基于生物傳感器對(duì)熒光標(biāo)記的mcf腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的制作方法
【專利摘要】本文發(fā)明了一種基于生物探針和DNA循環(huán)放大相結(jié)合構(gòu)建新型的生物化學(xué)傳感器，來檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法。磁珠表面進(jìn)行發(fā)卡DNA和前體1的連接修飾，加入端粒酶打來發(fā)卡結(jié)構(gòu)，進(jìn)而與修飾有前體2的金納米粒子結(jié)合，而納米粒子上又標(biāo)記有大量熒光分子，通過循環(huán)放大增強(qiáng)其熒光信號(hào)。最終，通過熒光信號(hào)對(duì)腫瘤細(xì)胞中端粒酶進(jìn)行定量分析，在醫(yī)學(xué)中及早的檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞。
【專利說明】基于生物傳感器對(duì)熒光標(biāo)記的MCF腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 生物傳感器通常是指由一種生物敏感部件和轉(zhuǎn)化器緊密結(jié)合，對(duì)特定種類化學(xué)物 質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。它是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種 先進(jìn)的檢測(cè)與監(jiān)控方法，也是對(duì)物質(zhì)在分子水平上進(jìn)行快速和微量分析的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物傳感器主要的組成部件有感受器和換能器，其主要的工作原理是待測(cè)物質(zhì)經(jīng) 擴(kuò)散作用進(jìn)入固定生物膜敏感層，經(jīng)分子識(shí)別而發(fā)生生物學(xué)作用，產(chǎn)生的信息如光、熱、音 等被相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭啥亢吞幚淼碾娦盘?hào)，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，以電極測(cè) 定其電流值或電壓值，從而換算出被測(cè)物質(zhì)的量或濃度。
[0003] 生物傳感器的分類方法很多中，其中，根據(jù)生物物質(zhì)分類，可分為：酶傳感器、微生 物傳感器、細(xì)胞器傳感器、組織傳感器、免疫傳感器、基因傳感器等。
[0004] 基因傳感器也稱為核酸傳感器，是依據(jù)生物體內(nèi)核苷酸順序相對(duì)穩(wěn)定，核苷酸堿 基順序互補(bǔ)的原理而設(shè)計(jì)出核酸探針傳感器。基因傳感器一般有10-30個(gè)核苷酸的單鏈核 酸分子，能夠?qū)Ｒ坏嘏c特定靶序列進(jìn)行雜交從而檢測(cè)出特定的目標(biāo)核酸分子。
[0005] 端粒是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，它是由許多簡單短重復(fù)序列和端粒結(jié)合蛋白 組成。在正常人體細(xì)胞中，可隨著細(xì)胞分裂而逐漸縮短。端粒是細(xì)胞必需的遺傳組分，因?yàn)?它能夠保護(hù)和補(bǔ)償染色體末端遺傳信息的丟失，保護(hù)它不會(huì)被核酸酶識(shí)別而免遭降解。端 粒酶是合成端粒DNA的特殊逆轉(zhuǎn)錄酶，具有RNA依賴性和DNA多聚酶性質(zhì)的核糖體蛋白復(fù) 合體，能以自身RNA為模板，在hTERT (端粒逆轉(zhuǎn)錄酶）的逆轉(zhuǎn)錄催化下，將端粒重復(fù)序列合 成并添加到染色體末端，不斷合成端粒酶DNA序列，保持染色體端粒的完整性。
[0006] 端粒酶與90%以上的人類惡性腫瘤之間的緊密聯(lián)系，使該酶成為目前已知的最 為廣泛的腫瘤分子標(biāo)志物。端粒酶活性評(píng)價(jià)對(duì)早期癌癥的發(fā)現(xiàn)、判斷腫瘤的侵襲性、病理分 級(jí)、分期和腫瘤治療后監(jiān)測(cè)病人的殘存或微小病灶以及復(fù)發(fā)是有用的指標(biāo)。因此，端粒酶活 性測(cè)定對(duì)臨床可提供許多有價(jià)值的信息。端粒酶抑制劑為腫瘤的治療提供了新的領(lǐng)域，但 選擇對(duì)瘤細(xì)胞高選擇性的靶，對(duì)正常細(xì)胞沒有損害的端粒酶抑制劑仍比較困難且很重要。 另外端粒酶的調(diào)控機(jī)制和合成端粒酶的分子機(jī)制尚不十分清楚，能否從端粒酶蛋白及其基 因水平阻斷端粒酶活性等仍有許多問題需要研究和探討。如何進(jìn)一步提高靈敏度、增強(qiáng)安 全性、減少操作的煩瑣程度以及降低實(shí)驗(yàn)的成本，是各種檢測(cè)方法最終的追求目標(biāo)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明結(jié)合了前人工作的基礎(chǔ)上提出利用分子信標(biāo)和納米金粒子構(gòu)建了新型的 生物化學(xué)傳感器，采用磁性微球和發(fā)卡環(huán)鏈循環(huán)置換，納米金粒子技術(shù)實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的兩次 放大，并且將此傳感器應(yīng)用在了端粒酶等腫瘤標(biāo)志物和宮頸癌（Hela)細(xì)胞的檢測(cè)中，通過 對(duì)熒光光譜的應(yīng)用，進(jìn)而為測(cè)定腫瘤細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞中端粒酶的濃度提供了一種方便可 靠而又快捷的方法，這也使得應(yīng)用此方法提高腫瘤細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞的檢測(cè)限成為了可 能。
[0008] 本發(fā)明所提供的方法包括以下步驟：
[0009] (1)還原性金納米粒子的合成：組裝蒸餾裝置，向其加入50mL的0. 01 %氯金酸，調(diào) 節(jié)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)數(shù)，加熱至沸?？焖偌尤胍欢繖幟仕徕c，再煮沸20min。溶液由無色逐漸變?yōu)榫?紅色，自然冷卻至室溫。倒入廣口瓶中，置于冰箱中（4°C )保存，備用。
[0010] 所述的方法，其所述的還原劑為檸檬酸三納。
[0011] ⑵銀包金納米探針的合成：向金膠離心后加入PBS緩沖溶液、前體2和熒光DNA， 避光24h。再離心，加入1 % PVP、0. lmL-SA、ImM AgN03溶液，避光37°C溫育震蕩5h。
[0012] 所述的方法，其所述的用PVP和L-SA來保護(hù)金膠，防止其聚沉。
[0013] 所述的方法，其所述的反應(yīng)溫度為37°C，時(shí)間為5h。
[0014] (3)磁珠載體的修飾：向活化好的磁珠加入發(fā)卡DNA，避光溫育24h。磁分離，PBS 洗滌，加入前體1，溫育2h。
[0015] 所述的方法，其所述的所用的磁珠需避光進(jìn)行，反應(yīng)24h。
[0016] 所述的方法，其所述的加入前體1后反應(yīng)時(shí)間為2h。
[0017] (4)磁珠與酶結(jié)合：向步驟（c)中加入不同濃度的端粒酶和dNTPs，溫育2h。
[0018] 所述的方法，其所述的加入端粒酶的反應(yīng)時(shí)間為2h。
[0019] (5)探針與磁珠的結(jié)合：將步驟（d)和步驟（b)混合均勻，溫育2h。力口 DNA聚合 酶，震蕩溫育24h。
[0020] 所述的方法，其所述的探針與磁珠結(jié)合的反應(yīng)時(shí)間為2h。
[0021] 所述的方法，其所述的加入DNA聚合酶后的反應(yīng)時(shí)間為24h。
[0022] 所述的方法，其所述的利用特定序列的DNA單鏈循環(huán)放大使得信號(hào)呈指數(shù)增長。
[0023] (6)熒光檢測(cè)：分子熒光儀測(cè)其熒光值。
[0024] 所述的方法，其所述的利用化學(xué)方法來檢測(cè)腫瘤物質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 附圖1為發(fā)明設(shè)計(jì)過程原理圖。1、合成還原性金納米粒子；2、合成銀包金納米探 針；
[0026] 3、磁珠載體的修飾；4、磁珠與酶結(jié)合；5、探針與磁珠的結(jié)合；6、突光檢測(cè)
[0027] 附圖2為端粒酶濃度曲線（從下往上依次為10IU，20IU，30IU，40IU，50IU，60IU)
[0028] 附圖3為端粒酶反應(yīng)時(shí)間曲線
[0029] 附圖4為溫度最佳曲線
[0030] 附圖5為pH最佳曲線

【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式 限制本發(fā)明。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 基于生物傳感器對(duì)熒光標(biāo)記的MCF腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)（見圖1)
[0034] 一、生物探針的制備
[0035] (1)金納米粒子的制備
[0036] 納米金粒子的合成是通過檸檬酸三鈉還原四氯金酸制備而成。具體制備方法如 下：
[0037] 1%檸檬酸鈉：稱取0. 0306g檸檬酸鈉溶于3mL水中。
[0038] 0. 01 %氯金酸：取1 %氯金酸500 μ L，置于50mL的容量瓶中，搖勻，待用。
[0039] 將蒸餾裝置（250mL的三口燒瓶，球型冷凝管，進(jìn)水管和出水管）組裝好，向其加入 50mL的0. 01 %氯金酸，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)數(shù)，加熱至沸。快速加入一定量檸檬酸鈉，再煮沸20min。 此時(shí)，燒瓶中溶液由無色逐漸變?yōu)榫萍t色，自然冷卻至室溫。倒入廣口瓶中，置于冰箱中保 存（4°C )，備用。
[0040] (2)銀包金探針的合成
[0041] 取500μ L金膠溶液，在10000r/min的離心機(jī)上離心30min，用PBS(10mM的磷酸 鹽，0· 03M NaCl, ρΗ7· 4)緩沖溶液定容至 50 μ L，加入 25 μ L Primer2DNA 和 50 μ L 熒光 DNA， 避光反應(yīng)24h。再同上離心，用PBS(10mM的磷酸鹽，0. 03Μ NaCl，pH7. 4)緩沖溶液定容至 50 μ L，向其中加入 1 % 的 PVP19. 8 μ L，0· 1M 的 L-SA29. 7 μ L，ImM 的 AgN03 溶液 12 μ L，避光 處理，恒溫震蕩孵育5h。即可制得銀包金納米探針。
[0042] 二、磁珠載體的修飾
[0043] (1)活化磁珠
[0044] 用咪唑鹽酸（0. 1Μ，ρΗ6. 8)溶液洗滌三次，并加入50 μ L的咪唑鹽酸；再加入40 μ L EDC溶液活化磁珠2h。
[0045] (2)磁珠載體的修飾
[0046] 向活化好的磁珠中加入一定量的發(fā)卡DNA，37°C恒溫孵育24h。使用磁力架將磁性 微球與未連接在磁性微球上的DNA進(jìn)行分離，并用50 μ L PBS (10mM的磷酸鹽，0. 1M NaCl， pH7. 4)緩沖溶液洗滌三次，定容至原來的體積，加入一定量的PrimerlDNA，恒溫孵育2h ;再 加入2. 5 μ L不同濃度的端粒酶及dNTPsl μ L，恒溫孵育2h。
[0047] 三、探針與金膠結(jié)合
[0048] 向磁性微球溶液中加入結(jié)合好的Primer2DNA與10nm的金納米粒子，再次恒溫孵 育2h ;加入Klenow DNA聚合酶10 μ L(聚合酶：buffer = 1:9)，恒溫孵育24h。
[0049] 四、熒光檢測(cè)
[0050] 將磁珠進(jìn)行洗滌三次，測(cè)其熒光值。
【權(quán)利要求】
1. 基于生物傳感器對(duì)熒光標(biāo)記的MCF腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。步驟包括： (a) 還原性金納米粒子的合成：組裝蒸饋裝置，向其加入50mL的0. 01 %氯金酸,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn) 子轉(zhuǎn)數(shù)，加熱至沸?？焖偌尤胍欢繖幟仕徕c，再煮沸20min。溶液由無色逐漸變?yōu)榫萍t色， 自然冷卻至室溫。倒入廣口瓶中，置于冰箱中（4°C)保存，備用。 (b) 銀包金納米探針的合成：向金膠離心后加入PBS緩沖溶液、前體2和熒光DNA，避光 24h。再離心，加入1% PVP、0. lmL-SA、lmM AgN03溶液，避光37°C溫育震蕩5h。 (c) 磁珠載體的修飾：向活化好的磁珠加入發(fā)卡DNA，避光溫育24h。磁分離，PBS洗滌， 加入前體1，溫育2h。 (d) 磁珠與酶結(jié)合：向步驟（c)中加入不同濃度的端粒酶和dNTPs，溫育2h。 (e) 探針與磁珠的結(jié)合：將步驟（d)和步驟（b)混合均勻，溫育2h。加 DNA聚合酶，震 蕩溫育24h。 (f) 熒光檢測(cè)：分子熒光儀測(cè)其熒光值。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（b)中反應(yīng)溫度為37°C，時(shí)間為5h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（b)中用PVP和L-SA來保護(hù)金膠， 防止其聚沉。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（c)中磁珠需避光進(jìn)行，反應(yīng)24h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（c)中加入前體1后反應(yīng)時(shí)間為2h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（d)中反應(yīng)時(shí)間為2h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（e)中探針與磁珠結(jié)合的反應(yīng)時(shí)間 為2h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（e)中加入DNA聚合酶后的反應(yīng)時(shí) 間為24h。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：利用特定序列的DNA單鏈循環(huán)放大使得 信號(hào)呈指數(shù)增長。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：利用化學(xué)方法來檢測(cè)腫瘤物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104089936SQ201410336488
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】丁彩鳳, 李小倩, 張偉, 張書圣 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)