一種維生素b12的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種維生素B12的測(cè)定方法，樣品前處理采用冷凍干燥粉碎，然后再通過(guò)維生素B12富集的方法，使維生素B12在低含量的軟糖中可檢出，而且檢出結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)手段為高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的維生素B12的測(cè)定方法，可以解決維生素B12在軟糖中難富集和準(zhǔn)確測(cè)定含量的問(wèn)題，同時(shí)可以簡(jiǎn)化維生素B12利用生物法的間接含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)化維生素B12低添加量下的糖果產(chǎn)品含量測(cè)定和質(zhì)量控制方法。
【專利說(shuō)明】—種維生素BI 2的測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及維生素測(cè)定領(lǐng)域，確切地說(shuō)是一種維生素B12的測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]維生素B12又稱鈷胺素或氰鈷素，是一種由含鈷的卟啉類化合物組成的B族維生素，是唯一含金屬元素的維生素。自然界中的維生素B12都是微生物合成的，高等動(dòng)植物不能制造維生素B12。維生素B12是需要一種腸道分泌物(內(nèi)源因子)幫助才能被吸收的惟一的一種維生素。有的人由于腸胃異常，缺乏這種內(nèi)源因子，即使膳食中來(lái)源充足也會(huì)患惡性貧血。而植物性食物中基本上沒(méi)有維生素B12。
[0003]按照GB/T17819-1999，低含量的維生素B12在植物膠軟糖等營(yíng)養(yǎng)果糖中很難檢出。其他的常規(guī)檢測(cè)如微生物法、發(fā)酵法，由于維生素B12性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解，上述常規(guī)方法為測(cè)定鈷元素，并不能確定完整的維生素B12分子式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述缺陷，本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種對(duì)低含量維生素B12的測(cè)定方法，可以解決維生素B12在軟糖中難富集和準(zhǔn)確測(cè)定含量的問(wèn)題，同時(shí)可以簡(jiǎn)化維生素B12利用生物法的間接含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)化維生素B12低添加量下的糖果產(chǎn)品含量測(cè)定和質(zhì)量控制方法。
[0005]為了解決以上的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的一種維生素B12的測(cè)定方法，包括如下步驟:
[0006]I)、取冷凍至硬的含有維生素B12的樣品，粉碎；
[0007]2)、取粉碎后的樣品加熱溶解提取，提取液待用；
[0008]3)、取固相萃取柱，加醇類活化，再用水進(jìn)行平衡，取步驟2的提取液加到固相萃取柱上，上樣后，用水進(jìn)行淋洗，完畢后負(fù)壓抽干，再加入醇類洗脫，洗脫液收集到比色管內(nèi)，水浴氮吹干，然后加入水漩渦溶解，過(guò)濾膜過(guò)濾后待上機(jī)測(cè)定；
[0009]4)、進(jìn)行液相色譜分析，液相色譜的條件如下:
[0010]色譜柱:菲羅門Kinetex HTT,TC, 10mmX4.6mm ID2.6um ；
[0011 ] 流動(dòng)相:乙腈+1mM銨鹽溶液+酸溶液；
[0012]流速:0.4-0.8mL/min ；
[0013]進(jìn)樣量:2_4uL;
[0014]柱溫:25-40O ；
[0015]5)、進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件為:
[0016]離子源:ESI；
[0017]掃描方式:ESI+;
[0018]檢測(cè)方式:MRM;
[0019]裂解電壓:100-200V;
[0020]霧化器壓力:45psi ；
[0021]加熱輔助氣流速:8-15L/min ;
[0022]輔助氣溫度:200-400°C；
[0023]定性、定量離子對(duì)，碰撞氣能量和去簇電壓見下表:
[0024]

【權(quán)利要求】
1.一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)、取冷凍至硬的含有維生素B12樣品，粉碎； 2)、取粉碎后的樣品加熱溶解提取，提取液待用； 3)、取固相萃取柱，加醇類活化，再用水進(jìn)行平衡，取步驟2的提取液加到固相萃取柱上，上樣后，用水進(jìn)行淋洗，完畢后負(fù)壓抽干，再加入醇類洗脫，洗脫液收集到比色管內(nèi)，水浴氮吹干，然后加入水漩渦溶解，過(guò)濾膜過(guò)濾后待上機(jī)測(cè)定； 4)、進(jìn)行液相色譜分析，液相色譜的條件如下: 色譜柱:菲羅門 Kinetex HILIC, 10mmX4.6mm ID2.6um ； 流動(dòng)相:乙腈+1mM銨鹽溶液+酸溶液；
流速:0.4-0.8mL/min ； 進(jìn)樣量:2-4uL ； 柱溫:25-40 0C ； 5)、進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件為: 尚子源:ESI ； 掃描方式=ESI+ ； 檢測(cè)方式:MRM ； 裂解電壓:100-200V ； 霧化器壓力:45psi ； 加熱輔助氣流速:8-15L/min ； 輔助氣溫度:200-400°C ； 定性、定量離子對(duì)，碰撞氣能量和去簇電壓見下表:化合物定性離子對(duì)定量離子對(duì)碰撞氣能量裂解電壓
6)、吸取l_5ul標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液注入高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀中，以保留時(shí)間和質(zhì)荷比定性，峰面積定量，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定； 7)、維生素B12含量(ug/100g)
其中: C1——由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得試樣溶液中維生素B12的濃度，單位ng/mL ； C0-空白試劑維生素B12的濃度,單位ng/mL ； V1-樣品定量體積，單位mL ； V2——試樣溶液上樣體積,單位mL ； m——樣品取樣量，單位g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，步驟2中，取粉碎后樣品4.000-6.0OOg放入10mL燒杯中，加入約25mL純水，置于50°C _80°C水浴加熱溶解，樣液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，再分別兩次用1mL潤(rùn)洗燒杯，洗液合并至容量瓶，純水定容至刻度，樣液待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，步驟2中，取粉碎后樣品5.0OOg放入10mL燒杯中，加入約25mL純水，置于70°C水浴加熱溶解，樣液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，再分別兩次用1mL潤(rùn)洗燒杯，洗液合并至容量瓶，純水定容至刻度，樣液待用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，步驟3中，取固相萃取柱，先加2-10mL醇類進(jìn)行活化，再用2-10倍水進(jìn)行平衡，速度為1_3滴/s，取步驟2中提取液4.00-6.0OmL加到固相萃取柱上,上樣后,用4_6mL水進(jìn)行淋洗,完畢后負(fù)壓抽干，加入4-10mL醇類洗脫，洗脫液收集至1mL比色管，30-70°C水浴氮吹干，然后再加入0.50-2.0OmL水漩渦溶解，過(guò)濾膜后待上機(jī)測(cè)定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，步驟3中，取固相萃取柱，先加2-10mL醇類進(jìn)行活化，再用3倍水進(jìn)行平衡，速度為I滴/s，取步驟2中提取液5.0OmL加到固相萃取柱上,上樣后，用5mL水進(jìn)行淋洗,完畢后負(fù)壓抽干，加入4-1OmL醇類洗脫，洗脫液收集至1mL比色管，50°C水浴氮吹干，然后再加入1.0OmL水漩渦溶解，過(guò)濾月旲后待上機(jī)測(cè)定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，步驟3中，加醇類進(jìn)行活化，所述醇類為甲醇，甲醇的量為2.00?10.0OmL ;加入醇類洗脫，所述醇類為甲醇，甲醇的量為5.00?10.0OmL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，步驟3中，固相萃取柱為 APEL HLB、PhenomenexSTRATA-X或 Water s Oasis HLB 固相萃取柱。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，步驟4中，進(jìn)行液相色譜分析，液相色譜的條件如下: 色譜柱:菲羅門 Kinetex HILIC, 10mmX4.6mm ID2.6um ； 流動(dòng)相:乙腈+1mM乙酸銨溶液+乙酸，其中，乙腈體積為50mL，1mM乙酸銨溶液體積為49.8mL,乙酸體積為0.2mL ；
流速:0.5mL/min ； 進(jìn)樣量:3uL ； 柱溫:30°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，步驟5中，進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件為: 尚子源:ESI ； 掃描方式=ESI+ ； 檢測(cè)方式:MRM ； 裂解電壓:170V ； 霧化器壓力:45psi ； 加熱輔助氣流速:10L/min ； 輔助氣溫度:300°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種維生素B12的測(cè)定方法，其特征在于，技術(shù)參數(shù)的準(zhǔn)確度要求在添加水平在400?600ng的水平下，回收率范圍為60%?120%。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104198598SQ201410337148
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】王磊, 何健, 蔣麗 申請(qǐng)人:湯臣倍健股份有限公司