司