一種蛋白質(zhì)分子印跡聚離子液體膜電化學(xué)傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及電分析化學(xué)和蛋白質(zhì)識(shí)別傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種功能化離子液體的合成方法，及由該離子液體/羧基化多壁碳納米管/玻碳電極構(gòu)成的分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法和應(yīng)用。該分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法：以可聚合的氨基功能化離子液體為功能單體，BSA為模板蛋白，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，過(guò)硫酸銨與四甲基乙二胺構(gòu)成的氧化-還原體系為引發(fā)劑，經(jīng)聚合，在羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極表面形成分子印跡聚合物膜，再將模板蛋白洗脫，得到可特異性識(shí)別模板蛋白質(zhì)的分子印跡電化學(xué)傳感器。本發(fā)明的分子印跡電化學(xué)傳感器具有制備簡(jiǎn)單，材料成本低廉，選擇性高，生物相容性好，可用于水溶液中蛋白質(zhì)的識(shí)別和檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】一種蛋白質(zhì)分子印跡聚離子液體膜電化學(xué)傳感器

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及聚離子液體、蛋白質(zhì)印跡、分子識(shí)別及電化學(xué)傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉 及一種功能化離子液體的合成方法，及由該離子液體/羧基化多壁碳納米管/玻碳電極構(gòu) 成的蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前對(duì)蛋白質(zhì)具有選擇性的定量分析和生物傳感等技術(shù)幾乎都基于抗原-抗體 免疫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)；抗體體系不僅造價(jià)昂貴，使用條件苛刻，而且對(duì)蛋白質(zhì)識(shí)別時(shí)，結(jié)構(gòu)不穩(wěn) 定，通常只能使用一次。分子印跡技術(shù)是一種人工合成的、具有分子識(shí)別功能的新型分離技 術(shù)。合成能特異性識(shí)別模板蛋白質(zhì)的分子印跡聚合物具有非常高的應(yīng)用價(jià)值，并已經(jīng)成功 應(yīng)用于仿生傳感器、色譜填料、生物材料模擬、固相萃取、酶和抗體等領(lǐng)域。
[0003] 在分子識(shí)別過(guò)程中主要是基于氫鍵作用力、靜電作用力和幾何構(gòu)型使蛋白質(zhì)和分 子印跡聚合物（MIP)結(jié)合。為了保證有足夠的氫鍵作用力和靜電作用力，一般采取在有機(jī) 溶劑中聚合的方法。但蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型對(duì)MIP的選擇性識(shí)別能力至關(guān)重要，制備MIP時(shí) 的各種條件要求盡量類似生物環(huán)境，這就使有機(jī)溶劑的使用受到限制。因此，合成新型功能 單體，并探索更溫和的聚合條件對(duì)獲取高性能分子印跡聚合物至關(guān)重要。
[0004] 目前用于蛋白質(zhì)分子印跡的方法所用到的功能單體或者印跡材料，大多都不具有 生物相容性，還存在選擇性識(shí)別蛋白能力差，操作復(fù)雜耗時(shí)，不能重復(fù)利用等不足。
[0005] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一種利用離子液體為功能單體制備蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器 的方法。離子液體被稱為"綠色溶劑"，具有良好生物相容性、寬的電化學(xué)窗口和高導(dǎo)電性， 使其適用于制備蛋白質(zhì)分子印跡聚合物。以氨基功能化的離子液體為單體，在水溶液中聚 合后可制備出蛋白質(zhì)印跡水凝膠聚合物，并有望保持蛋白質(zhì)生物活性。碳納米管羧基化之 后，具有良好的親水性和生物相容性，可以用于電化學(xué)生物傳感器的研究。本方法制備的 蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器具有材料成本低廉、制備簡(jiǎn)單、操作方便、生物相容性好、穩(wěn) 定性好、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)生物大分子的印跡聚合物的制備提供 了重要的指導(dǎo)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的之一是制備了一種同時(shí)具有氨基和乙 烯基功能基團(tuán)的咪唑類離子液體。
[0007] 本發(fā)明的目的之二是提供了一種基于上述離子液體的能選擇性識(shí)別蛋白質(zhì)（如 牛血清蛋白）的分子印跡電化學(xué)傳感器。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)措施。
[0009] 1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸鹽離子液體，其合成方法如下：
[0010] 將3-溴丙基胺氫溴酸鹽按照固液比4. 4g:30mL溶于無(wú)水乙腈，N2保護(hù)，升溫至 55°C，然后將含有N-乙烯基咪唑的無(wú)水乙腈溶液在2h滴加完畢，然后繼續(xù)反應(yīng)12h，移除溶 齊[J，同時(shí)加二次水和甲苯洗滌，分液后水層溶于甲醇，滴加 Na2C03飽和甲醇溶液至pH為9 ; 蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)物溶于四氟硼酸鈉飽和溶液，攪拌lh，蒸發(fā)除水，甲醇離心洗滌，蒸發(fā)甲醇，得 到淺黃色的1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸鹽離子液體；
[0011] 所述無(wú)水乙腈與含有N-乙烯基咪唑的無(wú)水乙腈溶液的體積比為1:1 ;
[0012] 所述3-溴丙基胺氫溴酸鹽與N-乙烯基咪唑的質(zhì)量比為4. 4:2. 8 ;
[0013] 一種利用上述離子液體作為功能單體制備蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器的方法， 包括以下步驟：
[0014] (1)將多壁碳納米管進(jìn)行羧基化修飾得羧基化多壁碳納米管；
[0015] (2)用羧基化多壁碳納米管對(duì)玻碳電極表面進(jìn)行修飾得羧基化多壁碳納米管修飾 玻碳電極；
[0016] (3)利用步驟（2)制備的羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極、利用上述離子液體 作為功能單體制備蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器，蛋白質(zhì)優(yōu)選牛血清白蛋白。
[0017] 具體的，一種利用上述離子液體作為功能單體制備蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器 的方法，包括以下步驟：
[0018] (1)制備羧基化多壁碳納米管：
[0019] 多壁碳納米管溶于4mol · Γ1的硝酸中，加熱回流，反應(yīng)24h，待反應(yīng)結(jié)束，用乙腈 離心洗滌酸化產(chǎn)物，至PH7,再用乙醇洗滌，于25°C下烘干；
[0020] 所述多壁碳納米管與4mol · I71的硝酸的固液比為50mg:6mL ;
[0021] (2)制備羧基化多壁碳納米管修飾的玻碳電極MWCNT-C00H/CGE :
[0022] 將直徑為3mm的玻碳電極用粒徑為0. 05 μ m的氧化鋁粉在拋光布上打磨至光亮 鏡面，用二次水沖洗干凈，再依次用硝酸、無(wú)水乙醇和二次水清洗，最后用N2吹干備用；稱 取一定量步驟（1)制備的羧基化多壁碳納米管，加入到二次水中，超聲分散均勻，得羧基化 多壁碳納米管溶液，其中羧基化多壁碳納米管濃度為0. 5mg · ml/1，取6. 0 μ L羧基化多壁 碳納米管溶液滴涂于玻碳電極表面，室溫下晾干，即得羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極 (MWCNT-C00H/GCE)；
[0023] (3)制備蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器：
[0024] 480 μ L 的 Tris-HCl 緩沖溶液（0· lmol · Ι71，ρΗ7· 4)中，加入 4. 8mg 牛血清白蛋 白使其完全溶解，再依次加入〇.〇28g上述離子液體、0.002g Ν，Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺、 15 μ LlOwt %過(guò)硫酸銨-5wt %四甲基乙二胺溶液（該溶液中過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺濃度 分別為l〇wt %、5wt % )，混勻，得混合溶液，取6. 0 μ L混合溶液滴涂在MWCNT-C00H/GCE 表面，35°C下聚合成膜，依次用10% (V/V)HAc-10% (m/v)SDS溶液、Tris-HCl緩沖溶液 (0. lmol4)、二次水洗滌，晾干，即得蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器，即BSA分子印 跡電化學(xué)傳感器。
[0025] 上述蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)蛋白質(zhì)的識(shí)別過(guò)程，包括以下步驟：
[0026] 將蛋白質(zhì)（BSA)分子溶解于Tris-HCl緩沖溶液（0· lmol4)中使其濃度 為1.0mg*mL'將蛋白質(zhì)分子印跡傳感器置于10mL該BSA溶液中，攪拌孵育10min。取出 傳感器，依次用Tris-HCl緩沖溶液（0. lmol4)和二次水洗滌，除去電極表面物理 吸附的 BSA。以 l.Ommol I^KjFe^NWKjFe^Nh] (1:1)作探針，在含 0.4mol .LlCl 的 Tris-HCl(0. lmol ?L'pHTj)緩沖溶液中，采用循環(huán)伏安法分別研究識(shí)別BSA前后傳感器 的伏安行為。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：
[0028] (1)由于在玻碳電極表面直接修飾離子液體聚合物膜后，聚合物膜在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中 容易脫落，故本發(fā)明在玻碳電極表面用羧基化多壁碳納米管修飾。羧基化多壁碳納米管與 玻碳電極表面有較強(qiáng)的作用力，同時(shí)也與聚合物膜有較強(qiáng)的作用力，這樣可以保證聚合物 膜在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的穩(wěn)定性。而且，用羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極后，能提高電極的比 表面積。
[0029] (2)本發(fā)明制備的功能化離子液體無(wú)毒無(wú)污染，具有水溶性和生物相容性好的特 點(diǎn)。
[0030] (3)本發(fā)明制備分子印跡電化學(xué)傳感器所用到的溶劑為緩沖水溶液，可以在水溶 液中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的印跡與檢測(cè)。
[0031] (4)本發(fā)明制備的分子印跡電化學(xué)傳感器操作簡(jiǎn)單、快速、選擇性高、線性范圍寬。
[0032] (5)本發(fā)明制備的電化學(xué)傳感器對(duì)和蛋白質(zhì)（如牛血清白蛋白）的識(shí)別測(cè)定選擇 性好，線性范圍寬，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，結(jié)果可信。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為羧基化多壁碳納米管的傅立葉變換紅外圖譜（A)和掃描電子顯微鏡圖（B)。 圖1(A)的FT-IR光譜圖中，3400CHT 1處有寬的強(qiáng)吸收峰，為-C00H上的0-H伸縮振動(dòng)峰； 1656CHT1處為C = 0的伸縮振動(dòng)；2958CHT1處為碳納米管上sp2雜化的C = C雙鍵上的C-H 伸縮振動(dòng)。說(shuō)明經(jīng)ΗΝ03處理后，多壁碳納米管表面修飾了羧基官能團(tuán)。圖1(B)顯示當(dāng)多 壁碳納米管經(jīng)過(guò)羧基化后，變成了小段的管狀結(jié)構(gòu)。
[0034] 圖2為1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸鹽離子液體的合成路線圖。
[0035] 圖3為制備分子印跡電化學(xué)傳感器的過(guò)程示意圖。
[0036] 圖4中a為裸玻碳電極、b為羧基化多壁碳納米管修飾電極、c為BSA分子印跡聚合 物膜修飾電極洗脫前、d為BSA分子印跡傳感器識(shí)別BSA后、e為BSA分子印跡聚合物膜修 飾電極洗脫BSA后的伏安曲線。由圖可知，當(dāng)MWCNT-C00H修飾玻碳電極后，峰電流增加，說(shuō) 明碳納米管增加了電極的導(dǎo)電性。當(dāng)在電極表面形成蛋白質(zhì)（BSA)印跡聚離子液體膜后， 氧化-還原峰峰電流明顯增加；用HAc-SDS洗脫BSA后，峰電流進(jìn)一步增加（圖4中e)，表 明蛋白質(zhì)洗脫后，其在聚合物中形成的"孔穴"結(jié)構(gòu)增加了電極的導(dǎo)電性；而重新吸附蛋白 質(zhì)后，峰電流減小，說(shuō)明不導(dǎo)電的BSA重新回到分子印跡"孔穴"結(jié)構(gòu)中，阻礙了電子傳遞。
[0037] 圖5中a為裸玻碳電極、b為羧基化多壁碳納米管修飾電極、c為不加 BSA的聚離 子液體膜修飾電極洗脫前、d為吸附BSA后的非分子印跡聚合物膜修飾電極、e為洗脫后的 非分子印跡聚合物膜修飾電極的伏安曲線。由圖可知，當(dāng)MWCNT-C00H修飾玻碳電極后，電 流有所增加；當(dāng)聚離子液體膜修飾至電極表面后，氧化-還原峰的峰電流也明顯增加；但是 在洗脫和吸附過(guò)程中，氧化-還原峰的峰電流幾乎不變，說(shuō)明沒(méi)有加 BSA模板蛋白的NIP材 料，不能識(shí)別BSA分子。
[0038] 圖6為BSA分子印跡電化學(xué)傳感器與非印跡傳感器吸附BSA時(shí)的電流響應(yīng)圖。
[0039] 圖7為BSA分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)于不同濃度BSA的電流響應(yīng)情況的校準(zhǔn)曲 線。
[0040] 圖8為BSA分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)不同物質(zhì)的電流響應(yīng)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明的技術(shù)方案和有益效果而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，還應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所 講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落 于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0042] 以下實(shí)施例中所用多壁碳納米管（型號(hào)TNM1)為中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公 司生產(chǎn)，牛血清白蛋白（BSA)為上海如吉生物科技發(fā)展有限公司提供，其他原料及試劑均 為常規(guī)市售商品。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 一種羧基化多壁碳納米管，其制備方法如下：
[0045] 50mg多壁碳納米管（MWCNT)溶于6mL4mol · Γ1的硝酸中，加熱回流反應(yīng)24h。待 反應(yīng)結(jié)束，用乙腈離心洗滌酸化產(chǎn)物，至PH7,再用乙醇洗滌，于25 °C下烘干。其FT-IR光譜 如圖1⑷所示，SEM圖譜如圖1 (B)所示。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] -種羧基化多壁碳納米管修飾的玻碳電極，其制備方法如下：
[0048] 將直徑為3mm的玻碳電極用粒徑為0. 05 μ m的氧化鋁粉在拋光布上打磨至光亮 鏡面，用二次水沖洗干凈，再依次用硝酸溶液硝酸與二次水等體積混合溶液）、無(wú) 水乙醇和二次水各超聲清洗2min，最后用N 2吹干備用。稱取一定量實(shí)施例1制備的羧基 化多壁碳納米管（MWCNT-C00H)，加入到二次水中，超聲分散均勻，使MWCNT-C00H的濃度為 0. 5mg · mL'用移液器吸取6. 0 μ LMWCNT-C00H溶液滴涂于玻碳電極表面，室溫下晾干，即 得羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極（MWCNT-C00H/GCE)。
[0049] 實(shí)施例3
[0050] 1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸鹽離子液體，其合成方法如下：
[0051] 將4. 4g3-溴丙基胺氫溴酸鹽（CAS號(hào)：5003-71-4)溶于30mL無(wú)水乙腈，Ν2保護(hù)， 升溫至55°C，然后將30mL含有2. 8g Ν-乙烯基咪唑的無(wú)水乙腈溶液在2h滴加完畢，然后繼 續(xù)反應(yīng)12h，移除溶劑，同時(shí)加二次水和甲苯洗滌，分液后水層溶于甲醇，滴加 Na2C03飽和甲 醇溶液至pH為9。蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)物中加四氟硼酸鈉飽和溶液，攪拌lh，蒸發(fā)除水，甲醇離心 洗滌，蒸發(fā)甲醇，即得淺黃色1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸鹽離子液體。
[0052] 產(chǎn)物表征結(jié)果：1H NMR(D20) δ :9. 07(s，1H)，7. 75(s，1H)，7. 58(s，1H)，7. 08(m， 1H)，5· 74 (d，1H)，5· 38 (d，1H)，4· 36 (t，2H)，3· 40 (t，2H)，2· 38 (m，2H) ;m/z = 152. 12889。
[0053] 本實(shí)施例所述的1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸鹽離子液體的合成路線如圖 2所示。
[0054] 實(shí)施例4
[0055] -種加模板蛋白的分子印跡（MI)電化學(xué)傳感器，其制備方法如下：
[0056] 480 μ L 的 Tris-HCl 緩沖溶液（0· lmol · I71，ρΗ7· 4)中，加入 4. 8mg 牛血清白蛋白 (BSA)使其完全溶解。再依次加入0. 028g實(shí)施例3合成的離子液體、0. 002gN，Ν'-亞甲基雙 丙烯酰胺、15 μ LlOwt%過(guò)硫酸銨-5wt%四甲基乙二胺溶液，混勻，得混合溶液。取6. 0 μ L 上述混合溶液滴涂在實(shí)施例2制備的MWCNT-COOH/GCE電極表面，35°C下聚合成膜。依次用 10% (v/v)HAc-10% (m/v)SDS(十二烷基硫酸鈉）溶液、Tris-HCKO.lmol.L'pHTj)、： 次水洗滌，晾干，即得BSA分子印跡電化學(xué)傳感器。其制備過(guò)程模擬圖如圖3所示。
[0057] 實(shí)施例5 (對(duì)比例）
[0058] -種不加模板蛋白的分子印跡電化學(xué)傳感器，其制備方法如下：
[0059] 480 μ L 的 Tris-HCl 緩沖溶液（0· lmol .Ι^,ρΗ?· 4)中，依次加入 0· 028g 實(shí)施例 3 合成的離子液體、〇.〇〇2g N，N'_亞甲基雙丙烯酰胺、MyLlOwt%過(guò)硫酸銨-5wt%四甲基乙 二胺溶液，混勻，得混合溶液。取6. 0 μ L上述混合溶液滴涂在實(shí)施例2制備的MWCNT-C00H/ GCE電極表面，35°C下聚合成膜。依次用10% (V/V)HAc-10% (m/v)SDS(十二烷基硫酸鈉） 溶液、Tris-HCl緩沖溶液（0. lmol · Γ1，pH7. 4)、二次水洗滌，晾干，即得不加模板蛋白的分 子印跡電化學(xué)傳感器，即非分子印跡電化學(xué)傳感器。
[0060] 關(guān)于實(shí)施例4和5中，測(cè)定K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6] (1:1)的支持電解質(zhì)的pH，是 通過(guò)不同pH對(duì)分子印跡傳感器對(duì)模板蛋白質(zhì)的電流響應(yīng)曲線得到的?？疾炝?pH值為4. 0、 5. 0、6. 0、7. 0、7. 4、8. 0、8. 5的Tris-HCl緩沖溶液對(duì)傳感器電流響應(yīng)的影響。BSA的等電點(diǎn) 為4. 7,當(dāng)溶液的pH〈4. 7時(shí)，BSA和離子液體的陽(yáng)離子（IL+)都帶正電，二者之間雖然相互 排斥，但仍能有一定的結(jié)合能力，這其中最主要的是氫鍵作用力；當(dāng)ΡΗΜ. 7時(shí)，BSA帶負(fù)電， IL+帶正電，二者之間既可以形成氫鍵，也可以產(chǎn)生靜電吸引，使得結(jié)合能力逐漸增強(qiáng)。在pH 值為5. 0處的峰電流最小，是因?yàn)榭拷麭SA等電點(diǎn)處，蛋白質(zhì)變呈電中性，不易和IL+之間 產(chǎn)生強(qiáng)的靜電引力。在pH值7. 4時(shí)，電流響應(yīng)達(dá)到最大值，說(shuō)明在中性條件下，蛋白質(zhì)表現(xiàn) 出很高的活性，能夠產(chǎn)生良好的印跡效果。當(dāng)pH值繼續(xù)增大時(shí)，BSA的印跡效應(yīng)降低，這是 因?yàn)閴A性條件下降低了離子液體與BSA的靜電吸引力。因此，選用最佳pH值為7. 4的緩沖 體系，這也是與生理環(huán)境接近的pH值，能夠保證蛋白質(zhì)的多級(jí)結(jié)構(gòu)盡量不發(fā)生改變。
[0061] 關(guān)于實(shí)施例4和5中，識(shí)別BSA的孵育時(shí)間是通過(guò)不同時(shí)間對(duì) l.Ommol ?LljFdCNWKjFdCN^azl)的線性掃描伏安響應(yīng)關(guān)系曲線確定。在0? 20min范圍內(nèi)考察了孵育時(shí)間對(duì)BSA分子印跡聚合物與1. 20X10_7mol ?I^BSA識(shí)別的影響。 以分子印跡電化學(xué)傳感器結(jié)合BSA前后在l.Ommol · LljFdCNWKjFdCNh] (1:1)+0. 4mol 41(:1+0. lmol ?I^Tris-HCKpHTj)中的氧化峰的峰電流之差（ΛΙ)作為評(píng)價(jià)參數(shù)。 當(dāng)孵育時(shí)間從〇min逐漸增加時(shí)，峰電流之差Λ I逐漸增大；7min后，Λ I增大的趨勢(shì)變緩； 當(dāng)達(dá)到10min時(shí)，Λ I基本不變，說(shuō)明BSA與分子印跡聚合物的結(jié)合已趨于飽和。因此選擇 10min為最佳孵育時(shí)間。
[0062] 實(shí)施例6
[0063] 實(shí)施例4和5制得的兩種電化學(xué)傳感器對(duì)BSA的識(shí)別過(guò)程如下：
[0064] 將BSA溶解于Tris-HCl緩沖溶液（0· lmol · ΙΛ ρΗ7· 4)中，使其濃度為 1. Omg 。將實(shí)施例4和5的電化學(xué)傳感器分別置于10mL該BSA溶液中，攪拌孵育10min。 取出傳感器，依次用Tris-HCl緩沖溶液（0. lmol4)和二次水洗滌，除去電極表面 物理吸附的BSA。以 L Ommol ?LljFe^NWKjFe^Nh] (1:1)作探針，在含(λ 4mol .LlCl 的Tris-HCl (0. lmol ·Ι^，ρΗ7. 4)緩沖溶液中，采用循環(huán)伏安法分別研究識(shí)別BSA前后傳感 器的伏安行為。
[0065] 實(shí)施例7
[0066] 如圖4所示，將各電化學(xué)傳感器在-0. 2?0. 6V電位范圍內(nèi)對(duì) l.Ommol ?LljFdCN^/KjFdCNh] (1:1)進(jìn)行循環(huán)伏安（CV)掃描，掃描速度為0. lV·^， 支持電解質(zhì)為〇. 4mol ?Ι^Κα+Ο. lmol ?PTris-HCl緩沖溶液（pH 7. 4)。圖4中，a為裸玻 碳電極（實(shí)施例中用到的直徑為3mm的玻碳電極）、b為羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極 (實(shí)施例2制備的）、c為BSA分子印跡聚合物膜修飾電極洗脫前（實(shí)施例4中間產(chǎn)物）、d 為分子印跡傳感器識(shí)別BSA后（實(shí)施例6中孵育后）、e為印跡聚合物膜修飾電極洗脫BSA 后（實(shí)施例4的終產(chǎn)物）的伏安曲線。由圖可知，當(dāng)羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極后， 峰電流有所增加，說(shuō)明碳納米管增加了電子傳導(dǎo)能力。當(dāng)在電極表面形成BSA印跡聚離子 液體膜后，氧化-還原峰的峰電流顯著增加；用10% (v/v)HAc-10% (m/v)SDS (十二烷基硫 酸鈉）溶液洗脫BSA后，峰電流進(jìn)一步增加（圖4中e)，表明蛋白質(zhì)洗脫后，其在聚合物形 成的孔穴結(jié)構(gòu)增加了膜的導(dǎo)電性；而重新結(jié)合BSA后，峰電流減小，說(shuō)明不導(dǎo)電的BSA重新 回到印跡"孔穴"結(jié)構(gòu)中，阻礙了電子傳遞。
[0067] 如圖5所示的各電化學(xué)傳感器對(duì)1. Ommol ?LljFdCNWKjFdCNh] (1:1)的循 環(huán)伏安曲線，實(shí)驗(yàn)條件同圖4。其中，a為裸玻碳電極（實(shí)施例中用到的直徑為3mm的玻碳 電極）、b為羧基化多壁碳納米管修飾的玻碳電極（實(shí)施例2制備的）；c為聚離子液體膜 修飾電極（實(shí)施例5洗脫前）；d為非分子印跡電化學(xué)傳感器吸附BSA后（實(shí)施例6中孵育 后）的電極；e為洗脫后的聚合物膜修飾電極（實(shí)施例5洗脫后）。由圖可知，當(dāng)羧基化多 壁碳納米管飾玻碳電極后，電流有所增力P ;當(dāng)聚離子液體膜修飾至電極表面后，氧化-還 原峰的峰電流顯著增加；但是在洗脫和吸附過(guò)程中，氧化-還原峰的峰電流幾乎不變，說(shuō)明 沒(méi)加 BSA模板蛋白的聚離子液體膜不能識(shí)別BSA分子。由伏安曲線的變化規(guī)律可以推斷， 1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸鹽離子液體作為BSA的印跡單體，制成的分子印跡聚合 物膜具有一定的分子識(shí)別能力。
[0068] 圖6為實(shí)施例4制備的印跡電化學(xué)傳感器與實(shí)施例5制備的非分子印跡電化學(xué)傳 感器對(duì)1. Omg · ml^BSA的電流響應(yīng)變化圖，分子印跡電化學(xué)傳感器的電流變化明顯大于非 分子印跡電化學(xué)傳感器，表現(xiàn)出明顯的印跡效應(yīng)。
[0069] 實(shí)施例8
[0070] 用微分脈沖伏安法考察了實(shí)施例4制備的分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)于不同 濃度BSA的電流響應(yīng)情況（具體操作同實(shí)施例6)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)BSA的濃度在1. 50X ΚΓ9? 1.50Xl(T6m〇l七1范圍內(nèi)，電流響應(yīng)值ΛΙ與BSA濃度成良好的線性關(guān)系，如圖7所示，其 中內(nèi)插圖為低濃度區(qū)的校準(zhǔn)曲線。線性方程為：ΛΙ(μΑ) =6.85(:(1111101^1^)+0.4500^ =0· 9998)，檢出限為 3. 91 X lO'mol · Γ1 (S/N = 3)。
[0071] 實(shí)施例9
[0072] 抗干擾性能是衡量電化學(xué)傳感器的實(shí)用性的重要指標(biāo)之一。本發(fā)明選用人血清蛋 白（HSA，第五組分）、馬骨豁肌肌紅蛋白（Myo)、牛血紅蛋白（BHb)、細(xì)胞色素 c(cyt c)、雞蛋 白蛋白（Ova)等蛋白分子和抗壞血酸（Ascorbic Acid)、甘氨酸（Gly)、L-組氨酸（L-His)、 L_半胱氨酸（L-Cys)等生物小分子為干擾物，考查了實(shí)施例4制備的BSA分子印跡電化學(xué) 傳感器選擇性識(shí)別BSA的能力。
[0073] 將BSA以及上述九種干擾物質(zhì)分別溶解于Tris-HCl緩沖溶液（0. lmol · ΙΛ ρΗ7. 4)中，使各物質(zhì)的濃度均控制為0. lmg · πι?Λ孵育時(shí)間均為10min。圖8為BSA分子 印跡電化學(xué)傳感器對(duì)不同物質(zhì)的電流響應(yīng)情況（具體實(shí)驗(yàn)操作同實(shí)施例6)。人血清蛋白 與牛血清蛋白的結(jié)構(gòu)相似，分子量相當(dāng)，因此，分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)HSA的響應(yīng)電流也 較大；馬骨骼肌肌紅蛋白與牛血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與牛血清蛋白不同，等電點(diǎn)和分子量的大小 都不同，由圖可知其電流響應(yīng)值也較??；雞蛋白蛋白的等電點(diǎn)為4. 7,細(xì)胞色素 c的等電點(diǎn) 為4. 5,與牛血清蛋白的等電點(diǎn)相當(dāng)，但是二者分子量要小于牛血清蛋白，其在BSA分子印 跡聚合物上的結(jié)合效果不明顯；抗壞血酸、甘氨酸、L-組氨酸和L-半胱氨酸等生物小分子 在BSA分子印跡電化學(xué)傳感器上的電流響應(yīng)極小。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，BSA分子印跡電化學(xué) 傳感器對(duì)BSA有較強(qiáng)的選擇性識(shí)別能力。
[0074] 實(shí)施例10
[0075] BSA分子印跡電化學(xué)傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性測(cè)試如下：
[0076] 以同一傳感器（實(shí)施例4所制備）連續(xù)測(cè)定1. 50 X 10_6mol ?I^BSA溶液5次（實(shí) 驗(yàn)方法同實(shí)施例6)，其吸附電流響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)為3. 46%，具有較好的重現(xiàn) 性。將10% (v/V)HAc-10% (m/v)SDS(十二烷基硫酸鈉）溶液酸洗過(guò)后的傳感器放在4°C 的冰箱中，一周后，用其識(shí)別同濃度的BSA溶液，電流響應(yīng)值降低8. 65%，具有良好的穩(wěn)定 性。
【權(quán)利要求】
1. 1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸鹽離子液體，其合成方法如下： 將3-溴丙基胺氫溴酸鹽按照固液比4.4 g:30 mL溶于無(wú)水乙腈，N2保護(hù)，升溫至55°C， 然后將含有N-乙烯基咪唑的無(wú)水乙腈溶液在2 h滴加完畢，然后繼續(xù)反應(yīng)12 h，移除溶劑， 同時(shí)加二次水和甲苯洗滌，分液后水層溶于甲醇，滴加 Na2C03飽和甲醇溶液至pH為9 ;蒸發(fā) 溶劑，產(chǎn)物溶于四氟硼酸鈉飽和溶液，攪拌1 h，蒸發(fā)除水，甲醇離心洗滌，蒸發(fā)甲醇，得到淺 黃色的1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸鹽離子液體； 所述無(wú)水乙腈與含有N-乙烯基咪唑的無(wú)水乙腈溶液的體積比為1 : 1; 所述3-溴丙基胺氫溴酸鹽與N-乙烯基咪唑的質(zhì)量比為4.4 : 2.8。
2. -種利用權(quán)利要求1所述的離子液體作為功能單體制備蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳 感器的方法，包括以下步驟： (1) 將多壁碳納米管進(jìn)行羧基化修飾得羧基化多壁碳納米管MWCNT-COOH ; (2) 用羧基化多壁碳納米管對(duì)玻碳電極進(jìn)行表面修飾得羧基化多壁碳納米管修飾玻碳 電極； (3) 利用步驟（2)制備的羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極、利用權(quán)利要求1所述的離 子液體作為功能單體制備蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白。
4. 一種利用權(quán)利要求1所述的離子液體作為功能單體制備蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳 感器的方法，包括以下步驟： (1) 制備羧基化多壁碳納米管： 多壁碳納米管溶于4 mol· Γ1的硝酸中，加熱回流，反應(yīng)24 h，待反應(yīng)結(jié)束，用乙腈離 心洗滌酸化產(chǎn)物，至pH 7,再用乙醇洗滌，于25°C下烘干； 所述多壁碳納米管與4 mol · I71的硝酸的固液比為50 mg : 6 mL ; (2) 制備羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極MWCNT-COOH /CGE : 將直徑為3 mm的玻碳電極用粒徑為0. 05 μ m的氧化鋁粉在拋光布上打磨至光亮鏡 面，用二次水沖洗干凈，再依次用硝酸、無(wú)水乙醇和二次水清洗，最后用N2吹干備用；稱取 一定量步驟（1)制備的羧基化多壁碳納米管，加入到二次水中，超聲分散均勻得羧基化多 壁碳納米管溶液，其中羧基化多壁碳納米管濃度為〇. 5 mg · ml/1，取6. 0 μ L羧基化多壁 碳納米管溶液滴涂于玻碳電極表面，室溫下晾干，即得羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極 MWCNT-COOH /GCE ； (3) 制備蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器： 480. L的0. 1 mol .L'pH 7. 4 Tris-HCl緩沖溶液中，加入4. 8 mg牛血清白蛋白使 其完全溶解，再依次加入〇. 028 g權(quán)利要求1所述的離子液體、0. 002 g Ν，Ν' -亞甲基雙丙 烯酰胺、15 μ L 10wt%過(guò)硫酸銨-5wt%四甲基乙二胺溶液，混勻得混合溶液，取6. 0 μ L混 合溶液滴涂在MWCNT-COOH /GCE表面，35 °C下聚合成膜，洗脫牛血清白蛋白、晾干，得蛋白質(zhì) 分子印跡電化學(xué)傳感器。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述洗脫牛血清白蛋白的步驟為依次用 10v/v% HAc-10m/v% SDS 溶液、0· 1 mol · Γ1 的 pH 7. 4 Tris-HCl 緩沖溶液、二次水洗滌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的方法制備的蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器在定性或 者定量檢測(cè)牛血清白蛋白中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N27/333GK104142361SQ201410378151
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】李春涯, 韓苗, 王炎英 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)