一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒及其制備方法和包括其的人胰島素檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒及其制備方法和包括所述人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒的人胰島素檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的人胰島素單克隆抗體在與磁微粒交聯(lián)之前，利用非離子表面活性劑進(jìn)行了前處理。本發(fā)明的人胰島素檢測(cè)試劑盒具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、藥物干擾小、結(jié)果穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)；從而可以大規(guī)模適用于糖尿病臨床輔助診斷篩查。
【專利說(shuō)明】一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒及其制備方法和包括其的人胰島素檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及體外診斷醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒及其制備方法和包括其的人胰島素檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]胰島素是51個(gè)氨基酸組成的蛋白激素，它由兩條肽鏈，S卩，A鏈(含有21個(gè)氨基酸)和B鏈(含有30個(gè)氨基酸)通過(guò)二硫鍵連接組成，相對(duì)分子量為5808。胰島素在分子構(gòu)象上分為三大區(qū)域:分子內(nèi)核，分子表面疏水區(qū)和分子表面極性區(qū)。分子內(nèi)核都是由疏水殘疾構(gòu)成，包括大部分支鏈氨基酸殘基和A6、All、A20、B19四個(gè)半胱氨酸殘基。
[0003]胰島素分泌后主要有兩種用途。一部分是為了維持機(jī)體空腹血糖正常而存在的胰島素，稱作基礎(chǔ)胰島素；另一部分是為了降低餐后血糖升高，以及維持餐后血糖正常而存在的胰島素，稱作餐時(shí)胰島素。餐時(shí)胰島素的分泌其作用是抑制肝臟內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生。機(jī)體在這種機(jī)制下受到保護(hù)，血糖在其他時(shí)候被控制在空腹?fàn)顟B(tài)水平左右，而餐后的血糖被控制在7.0mmol/L以下。
[0004]胰島素的檢測(cè)在臨床中主要應(yīng)用于:1型糖尿病和II型糖尿病的診斷、II型糖尿病患者口服糖尿病藥物的選擇、低血糖綜合癥診斷及胰島素自身免疫綜合征、胰島素結(jié)構(gòu)異常、膜島素受體異常、NIDDM (Non-1nsulin-Dependent Diabetes Mellitus, NIDDM)合并高血壓、胰腺炎、多囊卵巢綜合征等疾病的診斷。
[0005]目前臨床上胰島素的檢測(cè)方法主要有放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)等。RIA方法由于試劑具有放射性，對(duì)操作者具有一定危害性，且操作復(fù)雜，試劑有效期短等缺點(diǎn)，早已不推薦作為胰島素臨床診斷；ELISA法的缺點(diǎn)在于無(wú)法準(zhǔn)確進(jìn)行定量，且批間差異較大，線性范圍有限，無(wú)法持續(xù)監(jiān)控患者胰島素水平；TRFIA雖然測(cè)值較為準(zhǔn)確，但依然存在反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境要求較高，容易受空氣塵埃影響，且多為96人份/盒，使用稀土標(biāo)記物等缺點(diǎn)也使得此免疫方法無(wú)法大規(guī)模使用；CLIA法是一種較為先進(jìn)的免疫學(xué)方法，具有反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高、特異性好、線性范圍寬、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，標(biāo)記物穩(wěn)定性好，在保證檢測(cè)速度的前提下，也能達(dá)到檢測(cè)高通量。根據(jù)目前胰島素臨床的應(yīng)用情況，市場(chǎng)應(yīng)用前景最好且診斷最可靠的方法學(xué)為CLIA法。
[0006]雖然目前中國(guó)市場(chǎng)上已有注冊(cè)批準(zhǔn)的胰島素化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定試劑盒，但多為進(jìn)口試劑，成本較高，且試劑盒的制備方法和相關(guān)材料均作為保密資料，未被公開，不利于胰島素檢測(cè)在社區(qū)基層醫(yī)院的推廣。國(guó)產(chǎn)胰島素試劑盒重復(fù)性較差，批間差異難控，且靈敏度較低，交叉反應(yīng)率較高，臨床應(yīng)用前景較差。
[0007]因此，本領(lǐng)域急需一種具有檢測(cè)靈敏度高、特異性好、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)的人胰島素檢測(cè)試劑盒。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒及其制備方法，利用所述人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒檢測(cè)人胰島素的靈敏度大幅提高。
[0009]本發(fā)明還有一目的是提供包括上述人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒的人胰島素檢測(cè)試劑盒。
[0010]本發(fā)明再有一目的是提供利用本發(fā)明的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒或人胰島素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)人胰島素的方法。
[0011]在第一方面，本發(fā)明提供一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，所述人胰島素單克隆抗體在與磁微粒交聯(lián)之前，利用非離子表面活性劑進(jìn)行前處理。
[0012]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述非離子表面活性劑是Plurafacli' LF221 (BASF公司)、或；Pluronicfr F68 (Sigma 公司)、或二者的組合。
[0013]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述非離子表面活性劑是Plurafac^ LF221 (BASF公司)和Pluronic? F68 (Sigma 公司)的組合。
[0014]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述人胰島素單克隆抗體是羅氏公司的單克隆抗體(Roche，克隆號(hào)為BMl)。
[0015]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述前處理是將非離子表面活性劑與人胰島素單克隆抗體進(jìn)行溫育；優(yōu)選地，在2-8°C，溫育30分鐘。
[0016]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行前處理時(shí)，所述人胰島素單克隆抗體溶液與非離子表面活性劑Plurafac? LF221溶液和Pluronic? F68溶液的濃度分別為l-3mg/ml、0.8-1.2wt% >0.8-1.2wt%,優(yōu)選 2mg/ml、1.0wt % > 1.0wt %。
[0017]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行前處理時(shí)，人胰島素抗體溶液與Plurafacli' LF221溶液或Pluronic? F68溶液的體積比為(8-10): (0.8-1.2);優(yōu)選9:1的比例混合。
[0018]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行前處理時(shí)，所述人胰島素單克隆抗體溶液與非離子表面活性劑Plurafac? LF221溶液和Pluronic? F68溶液的體積比為(6-10): (0.8-1.2): (0.8-1.2);優(yōu)選 8:1:1。
[0019]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述磁微粒的主要成分是超順磁性微粒，粒徑為800nm~3 μ m,主要的活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；?br> [0020]在第二方面，本發(fā)明提供一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒的制備方法，所述方法包括以下步驟:
[0021]a)用非離子表面活性劑處理人胰島素單克隆抗體；和
[0022]b)將步驟a)處理的人胰島素單克隆抗體與磁微粒相交聯(lián)。
[0023]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟a)中的所述非離子表面活性劑是Plurafac?LF221 (BASF 公司)、或Pluronic^ F68 (Sigma)、或二者的組合。
[0024]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述非離子表面活性劑是Plurafac* LF221 (BASF公司)和Pluroniclf' F68 (Sigma)的組合。
[0025]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述人胰島素單克隆抗體是羅氏公司的單克隆抗體(Roche，克隆號(hào)為BMl)。[0026]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述前處理是將非離子表面活性劑與人胰島素單克隆抗體進(jìn)行溫育；優(yōu)選地，在2-8°C，溫育30分鐘。
[0027]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行前處理時(shí),人胰島素抗體溶液與Plurafac* LF221溶液或Pluronic* F68溶液的體積比為(8-10): (0.8-1.2);優(yōu)選9:1的比例混合。
[0028]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行前處理中，所述人胰島素單克隆抗體溶液與非離子表面活性劑Plurafac? LF221溶液和Pluronic? F68溶液的濃度分別為l-3mg/ml、
0.8-1.2wt% >0.8-1.2wt%,優(yōu)選 2mg/ml、1.0wt % > 1.0wt %。
[0029]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行前處理時(shí)，所述人胰島素單克隆抗體溶液與非離子表面活性劑Plurafac? LF221溶液和Pluronic? F68溶液的體積比為(6-10): (0.8-1.2): (0.8-1.2);優(yōu)選 8:1:1。
[0030]在第三方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，或本發(fā)明第二方面所述的方法制備的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒在檢測(cè)人胰島素或制備人胰島素檢測(cè)試劑盒中的用途。
[0031]在第三方面，本發(fā)明提供一種人胰島素檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒裝有:本發(fā)明第一方面所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，或本發(fā)明第二方面所述的方法制備的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒。
[0032]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述人胰島素檢測(cè)試劑盒還裝有:酶標(biāo)記的人胰島素單克隆抗體；胰島素定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；和，洗滌液。
[0033]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述酶標(biāo)記的人胰島素單克隆抗體中的酶是堿性磷酸酶。
[0034]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述化學(xué)發(fā)光底物的主要成分為1，2_ 二氧雜環(huán)丁烷衍生物，為酶促化學(xué)發(fā)光底物。
[0035]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述1，2- 二氧雜環(huán)丁烷衍生物為AMPH) (3-(2’ -螺旋金剛燒)~4~甲氧基_4_ (3〃-憐酸氧基)苯_1，2- 二氧雜環(huán)丁燒)、Q)P_star。
[0036]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的磁微粒試劑的主要成分是超順磁性微粒，其粒徑為800nm?3 μ m,主要的活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；?。
[0037]在第四方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)人胰島素的方法，所述方法包括利用本發(fā)明第一方面所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，或本發(fā)明第二方面所述的方法制備的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，或本發(fā)明第三方面所述的人胰島素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品中的人胰島素。
[0038]在第五方面，本發(fā)明提供制備人胰島素檢測(cè)試劑盒的方法，所述的方法包括:
[0039]將根據(jù)本發(fā)明第二方面所述的方法制備人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒；酶標(biāo)記的人胰島素單克隆抗體；胰島素定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；和洗滌液制成人胰島素檢測(cè)試劑盒。
[0040]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒的制備，是將活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；拇盼⒘Ｍㄟ^(guò)共價(jià)交聯(lián)的方式與人胰島素單克隆抗體中的裸露氨基交聯(lián)反應(yīng)，并通過(guò)含有0.5?2%的BSA溶液洗滌和封閉，最終貯存于含有0.1?1%的BSA溶液中，2?8°C保存?zhèn)溆谩0041]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的磁微粒試劑稀釋液的配方為:10~IOOmMρΗ7.2 ~7.8Tris-HCl、50 ~300mMNaCl、0.5 ~2% BSA,0.05 ~0.2% ProClin-300。
[0042]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶標(biāo)記胰島素單克隆抗體的制備方法為戊二醛偶聯(lián)法，具體操作為:將堿性磷酸酶溶于終濃度5%戊二醛溶液中，室溫靜置過(guò)夜，生理鹽水透析后，加入胰島素單克隆抗體，50mM pH9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中透析過(guò)夜，加入甘氨酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，等體積加入飽和硫酸銨，2~8°C 2小時(shí)，4000rpm離心去上清，沉淀溶于50mM pH7.40磷酸緩沖液中，對(duì)其透析過(guò)夜，加入等體積甘油，置于_20°C保存。
[0043]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶標(biāo)記胰島素單克隆抗體的稀釋液的配方為:10 ~IOOmM ρΗ7.2 ~7.8Tris_HCl、50 ~300mM NaCl.0.5 ~2 % BSA,5 ~15 % 甘油、
0.05 ~0.5%吐溫-20、0.05 ~0.2% ProClin-300?
[0044]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的胰島素定標(biāo)品的濃度分別為5~20 μ IU/mL和50 ~150 μ IU/mL。
[0045]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的胰島素定標(biāo)品的稀釋液配方為:10~IOOmMρΗ7.2 ~7.8Tri s-HCl，50 ~300mMNaCl，10 ~50% 牛血清，0.05 ~0.2% ProCl in-300。
[0046]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的洗滌液配方為:10~IOOmM pH7.2~7.8Tris-HCl，50 ~300mM NaCl, 0.1 ~1% 曲拉通 Χ_100，0.05 ~0.2% ProClin-300。
[0047]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]圖1顯示了用或不用非離子表面活性劑前處理人胰島素抗體，對(duì)于檢測(cè)人胰島素的靈敏度的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0049]發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)在人胰島素單克隆抗體與磁微粒交聯(lián)之前，利用非離子表面活性劑對(duì)人胰島素單克隆抗體前處理能夠顯著提高最終所得人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒在檢測(cè)人胰島素時(shí)的靈敏度。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0050]本發(fā)明的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒及其制備方法
[0051]基于以上出乎意料的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明首先提供一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，所述人胰島素單克隆抗體，例如羅氏公司的單克隆抗體(Roche，克隆號(hào)為BMl)在與磁微粒交聯(lián)之前，利用非離子表面活性劑進(jìn)行前處理。
[0052]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上文所述人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒的制備方法，所述方法包括以下步驟:
[0053]a)用非離子表面活性劑處理人胰島素單克隆抗體；和
[0054]b)將步驟a)處理的人胰島素單克隆抗體與磁微粒相交聯(lián)。
[0055]本發(fā)明的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微?？梢杂糜跈z測(cè)人胰島素或制備人胰島素檢測(cè)試劑盒，從而顯著提高檢測(cè)人胰島素時(shí)的靈敏度。
[0056]本文所用的術(shù)語(yǔ)“非離子表面活性劑”具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義，即，在水溶液中不產(chǎn)生離子的表面活性劑。非離子表面活性劑溶于水時(shí)不發(fā)生解離，其分子中的親油基團(tuán)與離子型表面活性劑的親油基團(tuán)大致相同，其親水基團(tuán)主要是由具有一定數(shù)量的含氧基團(tuán)(如羥基和聚氧乙烯鏈)構(gòu)成。
[0057]在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明所用的非離子表面活性劑是Plurafac* LF221 (BASF公司)、或Pluronic? F68 (Sigma公司)、或二者的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所用的非離子表面活性劑是Plurafac50 LF221 (BASF公司)和Pluronic? F68 (Sigma公司)的組合。
[0058]在本發(fā)明中，所述前處理是將非離子表面活性劑與人胰島素單克隆抗體進(jìn)行溫育。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在2-8°C，將非離子表面活性劑與人胰島素單克隆抗體溫育30分鐘。
[0059]鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以合理確定上述前處理中，人胰島素單克隆抗體溶液與非離子表面活性劑各自合適的濃度以及相互的比例。
[0060]例如，在具體的實(shí)施方式中，前處理中所述人胰島素單克隆抗體溶液與非離子表面活性劑Plurafac? LF221溶液和Pluronic? F68溶液的濃度分別為l-3mg/ml、
0.8-1.2wt%,0.8-1.2wt%。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述人胰島素單克隆抗體溶液與非離子表面活性劑Plurafac? LF221溶液和Pluronic? F68溶液的濃度分別為12mg/ml、l.0wt%、
1.0wt % ο
[0061]在一優(yōu)選例中，進(jìn)行前處理時(shí)，人胰島素抗體溶液與Plurafac'K' LF221溶液或Pluronic、F68溶液的體積比為(8-10): (0.8-1.2);優(yōu)選9:1的比例混合。
[0062]在另一具體的實(shí)施方式中，前處理中所述人胰島素單克隆抗體溶液與非離子表面活性劑Plurafac? LF221溶液和Pluronic? F68溶液的體積比為(6-10): (0.8-1.2): (0.8-1.2)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述人胰島素單克隆抗體溶液與非離子表面活性劑Plurafac? LF221溶液和Pluronic? F68溶液的體積比為8:1:1。
[0063]同樣，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以合理確定所用的磁微粒。例如,在具體的實(shí)施方式中,磁微粒的主要成分是超順磁性微粒,粒徑為800nm?3 μ m，主要的活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺酰基。
[0064]在具體的實(shí)施方式中，所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒的制備，是將活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；拇盼⒘Ｍㄟ^(guò)共價(jià)交聯(lián)的方式與人胰島素單克隆抗體中的裸露氨基交聯(lián)反應(yīng)，并通過(guò)含有0.5?2%的BSA溶液洗滌和封閉，最終貯存于含有
0.1?1%的BSA溶液中，2?8°C保存?zhèn)溆谩?br> [0065]本發(fā)明的人胰島素檢測(cè)試劑盒
[0066]基于本發(fā)明的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種人胰島素檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒裝有本發(fā)明的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒。
[0067]鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定所述人胰島素檢測(cè)試劑盒中的其它組分，例如，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的人胰島素檢測(cè)試劑盒還可裝有:酶標(biāo)記的人胰島素單克隆抗體；胰島素定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；和洗滌液。
[0068]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述酶標(biāo)記的人胰島素單克隆抗體中的酶是堿性磷酸酶。
[0069]相應(yīng)地，本發(fā)明的人胰島素檢測(cè)試劑盒中的所述化學(xué)發(fā)光底物的主要成分可以為1，2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物，為酶促化學(xué)發(fā)光底物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述1，2_ 二氧雜環(huán)丁烷衍生物為AMPH) (3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯_1，2_ 二氧雜環(huán)丁烷)、CDP-star。而本發(fā)明的人胰島素檢測(cè)試劑盒中的磁微粒試劑的主要成分可以是超順磁性微粒，其粒徑為800nm?3μ m,主要的活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；?。
[0070]本發(fā)明的人胰島素檢測(cè)試劑盒可如下所示進(jìn)行制備，包括:
[0071]將本發(fā)明的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒；酶標(biāo)記的人胰島素單克隆抗體；胰島素定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；和洗滌液制成人胰島素檢測(cè)試劑盒。
[0072]在具體的實(shí)施方式中，所述的磁微粒試劑稀釋液的配方為:10?IOOmM pH7.2?
7.8Tris-HCl、50 ?300mM NaCl.0.5 ?2% BSA,0.05 ?0.2% ProClin-300。
[0073]在具體的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶標(biāo)記胰島素單克隆抗體的制備方法為戊二醛偶聯(lián)法，具體為:將堿性磷酸酶溶于終濃度5%戊二醛溶液中，室溫靜置過(guò)夜，生理鹽水透析后，加入胰島素單克隆抗體，50mM pH9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中透析過(guò)夜，加入甘氨酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，等體積加入飽和硫酸銨，2?8°C 2小時(shí)，4000rpm離心去上清，沉淀溶于50mM pH7.40磷酸緩沖液中，對(duì)其透析過(guò)夜，加入等體積甘油，置于_20°C保存。
[0074]在具體的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶標(biāo)記胰島素單克隆抗體的稀釋液的配方為:10 ?IOOmM ρΗ7.2 ?7.8Tris_HCl、50 ?300mM NaCl.0.5 ?2 % BSA,5 ?15 % 甘油、
0.05?0.5%吐溫-20、0.05?0.2% ProClin-300 ;所述的胰島素定標(biāo)品的濃度分別為5?20 μ IU/mL和50?150 μ IU/mL ;所述的胰島素定標(biāo)品的稀釋液配方為:10?IOOmMρΗ7.2 ?7.8Tris-HCl，50 ?300mMNaCl, 10 ?50%牛血清，0.05 ?0.2% ProClin-300 ;所述的洗滌液配方為:10?IOOmM pH7.2?7.8Tris-HCl, 50?300mM NaCl，(λ I?1%曲拉通Χ-100,0.05 ?0.2% ProClin-300。
[0075]本發(fā)明的人胰島素的檢測(cè)方法
[0076]在本發(fā)明的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒以及包含其的人胰島素檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)人胰島素的方法，所述方法利用本發(fā)明的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，或本發(fā)明的人胰島素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品中的人胰島素。
[0077]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0078]I)包含本發(fā)明人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒的試劑盒的檢測(cè)靈敏度高，目前市場(chǎng)上的胰島素試劑盒的最低檢測(cè)限一般高于I μ IU/mL，相比之下，包含本發(fā)明人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒的試劑盒的最低檢測(cè)限能達(dá)到0.2 μ IU/mL ；
[0079]2)本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)；膽紅素、血紅蛋白、乳糜顆粒、類風(fēng)濕因子(RF)、抗核抗體(ANA)、人抗鼠抗體(HAMA)對(duì)胰島素測(cè)定結(jié)果均無(wú)明顯干擾；而人胰島素原(Proinsulin)、C肽(C-P印tide)、類胰島素生長(zhǎng)因子I (IGF-1)、人生長(zhǎng)激素(hGH)和胰高血糖素對(duì)胰島素測(cè)定結(jié)果均無(wú)明顯干擾；
[0080]3)本發(fā)明的試劑盒藥物干擾小；對(duì)于目前市面上最常見的且臨床使用最普遍的4種類胰島素藥物，即，諾和銳、優(yōu)泌樂(lè)、來(lái)得時(shí)、諾和平，目前市場(chǎng)上主流商品化的胰島素試劑盒都有著不同程度的干擾，交叉反應(yīng)率達(dá)到3.6% -143%，相比之下，本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)300mIU/l濃度以下的諾和銳、優(yōu)泌樂(lè)、來(lái)得時(shí)、諾和平幾乎無(wú)明顯干擾。
[0081]4)本發(fā)明的試劑盒測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性好；堿性磷酸酶更穩(wěn)定、測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性更好，I, 2- 二氧雜環(huán)丁烷衍生物具有較長(zhǎng)的發(fā)光時(shí)間，發(fā)光信號(hào)可穩(wěn)定超過(guò)20分鐘以上；信號(hào)強(qiáng)度高，便于光電倍增管檢測(cè)；抗干擾能力強(qiáng)，不易污染。
[0082]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0083]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0084]實(shí)施例
[0085]材料
[0086]本發(fā)明實(shí)施例中所用的材料和試劑，包括人胰島素單克隆抗體均是市售可得的。
[0087]本發(fā)明實(shí)施例中用作校準(zhǔn)品的胰島素購(gòu)自Sigma公司，由科華公司自行稀釋到相應(yīng)濃度；血清樣品來(lái)自上海長(zhǎng)征醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科。
[0088]方法
[0089]1.胰島素磁微粒試劑的制備
[0090]胰島素磁微粒試劑稀釋液配方:
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，其特征在于，所述人胰島素單克隆抗體在與磁微粒交聯(lián)之前，利用非離子表面活性劑進(jìn)行前處理。
2.如權(quán)利要求1所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，其特征在于，所述非離子表面活性劑是Plurafac? LF221 (BASF公司)、或Pluronic? F68 (Sigma公司)、或二者的組合。
3.如權(quán)利要求2所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，其特征在于，所述非離子表面活性劑是Plurafac? LF221(BASF 公司)和Pluronic? F68 (Sigma 公司)的組合。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，其特征在于，所述人胰島素單克隆抗體是羅氏公司的單克隆抗體(Roche，克隆號(hào)為BMl)。
5.一種人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: a)用非離子表面活性劑處理人胰島素單克隆抗體；和 b)將步驟a)處理的人胰島素單克隆抗體與磁微粒相交聯(lián)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟a)中的所述非離子表面活性劑是Plurafac? LF221 (BASF 公司)、或Pluronic? F68 (Sigma)、或二者的組合。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述非離子表面活性劑是Plurafac^LF221(BASF 公司)和Pluronic* F68 (Sigma)的組合。
8.如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述人胰島素單克隆抗體是羅氏公司的單克隆抗體(Roche，克隆號(hào)為BMl)。
9.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，或權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的方法制備的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒在檢測(cè)人胰島素或制備人胰島素檢測(cè)試劑盒中的用途。
10.一種人胰島素檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒裝有:權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，或權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的方法制備的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒。
11.一種檢測(cè)人胰島素的方法，其特征在于，所述方法包括利用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，或權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的方法制備的人胰島素單克隆抗體交聯(lián)磁微粒，或權(quán)利要求10所述的人胰島素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品中的人胰島素。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104020288SQ201410273468
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】陳超, 彭波, 孫小禁, 李基
申請(qǐng)人:上?？迫A生物工程股份有限公司