β-隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及β-隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的檢測(cè)方法，屬于分析【技術(shù)領(lǐng)域】。采用YMC?Carotenoid?C30色譜柱，流動(dòng)相為1.5％乙酸銨水/甲基叔丁基醚/甲醇＝5/25/70和1.5％乙酸銨水/甲基叔丁基醚/甲醇＝5/85/10，流速0.6mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為200～550nm，顯著分離β-隱黃質(zhì)異構(gòu)體及氧化產(chǎn)物，APCI+正離子質(zhì)譜，色譜柱流出組分進(jìn)入質(zhì)譜儀的流速為10μL/min，掃描范圍80～1000m/z，毛細(xì)管電壓2500V，干燥氣體5L，霧化氣體20psi，汽化溫度300℃，蒸汽溫度400℃，電暈電流4μA。根據(jù)樣品的洗脫順序、質(zhì)譜和光譜信息進(jìn)行β-隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的定性分析，根據(jù)峰面積進(jìn)行定量分析。該方法具有快速有效、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】β -隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的檢測(cè)方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種β -隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的檢測(cè)方法，屬于分析【技術(shù)領(lǐng)域】。

二、【背景技術(shù)】
[0002]β_隱黃質(zhì)化學(xué)名3-羥基-β_胡蘿卜素，是一種具有VA前體功能的含氧類胡蘿卜素，主要來源于高等植物、真菌、藍(lán)藻等，廣泛分布于人體血液、肺、皮膚以及口腔粘膜等組織中。β -隱黃質(zhì)具有良好的單線態(tài)氧及氧自由基清除能力，使其在抗癌、抗氧化方面的作用顯著，尤其是對(duì)吸煙引起的肺癌有獨(dú)特的療效。另外β_隱黃質(zhì)在預(yù)防心血管疾病、增強(qiáng)免疫功能等方面也具有重要作用。
[0003]β -隱黃質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有的共軛雙鍵和羥基使其在光照、加熱和其他條件下容易發(fā)生異構(gòu)化和氧化反應(yīng)，并產(chǎn)生多種順式異構(gòu)體和氧化物。β -隱黃質(zhì)全反式構(gòu)象穩(wěn)定性和生理活性最強(qiáng)，順式和氧化結(jié)構(gòu)在物化性質(zhì)和生理功能上與全反式差別較大。想要避免β -隱黃質(zhì)制備和應(yīng)用過程中受外界環(huán)境影響產(chǎn)生順式異構(gòu)體和氧化物，就需要一種準(zhǔn)確高效的定性、定量分析方法進(jìn)行檢測(cè)其可能發(fā)生的異構(gòu)和氧化物，進(jìn)而提出控制措施。
[0004]HPLC技術(shù)因?yàn)楦哽`敏度、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在類胡蘿卜素的分析測(cè)定中得到普遍應(yīng)用。C30固定相具有良好的分辨率和獨(dú)特的分離能力，適用于不同種類類胡蘿卜素的分離鑒定。然而，實(shí)際操作中由于類胡蘿卜素與其異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)和極性非常接近，很難一一分離和檢測(cè)。有報(bào)道選用甲醇和二氯甲烷或者甲醇和甲基叔丁基醚作為混合流動(dòng)相分離葉黃素和α、β-胡蘿卜素的順式異構(gòu)體，但未見有β-隱黃質(zhì)雙順式異構(gòu)體及酮類氧化物分離檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。因此，建立一種β_隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的檢測(cè)方法對(duì)β_隱黃質(zhì)的生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要意義。

三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問題
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確的β -隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的HPLC-MS測(cè)定方法，可以對(duì)β -隱黃質(zhì)異構(gòu)及氧化產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析。
[0007]技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明通過碘催化-光異構(gòu)化反應(yīng)制備得到β -隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物，應(yīng)用C30-HPLC-DAD-APC1-MS聯(lián)合技術(shù)對(duì)β -隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析，包括以下步驟:
[0009]1、β -隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的制備
[0010]將1.0mg^-隱黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并定容于25mL棕色容量瓶，置于超低溫冰箱中待用。取6份2mLi3 -隱黃質(zhì)甲醇溶液于6支試管中，氮?dú)獯蹈珊蠓謩e加入2mL正己烷和ImL碘-正己烷溶液(1.6 μ g/mL)，使碘含量為β -隱黃質(zhì)質(zhì)量的將試管放在距恒溫?fù)u床中日光燈1cm處(溫度25°C，光照強(qiáng)度ISOOlux)，分別照射I?5h后取出處理。用硫代硫酸鈉(lX103mol/L)洗滌去除多余的碘，氮?dú)獯蹈珊笥?mL甲醇復(fù)溶，經(jīng)
0.45 μ m濾膜過濾后置于超低溫冰箱中待測(cè)。
[0011]2、色譜及質(zhì)譜條件
[0012]C3O-HPLC 分析條件:色譜柱 YMC Carotenoid C30 (4.6mmX 250mm, 5 μ m), 二極管陣列檢測(cè)器，流動(dòng)相1.5%乙酸銨水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/25/70)和1.5%乙酸銨水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/85/10)進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)200?550nm，流速0.6mL/min，進(jìn)樣量 20yL，柱溫 25°C。
[0013]MS分析條件:質(zhì)譜條件為色譜柱流出組分進(jìn)入質(zhì)譜儀的流速為10 μ L/min，離子源APCI+，掃描范圍80?lOOOm/ζ，毛細(xì)管電壓2500V，干燥氣體5L，霧化氣體20psi，汽化溫度300°C，蒸汽溫度400°C，電暈電流4 μ A。
[0014]3、建立全反式β -隱黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0015]準(zhǔn)確稱取1.0mg全反式β -隱黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至50mL棕色容量瓶中，混勻，制成質(zhì)量濃度為20 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取0.0125、0.025、0.05、0.25、0.5、1.0、
1.5,2.0,2.5mL標(biāo)準(zhǔn)液置于5mL容量瓶中，用甲醇定容并混勻，制成濃度為0.05,0.1,0.2、1、2、4、6、8、10μ g/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)系列濃度進(jìn)樣3次，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、相應(yīng)吸收峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制全反式β -隱黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016]有益效果
[0017]1、本發(fā)明采用甲醇和甲基叔丁基醚作為流動(dòng)相對(duì)全反式β -隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物進(jìn)行分離，根據(jù)甲醇和甲基叔丁基醚的極性不同，通過對(duì)兩相溶劑不同比例選擇優(yōu)化、洗脫時(shí)間和流速的調(diào)整增加分離度；在流動(dòng)相中加入少量的乙酸，一方面可以改善色譜峰型，另一方面保證隱黃質(zhì)異構(gòu)及氧化產(chǎn)物質(zhì)譜的響應(yīng)信號(hào)；分離得到4種單順式異構(gòu)體、3種雙順式異構(gòu)體及2種氧化產(chǎn)物，分離效果良好。
[0018]2、本發(fā)明通過優(yōu)化的質(zhì)譜條件對(duì)碘催化異構(gòu)化樣品進(jìn)行了正離子模式的LC-APC1-MS和電子吸收光譜分析，以此確定圖中各個(gè)峰的歸屬。HPLC-APC1-MS檢測(cè)結(jié)果如圖1至圖4所示，其中包括HPLC分離圖譜、光譜特征圖、質(zhì)譜特征圖。通過最大吸收波長(zhǎng)、紫外-可見光譜特性、質(zhì)譜特性、Q值及文獻(xiàn)中相關(guān)報(bào)道對(duì)分離所得化合物進(jìn)行分析鑒定。全反式β -隱黃質(zhì)其最大吸收波長(zhǎng)為450nm,質(zhì)譜主離子峰為553.4[Μ+Η]+。β , β -胡蘿卜素-3-酮質(zhì)譜主離子峰為551.4[Μ+Η-2]+，與全反式(553[Μ+Η]+)相差兩個(gè)H，是由于β -隱黃質(zhì)左側(cè)環(huán)上的羥基變成酮基所致。5，6_環(huán)氧-β，β -胡蘿卜素-3-酮主離子峰為567[Μ+Η+16-2]+，與5，6_環(huán)氧-β-隱黃質(zhì)(質(zhì)譜離子峰為569[Μ+Η+16].)相差2個(gè)H，且質(zhì)譜碎片m/z221的存在證明β-環(huán)有環(huán)氧化的發(fā)生。
[0019]β -隱黃質(zhì)的順式異構(gòu)體與全反式異構(gòu)體相比，其電子吸收光譜發(fā)生變化，但同時(shí)遵循一定規(guī)則。首先，最大吸收波長(zhǎng)單順式異構(gòu)體相對(duì)全反式有4-6nm藍(lán)移，雙順式異構(gòu)體有10-14nm藍(lán)移；其次，順式異構(gòu)體在330?340nm之間有順式吸收，單順式異構(gòu)體吸收較強(qiáng)，雙順式異構(gòu)體吸收較小，甚至沒有吸收。除此之外，隱黃質(zhì)與胡蘿卜素有相同異戊二烯結(jié)構(gòu)的主鏈性質(zhì)，二者相應(yīng)位置異構(gòu)體洗脫順序理論上一致。因此，可以鑒定出單、雙順式異構(gòu)體。結(jié)果顯示，15-、13-、9_和9’ -順式-β-隱黃質(zhì)質(zhì)譜主離子峰均為553.4[Μ+Η]+，最大吸收波長(zhǎng)分別為446、444、446和448皿，與全反式有2_6皿藍(lán)移。其Q值和洗脫順序與文獻(xiàn)報(bào)道值相符合。13，15-雙順式、9，13-雙順式和9，9’-雙順式-β -隱黃質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為438、436和440nm，相對(duì)全反式β -隱黃質(zhì)有10_14nm藍(lán)移，順式吸收分別為0.08,0.13和0.15，符合雙順式異構(gòu)體特征。三種β -隱黃質(zhì)雙順式異構(gòu)體洗脫順序與β_胡蘿卜素雙順式異構(gòu)體洗脫順序相一致。
[0020]表1全反式β -隱黃質(zhì)異構(gòu)及氧化產(chǎn)物的鑒定
[0021]

【權(quán)利要求】
1.β -隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的檢測(cè)方法，其特征在于HPLC條件為色譜柱YMC Carotenoid C30 (4.6mmX 250mm, 5 μ m), 二極管陣列檢測(cè)器,流動(dòng)相1.5%乙酸銨水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/25/70)和1.5%乙酸銨水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/85/10)進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)200?550nm，流速0.6mL/min,進(jìn)樣量20 μ L，柱溫250C ;質(zhì)譜條件為色譜柱流出組分進(jìn)入質(zhì)譜儀的流速為10 μ L/min,離子源APCI+，掃描范圍80?lOOOm/ζ，毛細(xì)管電壓2500V，干燥氣體5L，霧化氣體20psi，汽化溫度300°C，蒸汽溫度400°C，電暈電流4μΑ。
2.權(quán)利要求1所述隱黃質(zhì)單順式、雙順式異構(gòu)體及酮類氧化產(chǎn)物的檢測(cè)方法，其特征在于在上述HPLC條件下，β，β-胡蘿卜素-3-酮、5，6-環(huán)氧-β，β-胡蘿卜素-3-酮、.13，15-雙順式-β-隱黃質(zhì)、15-順式-β-隱黃質(zhì)、13-順式-β-隱黃質(zhì)、9，13-雙順式_ β _隱黃質(zhì)、全反式_ β _隱黃質(zhì)、9,9 ’ _雙順式-β _隱黃質(zhì)、9_順式-β -隱黃質(zhì)、9’-順式-β -隱黃質(zhì)共10種β -隱黃質(zhì)全反式、異構(gòu)及氧化產(chǎn)物得到顯著分離，根據(jù)色譜、質(zhì)譜和光譜信息，對(duì)這10種化合物進(jìn)行了定性分析；建立了全反式β -隱黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=12.45Χ-4.09，R2 = 0.9995，用于β -隱黃質(zhì)異構(gòu)及氧化產(chǎn)物的定量分析，方法重現(xiàn)性好、回收率高。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104181267SQ201410352834
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】李大婧, 張鐘元, 肖亞冬, 劉春泉 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院