一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，原料配方中，30％丙烯酰胺溶液和40％丙烯酰胺溶液混合使用。本發(fā)明中的用于木薯蛋白質(zhì)雙向電泳的凝膠，只改變丙烯酰胺的混合方式，操作簡單，等同條件下可提高凝膠的分辨率，可重復(fù)率高，符合實驗要求。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，尤其是涉及用于對木薯蛋白質(zhì)雙向電泳檢測的凝 膠。 一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠

【背景技術(shù)】
[0002] 木薯富含淀粉，其塊根可食用，可磨木薯粉等，但是木薯塊根中含有少量的蛋白質(zhì) 和微量營養(yǎng)物質(zhì)；現(xiàn)有研究中可以通過對木薯進行遺傳改造，提高其塊根中蛋白質(zhì)的含量。
[0003] 目前，常采用雙向電泳技術(shù)對蛋白質(zhì)進行分離。由于其步驟較多，要得到一張分辨 率較高的雙向電泳圖譜并非一件易事。安飛飛等發(fā)表在《熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)》上的《影響木薯葉 片蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的因素分析》就對影響木薯雙向圖譜的因素進行了分析，包括上樣 量、pH值及過硫酸銨等因素，其中并未對凝膠成分對圖譜的影響進行分析。目前對蛋白質(zhì) 凝膠檢測時，常采用傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，其配方主要為丙烯酰胺溶液、Tris溶液、 SDS溶液、APS溶液和TEMED等。然而木薯葉片中糖類多酚類物質(zhì)含量較多，塊根淀粉較多， 而蛋白質(zhì)含量較低，淀粉等雜質(zhì)會干擾傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠對木薯蛋白質(zhì)檢測的準確性， 會出現(xiàn)凝膠分辨率較差，實驗的重復(fù)率低等問題，不能滿足實驗需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提出一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，解決了現(xiàn)有技術(shù)中木薯蛋白質(zhì)檢測 時，分辨率差，重復(fù)率低的問題。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳的凝膠，原料配方中，30%丙烯酰胺溶液和40%丙烯酰 胺溶液混合使用。
[0007] 進一步優(yōu)選地，所述的30%丙烯酰胺溶液和40%丙烯酰胺溶液的混合體積比例 為 1 : (6 ?10)。
[0008] 進一步優(yōu)選地，所述的30 %丙烯酰胺溶液和40 %丙烯酰胺溶液的混合體積比例 為 1:8。
[0009] 進一步優(yōu)選地，所述的30 %丙烯酰胺溶液和40 %丙烯酰胺溶液的混合體積比例 為 1:9。
[0010] 其中，優(yōu)選地，一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，原料配方如下：30%丙烯酰胺溶液、 40%丙烯酰胺溶液、SDS溶液、APS溶液、TEMED、Tris溶液和雙蒸水，進一步優(yōu)選地，所述的 Tris溶液pH值為8.8。
[0011] 其中，SDS為十二烷基磺酸鈉，APS為過硫酸銨；TEMED(N，N，N'，N'-Tetramethylet hylenediamine)，中文名為N, N, Ν'，Ν' -四甲基乙二胺；Tris為三輕甲基氨基甲燒。
[0012] 聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE)配制或上述凝膠的配制中，參照《分子克隆實驗指 南》關(guān)于蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳的關(guān)于凝膠配制方法的記載，主要步驟如下：凝膠原料 混合后，加入到成膠板中，待到凝固即可。
[0013] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0014] 聚丙烯酰胺凝膠，是實驗室常用的凝膠電泳材料，尤其應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域；聚丙 烯酰胺是由丙烯酰胺單體經(jīng)過加成聚合反應(yīng)所產(chǎn)生出來的，具體地，丙烯酰胺單體和交聯(lián) 劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑（APS和TEMED)的作用下聚合成含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長 鏈，相鄰的兩個鏈通過亞甲基橋交聯(lián)起來形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠；本發(fā)明中 采用的原料中，采用30%丙烯酰胺溶液和40 %丙烯酰胺溶液混合使用，作為凝膠的丙烯酰 胺聚合原料，保持反應(yīng)體系中（如150ml和200ml等）的丙烯酰胺溶液的使用體積不變，這 樣使丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺處于較為平衡的混合比例，形成的聚丙烯酰胺凝膠的網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)，有效分離木薯蛋白質(zhì)，分辨率高，同時重復(fù)率較好。
[0015] 本發(fā)明中的用于木薯蛋白質(zhì)雙向電泳的凝膠，只改變丙烯酰胺的混合方式，操作 簡單，等同條件下可提高凝膠的分辨率，可重復(fù)率高，符合實驗要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1和圖2為實施例1中木薯塊根和葉片的雙向電泳凝膠結(jié)果圖；
[0017] 圖3和圖4為實施例2中木薯塊根和葉片的雙向電泳凝膠結(jié)果圖；
[0018] 圖5和圖6為實施例4中木薯塊根和葉片的雙向電泳凝膠結(jié)果圖；
[0019] 圖7和圖8為實施例5中木薯塊根和葉片的雙向電泳凝膠結(jié)果圖；
[0020] 圖9和圖10為對比例1中木薯塊根和葉片的雙向電泳凝膠結(jié)果圖；
[0021] 圖11和圖12為對比例2中木薯塊根和葉片的雙向電泳凝膠結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0022] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例和附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯 然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實 施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬 于本發(fā)明保護的范圍。
[0023] 實施時，參照分子克隆實驗指南關(guān)于聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE)的記載，進行 配制原料溶液，其中，包括30%丙烯酰胺溶液、40 (%丙烯酰胺溶液、1.511^8(?!18.8)、 10% SDS溶液、10%過硫酸銨溶液和TEMED。另外傳統(tǒng)的凝膠電泳配方中，具體配比如 下（以150ml為反應(yīng)體系）：（1) 30 %丙烯酰胺（58. 5ml) ;Tris8. 8 (56. 3ml);雙蒸水 (32.25ml) ;10%SDS(1. 5ml) ;10%APS(1. 5ml) ;TEMED(60 μ 1) ; (2)40%丙烯酰胺（44ml); Tris8.8(56.3ml);雙蒸水（46.85ml) ;10%SDS(1.5ml) ;10%APS(1.5ml) ;TEMED(60yl); 實施時參照傳統(tǒng)凝膠電泳配方和方法進行配比。
[0024] 實施例1 一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠
[0025] -種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，具體制備配方如下：
[0026] 30 %丙烯酰胺溶液8. 35ml、40 %丙烯酰胺溶液50. 15ml、Tris溶液 (ρΗ8· 8)56. 3ml、雙蒸水 32. 25ml、10% SDS 溶液 1. 5ml、10% APS 溶液 1. 5ml、TEMED60y 1。
[0027] 制備時，將上述的原料依次混合，加入到制膠板中，待到凝固后即可使用或備用。
[0028] 木薯塊根和葉片蛋白質(zhì)雙向電泳的步驟如下：
[0029] 木薯的塊根和葉片總蛋白的提取：利用苯酚抽提法提取總蛋白；植物組織用液氮 研磨，加入1倍體積的提取緩沖液提取液[5%鹿糖（m/v)，0. 1M Tris(pH8. 0)，50mM DTT， 20% SDSOn/v)，〗1%蛋白酶抑制劑（v/v)]研磨至粉末，4°C下lOOOOrpm離心20min。取下 層液，加入等體積Tris-Hcl緩沖液飽和酚勻漿，離心，收集苯酚相以及界面，丟棄水相與沉 淀，加入5倍體積含0. 1M NH4AC (乙酸銨）的冷甲醇，-20°C過夜后離心，沉淀懸浮于含0. 1M NH4AC的甲醇，洗滌三次，冷丙酮洗滌一次，4°C真空干燥，得到粉末狀蛋白。
[0030] 蛋白質(zhì)的第一維等電聚焦電泳；用蛋白質(zhì)溶解液[9. 5M尿素，2M硫脲，1%DDT，4% CHAPS，2. 5mM EDTA，2. 5mM EGTA]溶解上述制備的蛋白質(zhì)樣品；將溶解好的樣品與蛋白質(zhì)水 化液RB[7M尿素，2M硫脲，3% CHAPS, 0· 5% Trixon-100,7mgDTT/2. 5ml RB]混合，將制備完 畢的置于第一維等電聚焦的聚焦盤中，用IPG膠條覆蓋蛋白質(zhì)樣品，水化12-16h后進行電 泳；電壓參數(shù)：300V 梯度 5min ;300V 穩(wěn)定 10min ;3500V 梯度 90min，3500V 穩(wěn)定 4h40min (4 小時40分鐘），300V梯度60min。
[0031] 蛋白質(zhì)第二維聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用實施例中制備的雙向電泳凝膠；將等電 聚焦后的膠條置于含有DTT的SDS平衡鹽緩沖液[50mM Tris-HCl，pH8.8,6M尿素，30% (v/ v)甘油，2% (w/v)SDS]，平衡鹽緩沖液和DDT的配比為10ml:0. lg中，輕輕搖動20min。膠 條隨后轉(zhuǎn)入含有IAA的SDS平衡鹽緩沖液中（平衡鹽緩沖液和IAA的配比為10ml: 0. 25g)， 輕輕搖動20min。然后將IPG膠條置于實施例制備的雙向電泳凝膠（SDS-PAGE)上，100V電 泳10min，后將電壓增至160V直到電泳結(jié)束。隨后對電泳凝膠進行考染分析。
[0032] 木薯塊根和葉片的雙向電泳結(jié)果如圖1和圖2所示。
[0033] 實施例2 -種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠
[0034] 一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，具體制備配方如下：
[0035] 30%丙烯酰胺溶液 5. 3ml、40%丙烯酰胺溶液 53. 2ml、Tris 溶液（pH8. 8)56. 3ml、 雙蒸水 32. 25ml、10 % SDS 溶液 1. 5ml、10 % APS 溶液 1. 5ml、TEMED60 μ 1。
[0036] 木薯塊根和葉片蛋白制備、電泳方法與實施例1相同，利用本實施例中制備的雙 向電泳凝膠；木薯塊根和葉片蛋白質(zhì)雙向電泳的結(jié)果如圖3和圖4所示。
[0037] 實施例3 -種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠
[0038] -種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，具體制備配方如下：
[0039] 30%丙烯酰胺溶液 7. 3ml、40%丙烯酰胺溶液 51. 2ml、Tris 溶液（pH8. 8)56. 3ml、 雙蒸水 32. 25ml、10 % SDS 溶液 1. 5ml、10 % APS 溶液 1. 5ml、TEMED60 μ 1。
[0040] 木薯塊根和葉片蛋白質(zhì)制備、電泳方法與實施例1相同利用本實施例中制備的雙 向電泳凝膠。
[0041] 實施例4 一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠
[0042] -種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，具體制備配方如下：
[0043] 30%丙烯酰胺溶液6. 5ml、40%丙烯酰胺溶液52ml、Tris溶液（pH8. 8)56. 3ml、雙 蒸水 32. 25ml、10 % SDS 溶液 1. 5ml、10 % APS 溶液 1. 5ml、TEMED60 μ 1。
[0044] 木薯塊根與葉片蛋白質(zhì)制備與電泳的制備方法與實施例1相同，利用本實施例中 制備的雙向電泳凝膠，塊根與葉片蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)構(gòu)如圖5和圖6所示。
[0045] 實施例5 -種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠
[0046] -種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，具體制備配方如下：
[0047] 30 %丙烯酰胺溶液5. 85ml、40 %丙烯酰胺溶液52. 65ml、Tris溶液 (ρΗ8· 8)56. 3ml、雙蒸水 32. 25ml、10% SDS 溶液 1. 5ml、10% APS 溶液 1. 5ml、TEMED60y 1。
[0048] 木薯塊根與葉片蛋白質(zhì)制備與電泳的制備方法與實施例1相同，利用本實施例中 制備的雙向電泳凝膠，塊根與葉片蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)構(gòu)如圖7和圖8所示
[0049] 對比例1利用30 %丙烯酰胺溶液配置雙向電泳凝膠
[0050] 以 150ml 為體系：30%丙烯酰胺 58. 5ml ;Tris(8. 8)56. 3ml ;雙蒸水 32. 25ml ;10% SDS1. 5ml ；10% APS1. 5ml ；TEMED60y l〇
[0051] 木薯塊根與葉片蛋白質(zhì)制備與電泳的制備方法與實施例1相同，利用本對比例中 制備的雙向電泳凝膠，塊根與葉片蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)構(gòu)如圖9和圖10所示。
[0052] 對比例2利用40 %丙烯酰胺溶液配置雙向電泳凝膠
[0053] 以 150ml 為體系：40% 丙烯酰胺 44ml ;Tris8. 856.3ml ;雙蒸水 46. 85ml ;10 % SDS1. 5ml ；10% APS1. 5ml ；TEMED60y l〇
[0054] 木薯塊根與葉片蛋白質(zhì)制備與電泳的制備方法與實施例1相同，利用本對比例中 制備的雙向電泳凝膠，塊根與葉片蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)構(gòu)如圖11和圖12所示。
[0055] 參照附圖1-12中，實施例1-5中記載的配方中，制備的木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠， 分離木薯塊根和葉片蛋白質(zhì)時，分辨率和實驗重復(fù)率明顯優(yōu)于對比例1和對比例2雙向電 泳凝膠。尤其是實施例4和實施例5制備的雙向電泳凝膠，參照附圖5-8中，考染后蛋白質(zhì) 點清晰度相對于對比例1和2的傳統(tǒng)凝膠方法較好，并且分辨率和實驗重復(fù)率更優(yōu)。
[0056] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，其特征是，原料配方中，30 %丙烯酰胺溶液和40 % 丙烯酰胺溶液混合使用。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，其特征是：所述的30%丙烯酰 胺溶液和40%丙烯酰胺溶液的混合體積比例為1 :出?10)。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，其特征是：所述的30%丙烯酰 胺溶液和40%丙烯酰胺溶液的混合體積比例為1:8。
4. 如權(quán)利要求2所述的一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，其特征是：所述的30%丙烯酰 胺溶液和40%丙烯酰胺溶液的混合體積比例為1:9。
5. 如權(quán)利要求1-4任一項所述的一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，其特征是，原料配方 如下：30%丙烯酰胺溶液、40%丙烯酰胺溶液、10%SDS溶液、10%APS溶液、TEMED、Tri S溶 液和雙蒸水。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種木薯蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠，其特征是：所述的Tris溶液pH 值為8. 8。
【文檔編號】G01N27/26GK104101629SQ201410299101
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】安飛飛, 陳松筆, 李開綿, 陳霆 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所