一種基于適體識(shí)別作用電化學(xué)測定多巴胺的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于適體識(shí)別作用電化學(xué)測定多巴胺的方法及應(yīng)用，將電化學(xué)標(biāo)記物硫堇吸附在金-鉑納米粒子(Au@PtNPs)表面，再將巰基DNA1固定在Au@PtNPs表面，得電化學(xué)探針(DNA1/Th/Au@PtNPs)；再將電化學(xué)探針溶液中加入多巴胺適體鏈DNA2，DNA1與DNA2發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，得DNA2修飾的電化學(xué)探針(DNA2/DNA1/Th/Au@PtNPs)；當(dāng)向DNA2修飾的探針溶液中加入多巴胺后，適體鏈DNA2與多巴胺結(jié)合，導(dǎo)致重新生成了電化學(xué)探針DNA1/Th/Au@PtNPs；然后將碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)浸入重新生成的電化學(xué)探針DNA1/Th/Au@PtNPs溶液中，由于碳納米粒子與單鏈DNA1的吸附作用，電化學(xué)探針吸附于電極表面，測電化學(xué)信號(hào)，通過電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)方法對(duì)多巴胺的定量測定。本發(fā)明的傳感器具有很高的選擇性和檢測靈敏度。
【專利說明】—種基于適體識(shí)別作用電化學(xué)測定多巴胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)和電化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種性檢測多巴胺的電化學(xué)方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]多巴胺(DA)是一重要的信息傳遞物質(zhì)，其含量的改變可導(dǎo)致一些重要疾病如帕金森氏癥等。因此，多巴胺的測定一直是分析化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。電化學(xué)測定多巴胺有較高的靈敏度，但由于大量抗壞血酸(AA)與多巴胺共存于腦內(nèi)，其在固體電極上的氧化電位與多巴胺重疊，因而嚴(yán)重干擾多巴胺含量的測定。
[0003]近年來，提出了一些基于適體技術(shù)檢測多巴胺的方法。如光度法(Yu Zheng, YongWang, Xiurong Yang, Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine usingunmodified gold nanoparticles.Sensors and Actuators B, 156(2011)95-99)、突 光法(Qin Mu, Hu Xu,Yan Li, Shijian Ma, Xinhua Zhong, Adenosine capped QDs basedfluorescent sensor for detection of dopamine with high selectivity and sensitivity.Analyst, 139 (2014) 93-98)、酶聯(lián)免疫方法(Hoyoung Park, Insook Rhee Paeng, Developmentof direct competitive enzyme-linked aptamer assay for determination of dopaminein serum.Analytica Chimica Acta, 685(2011)65-73;Eunhye Kim, Insook RheePaeng, Advantageous sensitivity in the DNA homolog of the RNA dopamine aptamer.Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 35 (2014) 83-100)等，然而這些檢測方法大都靈敏度低，操作繁瑣，而且耗時(shí)較多。因此，必須發(fā)展一種簡單，低成本，快速的檢測方法用于多巴胺的分析檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]一種基于適體識(shí)別作用電化學(xué)測定多巴胺的方法:將電化學(xué)標(biāo)記物硫堇吸附在金-鉬納米粒子(Au@PtNPs)表面，再將巰基DNAl固定在AuOPtNPs表面，得電化學(xué)探針(DNAl/Th/AuiPtNPs);再將電化學(xué)探針溶液中加入多巴胺適體鏈DNA2，DNAl與DNA2發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，得DNA2修飾的電化學(xué)探針(DNA2/DNAl/Th/Au@PtNPs)；當(dāng)向DNA2修飾的探針溶液中加入多巴胺后，適體鏈DNA2與多巴胺結(jié)合，導(dǎo)致重新生成了電化學(xué)探針DNA1/Th/Au@PtNPs ;然后將碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)浸入重新生成的電化學(xué)探針DNA1/Th/Au@PtNPs溶液中，由于碳納米粒子與單鏈DNAl的吸附作用，電化學(xué)探針吸附于電極表面，測電化學(xué)信號(hào)，通過電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)方法對(duì)多巴胺的定量測定。
[0005]本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的:一種基于適體識(shí)別作用電化學(xué)測定多巴胺的方法，其特征是包括以下步驟:
[0006](I)制備電化學(xué)探針；
[0007](2)制備碳納米粒子修飾金電極；
[0008](3)電化學(xué)檢測多巴胺。
[0009]優(yōu)選的，本發(fā)明所述的電化學(xué)探針制備包括以下步驟:取2mL的離心管，加入10μ LKT5M的DNAl和10 μ L pH5.2500mM的醋酸緩沖溶液，和10 μ LlOmM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)反應(yīng)lh，用以活化巰基。然后，另取2mL離心管依次加入直徑15nmlmLAu@PtNPs和100 μ L10_4M的硫堇溶液反應(yīng)0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上。將吸附了硫堇的AuOPtNPs加入到活化好的巰基DNAl中，放入37°C搖床輕搖反應(yīng)16h。使巰基DNAl與AuOPtNPs通過Au-S鍵連接起來。再向體系中加入0.1M NaCl放置24h后在15000轉(zhuǎn)速下，離心30min，得到紅色沉淀，并用IOmM pH8.0的磷酸緩沖溶液洗滌三次，分散在IOmM pH8.0的磷酸緩沖溶液中得到DNAl/Th/AuOPtNPs電化學(xué)探針，4°C避光保存。
[0010]優(yōu)選地，本發(fā)明所述的碳納米粒子修飾金電極制備包括以下步驟:用NaCOJfCNPs調(diào)節(jié)pH至7.0，移至2mL離心管在15000轉(zhuǎn)速下離心10min0離心產(chǎn)物用0.01M ρΗ7.0磷酸緩沖溶液洗滌3次。將產(chǎn)物用0.01M ρΗ7.0的磷酸緩沖溶液分散，取10 μ L滴在金電極表面得碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)，置陰涼處風(fēng)干備用。
[0011]優(yōu)選地，一種對(duì)多巴胺的檢測方法，其特征是:取20μ L10_5M的DNA2加入電化學(xué)探針(DNAl/Th/Au@PtNPs)溶液中，反應(yīng)2h后，14000轉(zhuǎn)速下離心30min，用10mM，pH8.0磷酸緩沖溶液洗滌三次，再用ImL磷酸緩沖溶液分散。在2mL離心管中加入20 μ L上述溶液，再加入10 μ L —定濃度的多巴胺,反應(yīng)30min后將碳納米粒子修飾金電極插入反應(yīng)30min,用磷酸緩沖溶液沖洗。以上述修飾金電極作為工作電極，將電極插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸緩沖溶液中用循環(huán)伏安法或微分脈沖伏安法(DPV)測電信號(hào)(Ip)，電位增量0.0OlmV，脈沖寬度
0.05s，脈沖周期0.2s。
[0012]具體實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。
[0013]碳納米粒子修飾金電極對(duì)電化學(xué)行為的影響如圖2所示。(a)無DA時(shí)CNPs/GE的 DPV 曲線；(b)在 10 μ L3.0X l(T6mol L-1DA 時(shí) GE 的 DPV 曲線；(c)在 10 μ L3.0X l(T6molL^1DA 時(shí) CNPs/GE 的 DPV 曲線
[0014]吸附時(shí)間對(duì)電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度的影響如圖3所示。
[0015]峰電流與多巴胺濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖4所示。
[0016]電化學(xué)測定多巴胺的選擇性如圖5所示。
[0017]本發(fā)明中的檢測條件，具體特征如下:
[0018]多巴胺與DNA2修飾的探針作用后，將碳納米粒子修飾金電極插入溶液，碳納米粒子修飾金電極將吸附生成的探針，吸附時(shí)間對(duì)電化學(xué)信號(hào)有著極大的影響?？疾炝宋綍r(shí)間對(duì)電化學(xué)信號(hào)的影響。結(jié)果如圖3所示，用吸附時(shí)間和電化學(xué)信號(hào)作圖，從圖中可以看出，在10到40min內(nèi)，電化學(xué)信號(hào)隨著吸附時(shí)間的增加而增加，當(dāng)吸附時(shí)間繼續(xù)增加到50min,60min時(shí)，電化學(xué)信號(hào)趨于平穩(wěn)。表明吸附時(shí)間最優(yōu)為50min。
[0019]分析性能如下:
[0020]本發(fā)明在最佳條件下，考察了多巴胺的濃度與電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系。由圖4可看出，多巴胺的濃度在3.0X 10_8~3.0X 10_6M范圍內(nèi)與電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度呈一定的線性關(guān)系，其線性回歸方程是Ip = 1.942C+3.6X10_7(IP是體系的電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度；C是多巴胺的濃度，η = 9)，線性相關(guān)系數(shù)R = 0.9981，檢測限是1.0X 10-8Μ(3 σ )。該方法的精密度通過對(duì)濃度為3.0Χ10_7Μ的多巴胺進(jìn)行11次平行測定而計(jì)算得出，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1 %。表明本法有較好的重現(xiàn)性。
[0021]方法的選擇性。選擇抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)作為對(duì)檢測多巴胺選擇性的對(duì)比物。將電化學(xué)方法檢測濃度為3.0X10_5mol L—1的AA和UA，3X10_7mol L—1的DA。電流強(qiáng)度如圖5所示,可以看出，檢測3.0X l(T5mol L-1的AA和UA的電流強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于檢測3X l(T7molL—1的DA電流強(qiáng)度，說明該電化學(xué)方法具有很高的選擇性來檢測多巴胺。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的電化學(xué)測定多巴胺的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著的進(jìn)步:金-鉬納米粒子提供相對(duì)大的比表面積用于負(fù)載電化學(xué)試劑，使得本發(fā)明設(shè)計(jì)的電化學(xué)測定多巴胺的方法具有高靈敏度。另外，利用適體的識(shí)別作用，通過檢測探針上電化學(xué)物質(zhì)的電化學(xué)信號(hào)間接測定多巴胺，而不是直接測定多巴胺的電化學(xué)信號(hào)；根據(jù)實(shí)驗(yàn)電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度(圖5)可以看出，當(dāng)本發(fā)明的電化學(xué)測定多巴胺的方法用于檢測抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)時(shí)，其電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于檢多巴胺的電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度，這說明該方法具有很高的選擇性檢來測多巴胺。因此，本發(fā)明涉及的電化學(xué)方法在構(gòu)建檢測小分子化合物的研究方法中體現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為實(shí)驗(yàn)原理圖。
[0024]圖2為碳納米粒子修飾金電極對(duì)電化學(xué)行為的影響。
[0025]圖3為吸附時(shí)間對(duì)電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度的影響。
[0026]圖4為多巴胺濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0027]圖5為電化學(xué)方法檢測多巴胺的選擇性。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面的實(shí)例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0029]實(shí)例:一種基于適體識(shí)別作用電化學(xué)測定多巴胺的方法
[0030]1.實(shí)驗(yàn)部分
[0031]1.1儀器與試劑
[0032]CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；Anke-TGL_16C飛翁牌高速離心機(jī)(上海市安亭科學(xué)儀器廠)；PHS-3D型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng):金電極及修飾金電極為工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)電極。
[0033]NaH2PO4.2H20,天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；Na2HP04.12H20,天津市紅巖化學(xué)試劑廠；三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)，氯金酸(HAuCl4),檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)均購于天津市博迪化工有限公司；鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])，天津市博迪化工有限公司；亞鐵氰化鉀(K4[Fe (CN)6].3Η20)，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；氧化鋁粉末(a-Al2O3)，多巴胺(DA)，硫堇(Th)購自上海阿拉丁試劑公司。
[0034]所用人工合成DNA序列(北京賽百盛生物工程有限公司購得)如下:
[0035]優(yōu)選的DNAl 部分序列:5’ -GTG TTC TCT GGC GCA CAC AGA GAC ACA GAA TGA GGCCC-HS-3，；
[0036]優(yōu)選的DNA2 部分序列:5’ -GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGGCCA GCA CAG AAT GAG GCC C-3，。
[0037]1.2實(shí)驗(yàn)步驟
[0038]1.2.1金-鉬納米粒子的制備[0039]把制備和儲(chǔ)備金膠溶液所用的玻璃容器(容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶)用王水泡30min，然后用二次水沖洗烘干備用。在IOOOmL圓底燒瓶中加入50mLlmM的HAuCl4，攪拌加熱至沸騰，然后快速加入5mL38.8mM的檸檬酸鈉(NaC6H5O7)，溶液變?yōu)榫萍t色時(shí)，向溶液中依次加入5mL4.0X IO-3Iii0IL-1的HPtCl6, lSmLlOgL—1的PVP，攪拌加熱至沸騰后繼續(xù)加熱2h。溶液由酒紅色變?yōu)樽睾稚频肁uOPtNPs，轉(zhuǎn)移至棕色瓶，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0040]1.2.2碳納米粒子的制備
[0041]把制備、儲(chǔ)備碳納米粒子(CNPs)所用的玻璃容器(容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶)用王水(HCl =HNO3 = 1:3)泡30min，然后用二次水沖洗烘干備用。在IOOmL圓底燒瓶中加入60mL5M的HNO3和0.3g活性炭，加熱沸騰后，繼續(xù)回流12h，轉(zhuǎn)移至棕色廣口瓶，置陰涼避光處保存。
[0042]1.2.3電化學(xué)探針的制備
[0043]首先，取2mL的離心管，加入10 μ LKT5M的DNAl和10 μ L pH5.2500mM的醋酸緩沖溶液，和10 μ LlOmM的TCEP反應(yīng)lh，用以活化巰基。然后，另取2mL離心管依次加入ImLAuiPtNPs和100 μ LlO-4M的硫堇溶液反應(yīng)0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上。將吸附了硫堇的AuOPtNPs加入到活化好的巰基DNAl中，放入搖床輕搖反應(yīng)16h。使巰基DNAl與AuOPtNPs通過Au-S鍵連接起來。再向體系中加入0.1M NaCl放置24h后在15000轉(zhuǎn)速下，離心30min，得到紅色沉淀，并用IOmM pH8.0的磷酸緩沖溶液洗滌三次，分散在IOmM pH8.0的磷酸緩沖溶液中得到DNAl/Th/AuOPtNPs電化學(xué)探針，4°C避光保存。
[0044]1.2.4電化學(xué)檢測多巴胺方法的構(gòu)建
[0045]1.2.4.1金電極的預(yù)處理
[0046]用NaCOJf制得的CNPs調(diào)節(jié)pH至7.0，移至2mL離心管在15000轉(zhuǎn)速下離心IOmin。離心產(chǎn)物用0.0lM pH7.0磷酸緩沖溶液洗滌3次。將產(chǎn)物用0.0lM pH7.0的磷酸緩沖溶液分散，取10 μ L滴在金電極表面得碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)，置陰涼處風(fēng)干備用。
[0047]1.2.4.2電化學(xué)方法對(duì)多巴胺的檢測
[0048]取20 μ LKT5M的DNA2加入上述電化學(xué)探針中，反應(yīng)2h后，14000轉(zhuǎn)速下離心30min，用10mM，pH8.0磷酸緩沖溶液洗滌三次，再用ImL磷酸緩沖溶液分散。在2mL離心管中加入20 μ L上述溶液，再加入10 μ L —定濃度的多巴胺，反應(yīng)30min后將碳納米粒子修飾金電極插入，30min后用磷酸緩沖溶液沖洗。以上述所得金電極作為工作電極，將三電極體系插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸緩沖溶液中測電信號(hào)。實(shí)驗(yàn)采用DPV測定電化學(xué)信號(hào)，電位增量
0.0OlmV，脈沖寬度0.05s，脈沖周期0.2s。
[0049]1.3結(jié)果與討論
[0050]1.3.1實(shí)驗(yàn)原理
[0051]圖1描述了以硫堇為電化學(xué)信號(hào)標(biāo)記物檢測多巴胺的電化學(xué)適體技術(shù)工作原理。首先將電化學(xué)標(biāo)記物硫堇吸附在Au@PtNPs表面，再將巰基DNAl固定在AuOPtNPs表面，得電化學(xué)探針(DNAl/Th/Au@PtNPs);再將電化學(xué)探針溶液中加入多巴胺適體鏈DNA2，DNAl與DNA2發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，得DNA2修飾的電化學(xué)探針(DNA2/DNAl/Th/Au@PtNPs)；當(dāng)向DNA2修飾的探針溶液中加入多巴胺后，適體鏈DNA2優(yōu)先與多巴胺結(jié)合，導(dǎo)致重新生成了電化學(xué)探針DNAl/Th/AuiPtNPs ;然后將碳納米粒子修飾的金電極(CNPs/GE)浸入重新生成的電化學(xué)探針DNAl/Th/Au@PtNPS溶液中，由于碳納米粒子與單鏈DNAl的吸附作用，電化學(xué)探針吸附于電極表面，在磷酸緩沖溶液中測電化學(xué)信號(hào)，通過電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)對(duì)多巴胺的定量測定。AuOPtNPs上吸附大量的硫堇，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的放大；多巴胺只與多巴胺適體作用，方法具有聞的選擇性。
[0052]1.3.2碳納米粒子修飾金電極對(duì)電化學(xué)行為的影響
[0053]如圖2所示，做了對(duì)照試驗(yàn)來研究修飾金電極對(duì)檢測多巴胺靈敏度的影響。首先，將適體鏈DNA2加入到電化學(xué)探針體系中，反應(yīng)2h后得雜交產(chǎn)物，取20 μ L雜交產(chǎn)物加入2mL離心管，再加入10 μ L 二次水，30min后浸入CNPs/GE反應(yīng)30min，取出電極，放入0.1MPH7.4的磷酸緩沖緩沖溶液中采用DPV測電信號(hào)，所得曲線如圖中a。b是在雜交產(chǎn)物中加入10yL3.0X10—6多巴胺，反應(yīng)30min后插入GE，后所得DPV圖。C是向雜交產(chǎn)物中加
10μ L3.0X 10_6多巴胺，插入CNPs/GE，所測得DPV圖。通過a與c的對(duì)照表明，向體系中加入多巴胺明顯引起電信號(hào)的增加，b與c的對(duì)照表明CNPs/GE比GE具有更高的靈敏度，這是由于CNPs修飾金電極增加了電極對(duì)單鏈DNA的吸附能力。
[0054]1.3.3吸附時(shí) 間對(duì)電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度的影響
[0055]多巴胺與其適體結(jié)合引起適體互補(bǔ)鏈釋放，釋放越多，與電極發(fā)生吸附的探針就越多，經(jīng)過AuOPtNPs的放大作用，最終得到增強(qiáng)的電信號(hào)。不同的吸附時(shí)間可能引起吸附量的明顯差異，從而影響電化學(xué)信號(hào)的明顯不同。為了選擇合適的吸附時(shí)間，考察了吸附時(shí)間對(duì)電化學(xué)信號(hào)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，對(duì)吸附時(shí)間和電化學(xué)信號(hào)作圖，從圖中可以看出，在10到40min內(nèi)，電化學(xué)信號(hào)隨著吸附時(shí)間的增加而增加，當(dāng)吸附時(shí)間繼續(xù)增加到50min時(shí)，電化學(xué)信號(hào)趨于平穩(wěn)。表明在50min時(shí)，DNAl/Th/Au@PtNPs在CNPs/GE上的吸附趨于飽和。
[0056]1.3.4方法的線性范圍與檢出限
[0057]由圖4可看出，在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，多巴胺的濃度在3.0Χ10-8~3.0X 10-6Μ范圍內(nèi)與電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度呈一定的線性關(guān)系，其線性回歸方程是Ip = 1.942C+3.6 X 10_7 (Ip是體系的電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度；C是多巴胺的濃度，η = 9)，線性相關(guān)系數(shù)R = 0.9981，檢測限是
1.0X 10_8Μ(3 σ )。該方法的精密度通過對(duì)濃度為3.0X 10_7Μ的多巴胺進(jìn)行11次平行測定而計(jì)算得出，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1 %。表明本法有較好的重現(xiàn)性。
[0058]1.3.5電化學(xué)方法檢測多巴胺的選擇性
[0059]同時(shí)，考察了該電化學(xué)方法測定多巴胺的選擇性。選擇抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)作為電化學(xué)方法檢測多巴胺選擇性的對(duì)比物(Sample)。檢測濃度為3.0X 10_5mol L—1的AA和UA，3 X 10-7mOI L-1的多巴胺。所的電流強(qiáng)度如圖5所示，可以看出，檢測3.0X 10_5mol L-1的AA和UA的電流強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于檢測3 X 10_7mol L-1的多巴胺電流強(qiáng)度，說明該電化學(xué)方法具有很高的選擇性檢測多巴胺。
[0060]L 4樣品測定
[0061]根據(jù)發(fā)明的方法對(duì)樣品中多巴胺含量進(jìn)行了測定，并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，測定結(jié)果見表1，樣品測定回收率為95.0-102.0%，本發(fā)明的方法在多巴胺檢測中具有精密度高的特點(diǎn)。
表1.樣品分析測定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種基于適體識(shí)別作用電化學(xué)測定多巴胺的方法，包括如下步驟: (1)取2mL的離心管，加入I~30μ LKT5M的DNAl和10 μ L ρΗ5.2的500mM的醋酸緩沖溶液，和10 μ LlOmM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)反應(yīng)lh，用以活化巰基；然后，另取2mL離心管依次加入直徑15nm，ImL的AuOPtNPs和100 μ LKT4M的硫堇溶液反應(yīng)0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上；將吸附了硫堇的AuOPtNPs加入到活化好的巰基DNAl中，放入37°C搖床輕搖反應(yīng)8~32h ;使巰基DNAl與AuOPtNPs連接起來；再向體系中加入0.1MNaCl放置24h后在15000轉(zhuǎn)速下，離心30min，得到紅色沉淀，并用10mMpH8.0的磷酸緩沖溶液洗滌三次，分散在lOmM，pH8.0的磷酸緩沖溶液中得到DNAl/Th/Au@PtNPs電化學(xué)探針； (2)用NaCO3將CNPs調(diào)節(jié)pH至7.0,移至2mL離心管在15000轉(zhuǎn)速下離心10min ;離心產(chǎn)物用0.01M, pH7.0磷酸緩沖溶液洗滌3次；將產(chǎn)物用0.01M, pH7.0的磷酸緩沖溶液分散，取10 μ L滴在金電極表面得碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)； (3)取5~40μ LKT5M的DNA2加入電化學(xué)探針(DNAl/Th/Au@PtNPs)溶液中，反應(yīng)0.5~4h后，14000轉(zhuǎn)速下離心30min，用10mM，pH8.0磷酸緩沖溶液洗滌三次，再用ImL磷酸緩沖溶液分散；在2mL離心管中加入20 μ L上述溶液，再加入2~20 μ L —定濃度的多巴胺，反應(yīng)30min后將碳納米粒子修飾金電極插入反應(yīng)10~60min,用磷酸緩沖溶液沖洗后測定電化學(xué)信號(hào)；
所述的 DNAl 的部分序列為:5’ -GTG TTC TCT GGC GCA CAC AGA GAC ACA GAA TGA GGCCC-HS-3，；
所述的 DNA2 的部分序列為:5’ -GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGGCCA GCA CAG AAT GAG GCC C-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定電化學(xué)信號(hào)，其特征在于:以上述修飾金電極作為工作電極，將電極插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸緩沖溶液中用循環(huán)伏安法或微分脈沖伏安法(DPV)測電信號(hào)，電位增量0.0OlmV，脈沖寬度0.05s，脈沖周期0.2s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳納米粒子的制備，其特征在于:在IOOmL圓底燒瓶中加入10~120mL8M的HNO3和0.3g活性炭，加熱沸騰后，繼續(xù)回流2~24h，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于適體識(shí)別作用電化學(xué)測定多巴胺的方法在檢測多巴胺含量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N27/30GK104020199SQ201410272481
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】混旭, 張?jiān)骑w, 劉芳, 柏莉 申請人:青島科技大學(xué)