一種基于納米金催化的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于納米金催化的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法，包括以下步驟：1)納米金溶液制備，0.01％w/w的HAuCl4溶液加熱至沸，強力攪拌下加入1％的檸檬酸鈉溶液，混合溶液保持沸騰15分鐘后撤掉加熱源，而后不斷攪拌冷卻至室溫，得到的溶液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?)鐵蛋白抗體對納米金的標記，利用鐵蛋白抗體修飾金納米顆粒；3)免疫反應(yīng)；4)化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白，移取免疫反應(yīng)完的鐵蛋白抗體修飾的納米金/鐵蛋白混合液于化學發(fā)光池中，注入魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光試劑，通過IFFL-D化學發(fā)光分析儀測定并記錄其化學發(fā)光強度，得出化學發(fā)光強度和待測鐵蛋白之間的相關(guān)關(guān)系。
【專利說明】一種基于納米金催化的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，本發(fā)明涉及一種基于納米金催化的化 學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 鐵蛋白是一類廣泛存在于動植物及微生物細胞中含高鐵量的蛋白質(zhì)，能夠參與和 維持鐵代謝的平衡。人體內(nèi)鐵蛋白可以通過儲存機體中的過剩鐵，避免產(chǎn)生鐵中毒，也可 以釋放鐵給需鐵細胞，用于合成含鐵的蛋白質(zhì)或酶。人們的許多疾病如缺鐵性貧血、急性 肝炎及蛋白質(zhì)缺乏癥等都與血清中鐵蛋白的含量有關(guān)，甚至某些癌癥患者體內(nèi)的鐵蛋白也 會出現(xiàn)異常，可作為一些癌癥的輔助診斷，因此對鐵蛋白進行準確快速的測定具有重要的 意義。目前，鐵蛋白的測定主要采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA)法，放射性免疫法、電化學分 析方法、表面等粒子共振技術(shù)、熒光分析以及很少的化學發(fā)光分析等。但是，放射性免疫法 因使用放射性同位素作為標記，必然會帶來健康危害、廢物處理等問題。寥寥可數(shù)的化學發(fā) 光分析和酶聯(lián)免疫法存在步驟繁多的缺點，而不適用于各種生物標記的檢測。別的分析方 法大多需要復(fù)雜、費時的樣品處理和貴重的分析儀器以及具有一定技術(shù)要求的操作人員， 使得這些方法的應(yīng)用受到一定限制。
[0003] 化學發(fā)光分析以其靈敏度高、線性范圍寬以及操作簡單等優(yōu)點常被用作各種免疫 分析的最終檢測手段，然而有些化學發(fā)光體系〔例如魯米諾一 H202 - HRP(辣根過氧化物 酶）〕直接用于免疫分析時大分子的空間位阻作用使方法的靈敏度不夠理想。在納米科學 迅猛發(fā)展的過程中，納米粒子尤其金屬納米粒子因其具有容易合成和生物相容性好等優(yōu)點 已被引入化學發(fā)光分析，開創(chuàng)納米粒子化學發(fā)光生物分析的新領(lǐng)域，一度成為研究的熱點。 但是大多基于納米粒子標記的化學發(fā)光免疫分析，均是通過將所標記金屬納米粒子溶出為 金屬離子，從而催化化學發(fā)光反應(yīng)實現(xiàn)對目標物的檢測。Han研究組報道了基于納米金溶解 并結(jié)合AuCl 4^-HCl-NaCl-Br2-luminol體系的化學發(fā)光金屬免疫分析法，用于抗壞血酸過氧 化物酶抗體（ApxIVAb)的測定。Li研究組和Lu研究組相繼利用將標記所用納米金溶解得 到AuC1 4_，結(jié)合AuCl4_-luminol-H202化學發(fā)光體系測定羊抗人IgG。此外，Li研究組利用將 標記的納米金用Ag+還原溶液處理后，經(jīng)硝酸溶出后，結(jié)合Ag+-Mn 2+-K2S208-H3P0 4-luminol化 學發(fā)光體系測定人IgG。上述這些納米粒子化學發(fā)光金屬免疫分析方法存在一定缺陷：一、 需要將納米金屬離子的溶出，要使納米粒子尤其貴金屬納米粒子完全溶出的的條件均比較 苛刻且所用溶劑大多有毒。溶出步驟繁瑣耗時，且會帶來高的背景信號，從而降低方法的靈 敏度；二、這些分析方法大多是異相的，需要多步的標記和洗脫，從而難以克服重現(xiàn)性和精 密度的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對目前鐵蛋白檢測技術(shù)存在的不足，以免疫特異性反應(yīng)為分子識別基 礎(chǔ)，納米金為信號探針，利用納米金形態(tài)影響其對魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光反應(yīng)的催化 性能，建立了一種簡便、快速靈敏的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法。
[0005] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種基于納米金催化的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方 法，包括以下步驟：
[0006] 1)納米金溶液制備，0. 01% w/w的HAuC14溶液加熱至沸，強力攪拌下加入1%的 檸檬酸鈉溶液，混合溶液保持沸騰15分鐘后撤掉加熱源，而后不斷攪拌冷卻至室溫，得到 的溶液于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0007] 2)鐵蛋白抗體對納米金的標記，利用鐵蛋白抗體修飾金納米顆粒，具體為：將鐵 蛋白抗體修飾在納米金粒子的表面，取納米金溶液用〇. lmol/L K2C03溶液調(diào)節(jié)pH為9,加 入鐵蛋白抗體，室溫攪拌作用1小時使鐵蛋白抗體和金納米粒子充分結(jié)合，于4°C溫度環(huán)境 下以12000轉(zhuǎn)/分的速度離心30分鐘，以除去未標記的抗體，吸出上清液，剩余的沉淀用 0. Olmol/L含有1 % BSA的磷酸緩沖溶液pH7. 4懸浮至原體積，于4°C冰箱中保存待用；
[0008] 3)免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)選用NaCl濃度為1. 5X10_3mol/L，免疫反應(yīng)時間為15-25 分鐘；
[0009] 4)化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白，移取免疫反應(yīng)完的鐵蛋白抗體修飾的納米金/鐵蛋 白混合液于化學發(fā)光池中，注入魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光試劑，通過IFFL-D化學發(fā)光分 析儀測定并記錄其化學發(fā)光強度；通過測定化學發(fā)光強度檢測鐵蛋白的含量，由此可以得 出化學發(fā)光強度和待測鐵蛋白之間的相關(guān)關(guān)系。
[0010] 所述的步驟1)中，選用的納米金的粒徑為25nm，濃度為6. 0 X Krlclmol/L? 6. 0Xl(T8mol/L 之間。
[0011] 所述的步驟2)中，標記鐵蛋白抗體所用濃度為0. 5mg/mL。
[0012] 所述的步驟4)中，選擇魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光試劑為5Χ1(Γ4Μ魯米諾和 5. ΟΧ 1(Γ2Μ高碘酸鉀的體積比為2:1混合而成。
[0013] 魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光試劑的pH值優(yōu)化為12. 0。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：
[0015] 將納米粒子對于化學發(fā)光反應(yīng)的催化性能和高特異性的免疫分析相結(jié)合，實現(xiàn)鐵 蛋白的分析檢測至今仍未見報道。因此，本發(fā)明基于納米金形態(tài)影響其對化學發(fā)光反應(yīng)的 催化性能，而建立的實用性、簡單、靈敏且快速化學發(fā)光分析測定鐵蛋白的方法很有意義， 能夠解決上述檢測方法遇到的問題。具有以下優(yōu)點：（1)所用化學發(fā)光儀價格低廉且操作 簡單；（2)避免繁瑣和艱難的納米金（或銀）的溶解剝離，具有高的靈敏度和好的重現(xiàn)性； (3)所用的25nm納米金的合成簡便且易于標記；(4)該方法只需要非競爭的一步操作，避免 了多步反應(yīng)及洗脫步驟，大大節(jié)省了分析時間，將測試時間縮短為30分鐘以內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 當結(jié)合附圖考慮時，通過參照下面的詳細描述，能夠更完整更好地理解本發(fā)明以 及容易得知其中許多伴隨的優(yōu)點，但此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解， 構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā) 明的不當限定，其中：
[0017] 圖1抗體用量的優(yōu)化，納米金濃度固定為0. 6nM，所測吸光度為波長520nm處；
[0018] 圖2免疫反應(yīng)時間的影響，條件：魯米諾，5X 10_4M ;高碘酸鉀，5. OX 10_2M ;
[0019] 圖3鹽濃度的影響，條件：魯米諾，5X 10_4M ;高碘酸鉀，5. OX 10_2M ;
[0020] 圖4化學發(fā)光反應(yīng)動力學曲線；圖中自下至上分別為沒有納米金，納米金，納 米金+鐵蛋白抗體，納米金+鐵蛋白抗體+鐵蛋白；條件：魯米諾，5X 1(Γ4Μ ;高碘酸 鉀，5· 0Χ1(Γ2Μ ;
[0021] 圖5測定鐵蛋白的靈敏度分析；
[0022] 圖6測定鐵蛋白的特異性評價；注（a)鐵蛋白，（b)牛血清白蛋白（BSA)，（c)人免 疫球蛋白G(IgG)，⑷羊免疫球蛋白G IgG，（e)兔免疫球蛋白G IgG，（f) α -胎兒蛋白抗原 (AFT)；
[0023] 圖7方法可靠性的評價；
[0024] 圖8納米金透射電鏡圖；圖8a為納米金+鐵蛋白抗體，圖8b為納米金+鐵蛋白 抗體+鐵蛋白。

【具體實施方式】
[0025] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實 施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0026] 所用到的主要儀器設(shè)備和試劑：
[0027] IFFL-D流動注射化學發(fā)光分析儀及其配套設(shè)備（西安瑞邁分析儀器有限公司）， 透射電子顯微鏡（日立公司，規(guī)格型號：H-600)，恒溫磁力攪拌器（85-2型，上海司樂儀器有 限公司），恒溫水浴鍋（HH-1型，北京科偉永興儀器有限公司），KYC100C生化培養(yǎng)箱（上海 ?，攲嶒炘O(shè)備有限公司），可調(diào)微量加液器（上海求精玻璃儀器廠），聚苯乙烯96微孔板 (F0LC0N)。
[0028] 氯金酸（HAuC14 · 4H20, AR，Au含量>47. 8%，國藥集團化學試劑有限公司）；將氯 金酸固體溶于二次去離子水中制備氯金酸儲備溶液，放于4°C冰箱中保存。將4. 43g魯米諾 固體粉末溶解在20mL0. 10M NaOH溶液中并稀釋至1L，制備得到2. 5X10_2M魯米諾儲備溶 液。使用之前避光保存一星期以確保試劑性質(zhì)的穩(wěn)定。工作溶液通過稀釋魯米諾儲備溶液 而得到。將 13. 8g Na2HP04 · 12H20、1. 6g NaH2P04 · H20 和 9. Og NaCl 溶解在 1L 的二次去離子 超純水中，配制得到磷酸緩沖溶液（pH7. 4)。鄰苯二胺（OPD)底物溶液臨用前配制。鐵蛋白 抗體、鐵蛋白、人IgG、兔IgG、羊IgG、牛血清白蛋白和α-胎兒蛋白抗原（AFT)均購自于北 京鼎國生物技術(shù)有限公司。實驗用水為二次去離子水。
[0029] 實驗條件的優(yōu)化：
[0030] 選用粒徑為25nm的納米金粒子，固定其濃度為0. 6nM，對標記所用鐵蛋白抗體的 用量進行優(yōu)化，如圖1所示，選擇鐵蛋白抗體的濃度為〇. 5mg/mL。
[0031] 免疫反應(yīng)的有效程度對分析檢測鐵蛋白的靈敏性至關(guān)重要。實驗中考察了免疫反 應(yīng)的時間和鹽濃度的影響。結(jié)果如圖2和圖3所示，由圖2可以看出，免疫反應(yīng)一開始化學 發(fā)光信號較弱，隨著時間增加，化學發(fā)光信號逐漸增強，反應(yīng)時間到達15分鐘時，發(fā)光信號 迅速增強，約25分鐘以后達到穩(wěn)定。所以，免疫反應(yīng)的時間選擇為25分鐘。另外，高濃度 的鹽能夠引起納米金的團聚，而鹽濃度太低將會影響免疫反應(yīng)的有效進行。本發(fā)明考察了 鹽濃度的影響，從圖3可以看出，隨著鹽濃度的增加，化學發(fā)光信號增強，而當鹽濃度大于 1.5Xl(T 3m〇l/L時，隨著鹽濃度的增加，化學發(fā)光信號開始降低，可能是由于過高的離子強 度使蛋白質(zhì)（抗原或抗體）變質(zhì)，不利于免疫反應(yīng)的進行而導致納米金催化性能減弱，從而 化學強度降低。所以，NaCl濃度選擇為1. 5X 10_3mol/L。
[0032] 另外，考慮到化學發(fā)光強度和試劑的消耗，選擇魯米諾的濃度為5Xl(T4m 〇l/L，高 碘酸鉀濃度為5X10_2mol/L。實驗結(jié)果表明該體系的pH值為12.0時較適宜。
[0033] 25nm納米金的制備：
[0034] 采用檸檬酸鹽還原法制備。50mL的HAuC14 (0. 01 % w/w)溶液加熱至沸，然后在強 力攪拌下，迅速加入0. 8mLl %的檸檬酸鈉溶液。此混合溶液保持沸騰15分鐘后撤掉加熱 源，而后在不斷的攪拌下冷卻至室溫。得到的溶液于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0035] 鐵蛋白抗體修飾金納米顆粒的制備：
[0036] 將鐵蛋白抗體修飾在25nm金納米粒子的表面。取5mL納米金溶液用0· lmol/L K2C03溶液調(diào)節(jié)pH為9,加入lmL鐵蛋白抗體，室溫攪拌作用1小時使鐵蛋白抗體和金納米 粒子充分結(jié)合，于4°C離心30分鐘（12000轉(zhuǎn)/分）以除去未標記的抗體，吸出上清液，剩余 的沉淀用〇. Olmol/L含有1% BSA的磷酸緩沖溶液（pH7. 4)懸浮至原體積，于冰箱中（4°C ) 保存待用。
[0037] 化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白：
[0038] 考慮蛋白質(zhì)生物試劑的消耗，實驗中采取靜態(tài)注射的方式。移取免疫反應(yīng)完的鐵 蛋白抗體修飾的納米金/鐵蛋白混合液200 μ L于化學發(fā)光池中，注入300 μ L魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光試劑（5Χ10_4Μ魯米諾和5.0Χ10_2Μ高碘酸鉀的體積比為2:1)，通過 IFFL-D化學發(fā)光分析儀測定并記錄其化學發(fā)光強度。通過測定化學發(fā)光強度檢測鐵蛋白的 含量，由此可以得出化學發(fā)光強度和待測鐵蛋白之間的相關(guān)關(guān)系。
[0039] 鐵蛋白化學發(fā)光的分析性能：
[0040] 實驗中首先考察了 25nm納米金對魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光反應(yīng)的催化性能。 如圖4所示，在沒有催化劑的存在下，魯米諾-高碘酸鉀進行的是一個弱的化學發(fā)光反應(yīng)。 25nm納米金能夠催化該體系的化學發(fā)光反應(yīng)，鐵蛋白抗體對納米金進行標記幾乎沒有對其 催化性能產(chǎn)生影響，而免疫反應(yīng)能夠?qū)е录{米金的團聚，這一形態(tài)的改變使得其催化性能 大大提高?；诖爽F(xiàn)象，實現(xiàn)了鐵蛋白的化學發(fā)光分析檢測。
[0041] 在前述優(yōu)化的實驗條件下，考察了鐵蛋白分析測定的靈敏性。實驗中發(fā)現(xiàn)隨著鐵 蛋白濃度的增加，化學發(fā)光信號逐漸增強。且在6. 0X 10-?6. OX l(Tg/mL的濃度范圍 內(nèi)，化學發(fā)光的強度與鐵蛋白的濃度的對數(shù)值成良好的線性關(guān)系，線性曲線如圖5所示，其 檢出限為2. 8X 10_ng/mL(S/N = 3)。并對5. 6X 10_9g/mL的鐵蛋白進行六次重復(fù)測定，相 對標準偏差（R.S.D.)為3. 6%。實驗結(jié)果表明該方法檢出限低，精密度好。和已有的靈敏 性較好的電化學檢測方法相比較，檢出限相當，但本方法簡便快速得多。
[0042] 該化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的特異性評價結(jié)果如圖6所示，所用待測物的濃度均 為5. 0Xl(Tg/mL時，只有當待測物為鐵蛋白時才有明顯的化學發(fā)光信號，而其它組分所誘 導的化學發(fā)光信號相對來說都非常弱，表明本發(fā)明所建立的方法對于鐵蛋白的測定具有良 好的特異性。
[0043] 血樣的測定：
[0044] 人血清樣品經(jīng)稀釋后同時用本發(fā)明所提出的化學發(fā)光分析方法及酶聯(lián)免疫吸附 分析方法進行測定，用以評價本發(fā)明所建立的分析方法檢測鐵蛋白的可靠性。
[0045] 實驗中將一系列稀釋的人血清樣品作為待測樣品，用本方法進行測定，同時測定 并繪制鐵蛋白的標準曲線。根據(jù)鐵蛋白的標準曲線，得出血清樣品中鐵蛋白的濃度，與用酶 聯(lián)免疫吸附方法得出的結(jié)果進行比較，結(jié)果如圖7所示，兩種分析方法測定的結(jié)果基本相 同，說明本發(fā)明所建立的化學發(fā)光分析方法檢測鐵蛋白比較可靠，可以用于實際血清樣品 的測定。
[0046] 利用透射電鏡對鐵蛋白抗體修飾的納米金在與鐵蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)前后的變化 進行了研究，結(jié)果如圖8?？梢钥闯?，鐵蛋白抗體標記的納米金是單分散的（圖8a)，免疫反 應(yīng)完之后納米金發(fā)生了明顯的團聚（圖8b)。
[0047] 以上實例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想；同時，對于本領(lǐng)域的一般 技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在【具體實施方式】及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述， 本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于納米金催化的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 納米金溶液制備，0.01 % w/w的HAuC14溶液加熱至沸，強力攪拌下加入1 %的檸檬 酸鈉溶液，混合溶液保持沸騰15分鐘后撤掉加熱源，而后不斷攪拌冷卻至室溫，得到的溶 液于4 C冰箱中保存?zhèn)溆茫? 2) 鐵蛋白抗體對納米金的標記，利用鐵蛋白抗體修飾金納米顆粒，具體為：將鐵蛋白 抗體修飾在納米金粒子的表面，取納米金溶液用〇. lmol/L K2C03溶液調(diào)節(jié)pH為9,加入 鐵蛋白抗體，室溫攪拌作用1小時使鐵蛋白抗體和金納米粒子充分結(jié)合，于4°C溫度環(huán)境 下以12000轉(zhuǎn)/分的速度離心30分鐘，以除去未標記的抗體，吸出上清液，剩余的沉淀用 0. Olmol/L含有1 % BSA的磷酸緩沖溶液pH7. 4懸浮至原體積，于4°C冰箱中保存待用； 3) 免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)選用NaCl濃度為1.5Xl(T3m〇l/L，免疫反應(yīng)時間為15-25分鐘； 4) 化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白，移取免疫反應(yīng)完的鐵蛋白抗體修飾的納米金/鐵蛋白混 合液于化學發(fā)光池中，注入魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光試劑，通過IFFL-D化學發(fā)光分析儀 測定并記錄其化學發(fā)光強度；通過測定化學發(fā)光強度檢測鐵蛋白的含量，由此可以得出化 學發(fā)光強度和待測鐵蛋白之間的相關(guān)關(guān)系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金催化的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法， 其特征在于，所述的步驟1)中，選用的納米金的粒徑為25nm，濃度為6. 0X10_1(lmol/L? 6. 0Xl(T8mol/L 之間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金催化的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法，其 特征在于，所述的步驟2)中，標記鐵蛋白抗體所用濃度為0. 5mg/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金催化的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法， 其特征在于，所述的步驟4)中，選擇魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光試劑為5 X 1(Γ4Μ魯米諾和
5. ΟΧ 1(Γ2Μ高碘酸鉀的體積比為2:1混合而成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于納米金催化的化學發(fā)光分析檢測鐵蛋白的方法，其 特征在于，其特征在于，魯米諾-高碘酸鉀化學發(fā)光試劑的pH值優(yōu)化為12. 0。
【文檔編號】G01N21/76GK104062287SQ201410308668
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】齊瑩瑩, 修福榮 申請人:福建工程學院