一種適用于反芻動(dòng)物骨骼肌全蛋白制備及雙向電泳技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種反芻動(dòng)物骨骼肌的總蛋白質(zhì)提取及雙向電泳方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。是針對(duì)反芻動(dòng)物，特別是羊的骨骼肌中全蛋白采用雙向電泳技術(shù)分離和分析，采用本技術(shù)方案對(duì)羊骨骼肌進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)取得了較優(yōu)效果。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，采用雙向電泳方法對(duì)其進(jìn)行分離，分離所得蛋白點(diǎn)多，重復(fù)性好、圖譜清晰，無(wú)橫縱紋現(xiàn)象，蛋白點(diǎn)規(guī)則，重復(fù)性好，是一套適用于反芻動(dòng)物骨骼肌總蛋白組分析的雙向電泳方法。
【專利說(shuō)明】—種適用于反芻動(dòng)物骨骼肌全蛋白制備及雙向電泳技術(shù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種反芻動(dòng)物骨骼肌的全蛋白制備及雙向電泳技術(shù)，該技術(shù)可直接應(yīng)用于羊及其他反芻動(dòng)物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

【背景技術(shù)】
[0002]由于生長(zhǎng)環(huán)境、飼喂方式等條件的不同，羊肉的品質(zhì)特性與豬肉、牛肉存在差異。羊肉的粗蛋白含量(12.8% -18.6% )低于牛肉(16.2% -19.9 % )，高于豬肉(13.5% -16.4% )。粗脂肪含量(16% -37% )低于豬肉(25% -37% )，高于牛肉(11% -28% )0蛋白質(zhì)和脂肪含量的差異，決定了羊骨骼肌雙向電泳的技術(shù)條件。
[0003]本發(fā)明的突破點(diǎn)就是建立羊骨骼肌的雙向電泳技術(shù)體系，利用該技術(shù)可對(duì)羊骨骼肌進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析，也可延伸至其他反芻動(dòng)物肉品質(zhì)特性的研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種反芻動(dòng)物骨骼肌的全蛋白提取及雙向電泳技術(shù)，是針對(duì)反芻動(dòng)物蛋白采用雙向電泳技術(shù)制備，該技術(shù)經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明樣品制備全、重復(fù)性好、圖譜清晰，是一套適用于反芻動(dòng)物骨骼肌蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)。
[0005]本發(fā)明所述的一種反芻動(dòng)物骨骼肌的蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，按下列步驟進(jìn)行:
[0006]采集反芻動(dòng)物骨骼肌，液氮速凍后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-SO0C以下保存?zhèn)溆茫?br> [0007]a)取出-80°C條件下保存的肌肉組織，冰凍狀態(tài)下稱取Ig放入研缽中，加入適量液氮研磨至粉末狀；
[0008]b)分裝至離心管中，加入10倍體積裂解液(7M尿素、2M硫脲、4% CHAPS、40mMTris、40mM DTT、lmmol/L 蛋白酶抑制劑)；
[0009]c)輔以超聲破碎10s，4°C孵育2h后于1000Xg低溫4°C離心機(jī)中離心Ih ；
[0010]d)撇去上層脂肪層后將上清液分裝；
[0011]e)蛋白質(zhì)定量:Bradford法,測(cè)定濃度后于_80°C保存；
[0012]f)第一向等電聚焦電泳:測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，用水化液定量調(diào)整樣品濃度為Img/mL，定量蛋白用樣品水化液溶解樣品，吸取450 μ L樣品溶液加入膠條槽中。膠條(ρΗ3_10、ΡΗ4-7)剝?nèi)ケＷo(hù)膜后膠面向下放入膠條槽中，確保沒有氣泡后覆蓋一層礦物油防止等電聚焦時(shí)尿素析出等。膠條采取被動(dòng)水化12-16h后，置于Ettan IPGphor3等電聚焦儀中，按設(shè)定的兩種不同程序等電聚焦，控制溫度為20°C。每根膠條限流50μΑ ;
[0013]g)膠條平衡:等電聚焦結(jié)束后膠條先在1mL含1% DTT的平衡緩沖液I (6M尿素、75mM Tris-HCl,29.3%甘油、2% SDS)中平衡15min，之后換用1mL含2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液 II (6M 尿素、75mM Tris-HCl,29.3%甘油、2% SDS)中平衡 15min ；
[0014]h)第二向SDS-PAGE電泳:將膠條轉(zhuǎn)移至12%的分離膠上端，用0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖封頂，以最大電壓(600V)、電流(400mA)進(jìn)行二向電泳。電泳參數(shù)設(shè)置為:初始功率IW/膠，運(yùn)行Ih后將功率提至8W/膠，直至溴酚藍(lán)染料遷移膠底邊緣后結(jié)束電泳；
[0015]i)染色:電泳結(jié)束后卸下膠板,取出膠進(jìn)行染色。分別用改良考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，銀染兩種方法進(jìn)行染色。
[0016]j)脫色:G_250染色結(jié)束后水洗脫至背景無(wú)色透明后掃描膠圖，銀染用5%的乙酸洗膠。
[0017]前述的方法，其特征在于，所述的漸進(jìn)式升壓，初始電壓為50V，然后在不少于9h的時(shí)間內(nèi)緩慢的升壓到500V。
[0018]前述的方法，其特征在于，所述的漸進(jìn)式升壓，初始電壓為50V，保持6h，然后再升壓至200V，再升壓到500V。
[0019]前述的方法，其特征在于，所述的漸進(jìn)式升壓，初始電壓為50V，保持6h，然后再升壓至200V，保持lh，再升壓到500V。
[0020]前述的方法，其特征在于，整個(gè)過(guò)程的溶液配制均需用超純水。
[0021]前述的方法，其特征在于，樣品提取階段需要全程冰上操作或進(jìn)行適當(dāng)冰浴。
[0022]前述的方法，其特征在于，整個(gè)過(guò)程所需的DTT均需現(xiàn)用現(xiàn)加。
[0023]前述的方法，其特征在于，所述的反芻動(dòng)物為羊。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為直接升壓后考馬斯亮藍(lán)染色得到膠圖；
[0025]圖2為漸進(jìn)式升壓后銀染所得到的膠圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1
[0027]采用Ne0fugel5R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和美國(guó)GE雙向電泳系統(tǒng)；
[0028]a)于屠宰場(chǎng)采集羊肉樣品，液氮速凍運(yùn)回，_80°C保存；
[0029]b)解凍后稱取Ig羊肉樣品，去除脂類、筋膜后用加入液氮粉碎樣品；
[0030]c)加入10倍體積裂解液，用細(xì)胞破碎儀超聲破碎10s，4°C孵育2h后于1000Xg低溫4°C離心機(jī)中離心Ih ；
[0031]d)離心后漂去上層脂質(zhì)，吸取適量清液分裝備用，若脂肪過(guò)多可吸取上清液進(jìn)行二次離心，以提高蛋白質(zhì)的提取率；
[0032]e)蛋白質(zhì)定量:采用考馬斯亮藍(lán)染色法(Bradford法)測(cè)定蛋白質(zhì)含量；使用T6系列紫外可見分光光度計(jì)，將蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)梯度稀釋后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，波長(zhǎng)595nm測(cè)定吸收度，用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定蛋白質(zhì)含量；
[0033]f)第一向等電聚焦電泳:測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，用水化液定量調(diào)整樣品濃度為Img/mL，定量蛋白用樣品水化液溶解樣品，吸取500 μ L樣品溶液加入膠條槽中。膠條(ρΗ3-10、ΡΗ4-7)剝?nèi)ケＷo(hù)膜后膠面向下放入膠條槽中，確保沒有氣泡后覆蓋一層礦物油防止等電聚焦時(shí)尿素析出等。膠條采取被動(dòng)水化12-16h后，置于Ettan IPGphor3等電聚焦儀中，按表I設(shè)定的程序進(jìn)行等電聚焦，控制溫度為20°C。
[0034]g)表IIEF參數(shù)設(shè)置:
[0035]

【權(quán)利要求】
1.一種反芻動(dòng)物骨骼肌蛋白雙向電泳方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行: 1)采集反芻動(dòng)物骨骼肌樣品，用液氮罐裝運(yùn)回，在實(shí)驗(yàn)室-80°C以下保存?zhèn)溆茫? 2)稱取Ig反芻動(dòng)物骨骼肌解凍后放入研缽中，加入液氮研磨，直到研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入預(yù)冷_20°C的15ml離心管； 3)加入10倍體積預(yù)冷的蛋白質(zhì)裂解液(7M尿素、2M硫脲、40mMTris、質(zhì)量體積比4%3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、lmM蛋白酶抑制劑、2%IPG buffer)，充分混合后，放在輔以超聲破碎1s ； 4)4°C孵育2h后于lOOOOXg、低溫4°C離心機(jī)中離心Ih； 5)離心后漂去上層脂質(zhì)，吸取適量清液分裝備用，若脂肪過(guò)多可吸取上清液進(jìn)行二次尚心，以提聞蛋白質(zhì)的提取率； 6)蛋白質(zhì)定量:采用Bradford法測(cè)定其蛋白濃度； 7)第一向等電聚焦電泳:按上樣量450yg，上樣體積450yL，對(duì)已定量好的蛋白樣品進(jìn)行稀釋，上樣水化液同步驟3)中的裂解液，將樣品加入固相pH梯度IPG膠條聚焦盤內(nèi)后，再將PH4-7，pH3-10,24cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液間的氣泡，用2ml礦物油/條，覆蓋膠條，進(jìn)行等電聚焦電泳；所述的等電聚焦電泳中采用漸進(jìn)式升壓； 8)膠條平衡:將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進(jìn)行平衡1、II，每次平衡時(shí)間為15min,平衡緩沖液配制如下: 膠條平衡緩沖液母液:6M尿素，2 % (w/v)十二烷基磺酸鈉SDS’ 75mMpH8.8的Tris-HCl, 29.3%的87%甘油，溶劑為水。 膠條平衡緩沖液1:每1ml膠條平衡緩沖液母液加入0.1g DTT ； 膠條平衡緩沖液I1:每1ml膠條平衡緩沖液母液加入0.25g碘乙酰胺； 9)第二向SDS-PAGE電泳:將平衡好的膠條置于膠濃度為質(zhì)量體積比12%的SDS-PAGE膠上，用質(zhì)量體積比0.5%、含有質(zhì)量體積比0.002%溴酚藍(lán)的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液封住頂部，按如下參數(shù)進(jìn)行電泳:12°C恒溫下，最大電流電壓下，先用Iw/膠，1.5h;再用8.5w/膠至電泳結(jié)束； 10)染色方法:采用考馬斯亮藍(lán)法和銀染法進(jìn)行染色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的漸進(jìn)式升壓，初始電壓為50V，然后在不少于9h的時(shí)間內(nèi)緩慢的升壓到500V。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其特征在于，所述的漸進(jìn)式升壓，初始電壓為50V，保持6h，然后再升壓至200V，再升壓到500V。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述的漸進(jìn)式升壓，初始電壓為50V，保持6h，然后再升壓至200V，保持lh，再升壓到500V。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法，其特征在于，整個(gè)過(guò)程的溶液配制均需用超純水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的方法，其特征在于，樣品提取階段需要全程冰上操作或進(jìn)行適當(dāng)冰浴。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其特征在于，整個(gè)過(guò)程所需的DTT均需現(xiàn)用現(xiàn)加。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的方法，其特征在于，所述的反芻動(dòng)物為羊。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK104075924SQ201410336583
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】張德權(quán), 何凡, 陳立娟, 陳麗, 王振宇, 楊揚(yáng), 倪娜, 夏安琪, 劉越 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所