一種檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光光譜分析法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬分析化學領(lǐng)域，具體地說是一種檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光光譜分析法。

背景技術(shù)：
：熒光探針作為一類重要的分析檢測技術(shù)，被廣泛應用。尤其是基于重要金屬離子在環(huán)境科學和生命科學研究中的作用，設(shè)計、合成結(jié)構(gòu)新穎，具備更優(yōu)異選擇性和靈敏度，以特定金屬離子和陰離子為識別測定對象的熒光探針分子具有研究意義和應用價值。鋅是繼鐵之后人體內(nèi)含量最豐富的過渡金屬離子，是許多生物過程如大腦功能和病理學、基因轉(zhuǎn)錄、免疫功能和哺乳動物繁殖中的重要輔助因子。鋅還參與病理過程，如阿爾茨海默氏癥、癲癇、缺血性中風和嬰兒腹瀉等。盡管大多數(shù)生物組織中鋅離子或是被緊密地綁定于蛋白、或游離、或螯合等多種形態(tài)存在。熒光傳感器的主要目標是對出現(xiàn)在人體各種組織中，包括大腦、腸道、胰腺和視網(wǎng)膜的鋅離子的檢測。到目前為止，對鋅離子的熒光傳感器已經(jīng)成功應用在活體細胞、海馬切片的鋅離子熒光成像。因此，研制高選擇性、高靈敏度檢測鋅離子的傳感器具有研究意義。陰離子在環(huán)境和生物體系中成都著重要作用，研制測試成本低廉、樣品處理簡單、測定方法快捷、性能優(yōu)越的陰離子熒光探針具有開發(fā)價值。熒光光譜法由于操作簡單，無需昂貴儀器設(shè)備，更具應用價值。但是由于有些顯色劑過程需要經(jīng)過萃取、分離等復雜的預處理才能用于檢測，關(guān)鍵的是檢測的靈敏度和選擇性不能滿足越來越高的需求。大多數(shù)的熒光探針只能用于金屬離子的檢測，能同時檢測特定金屬離子和陰離子的熒光試劑為數(shù)很少。香豆素及其衍生物在許多領(lǐng)域有著廣泛的應用。它不僅具有生物活性，而且發(fā)光量子產(chǎn)率高、Stokes（斯托克斯）位移大、光化學穩(wěn)定，被廣泛用作激光染料，非線性發(fā)色團、熒光增白劑及熒光標記、分子探針等。香豆素衍生物的另一個特性是其光物理化學性質(zhì)易于改造，通過在香豆素環(huán)上不同位置引入不同取代基，能夠產(chǎn)生不同光學性能。香豆素及其衍生物可作為構(gòu)建熒光探針的優(yōu)秀熒光基團。文獻報道的一種基于7-二乙氨基-3-醛基香豆素基團的熒光探針，對Cu2+具有較好的選擇性識別作用；文獻報道的一種基于7-二乙氨基-3-醛基香豆素基團的熒光探針，對CN-具有較好的選擇性識別作用，通過肉眼可直接觀察到顏色的變化，且該探針對CN-的檢測限可低至3.0μmol·L-1；文獻報道的一種香豆素衍生物熒光探針可用于水溶液中定量檢測亞硫酸根離子。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：本發(fā)明的目的在于研究一種能高靈敏、高選擇的檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光光譜分析新方法。本發(fā)明的目的通過發(fā)明人研制合成的新的熒光試劑，采用增強熒光光譜強度對Zn2+、F-或AcO-進行熒光光譜分析。本發(fā)明一種檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光光譜分析法，是用化學名稱為1,5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲的化合物，簡寫為s3，作為熒光法用于檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光試劑；具體方法是（1）試劑s3在DMF（N,N-二甲基甲酰胺）/H2O（2/3，v/v）溶液中作為熒光檢測微量Zn2+的試劑，測定Zn2+時，以360nm為熒光激發(fā)波長，測定454nm處的熒光強度增強，在Zn2+一定濃度范圍內(nèi)，熒光強度與Zn2+濃度成線性關(guān)系，用熒光法測定Zn2+；（2）試劑s3在DMF溶劑中作為熒光法檢測微量F-或AcO-的試劑，在測定F-或AcO-時，以400nm為熒光激發(fā)波長，測定480nm處的熒光強度增強，在F-或AcO-一定濃度范圍內(nèi)，熒光強度與F-或AcO-濃度成線性關(guān)系，用熒光法測定F-或AcO-。上述的一種檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光光譜分析法是（1）測定Zn2+時其它共存金屬離子：Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+,Sr2+，Hg2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Cd2+，Pb2+，Ag+，Al3+，F(xiàn)e3+，Cr3+之一，在濃度與Zn2+濃度相當時，除Hg2+，Cu2+，F(xiàn)e3+離子有共存影響外，其它實驗金屬離子不干擾Zn2+的測定；（2）測定F-時，其它共存陰離子：Cl-，Br-，I-，HSO4-，AcO-，NO3-，ClO4-，PF6-，H2PO4-，PF6-之一，在濃度與F-濃度相當時，不干擾F-的測定；（3）測定AcO-時，其它共存陰離子：F-，Cl-，Br-，I-，HSO4-，NO3-，ClO4-，PF6-，H2PO4-，PF6-之一，在濃度與AcO-濃度相當時，除F-外，其它共存離子不干擾AcO-的測定。上述的一種檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光光譜分析法是（1）檢測Zn2+時，檢測的濃度線性范圍為1.0×10-7～2.2×10-5mol·L-1，檢測限低至10-8mol·L-1；檢測F-或AcO-時，檢測的濃度線性范圍均為1.0×10-7～1.1×10-5，檢測限均低至10-8mol·L-1。上述的一種檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光光譜分析法，是所述試劑s3化學結(jié)構(gòu)式為：s3分子式：C21H14N4O7分子量：434.09熔點：大于300℃溶解性：微溶于氯仿、二甲亞砜、N,N-二甲基甲酰胺等，不溶于乙醇。光譜性質(zhì)：在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液與水的混合溶劑（v/v，2/3）中的熒光激發(fā)波長是310nm，發(fā)射波長是454nm，紫外吸收波長是310nm。上述的一種檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光光譜分析法，是所述試劑s3的制備方法為以7-羥基香豆素為原料，以二氯甲烷為溶劑，用乙酸酐對7-羥基香豆素中7-位的羥基進行保護得到7-乙酰氧基香豆素后，以三氟乙酸為催化劑和溶劑，與六次甲基四胺反應，合成得到中間體8-甲?；?7-羥基香豆素；再由中間體8-甲?；?7-羥基香豆素與碳酰肼在乙醇溶液中反應合成得到對稱構(gòu)型的香豆素熒光試劑s3：1,5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲，合成路線如下：上述的一種檢測微量Zn2+、F-或AcO-的熒光光譜分析法，是熒光試劑s3合成工藝條件為：（1）7-乙酰氧基香豆素的合成N2保護下，三口燒瓶中加入7-羥基香豆素，二氯甲烷，乙酸酐，吡啶，摩爾比按7-羥基香豆素:乙酸酐=1:2~2.5，室溫攪拌反應，濾液減壓蒸餾除去溶劑，用水溶解后用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，柱層析純化制得7-乙酰氧基香豆素：反應溫度：室溫反應時間：12h反應溶劑：二氯甲烷洗脫劑：氯仿（2）中間體8-甲?；?7-羥基香豆素的合成N2保護的冰浴下，三口燒瓶中加入7-乙酰氧基香豆素，三氟乙酸，攪拌，待溫度降至0℃時，加入六次甲基四胺，摩爾比按7-乙酰氧基香豆素:六次甲基四胺=1:1.5~1.8，回流，減壓蒸餾除去溶劑，加入水升溫至60℃攪拌，過濾，濾液用氯仿萃取，飽和食鹽水洗滌，干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑，將所有沉淀部分柱層析純化得到中間體8-甲酰-7-羥基香豆素：反應溫度：回流反應時間：8h反應溶劑：三氟乙酸洗脫劑：氯仿/甲醇（v/v=100/1）（3）1,5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲N2保護下，三口燒瓶中加入8-甲酰-7-羥基香豆素，無水乙醇，碳酰肼，摩爾比按8-甲酰-7-羥基香豆素:碳酰肼=1:0.4~0.6，回流，過濾，用氯仿和甲醇重結(jié)晶得到乳白色固體1,5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲：反應溫度：回流反應時間：5h反應溶劑：乙醇本發(fā)明合成的試劑s3在與Zn2+、F-或AcO-作用時能使試劑s3熒光強度增強，在一定濃度范圍內(nèi)熒光強度與濃度成正比，用作Zn2+、F-或AcO-的定量測定。本發(fā)明對Zn2+、F-或AcO-的檢測限同樣低至10-8mol·L-1，反應相當靈敏。本發(fā)明操作簡單、分析準確度高，能在水溶性或非水介質(zhì)條件下測試等優(yōu)點。本發(fā)明合成的熒光試劑s3的結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振波譜、質(zhì)譜和紅外光譜進行了表征。結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)列于表1。附圖說明：圖1試劑s3的DMF/H2O溶液在不同金屬離子存在下的熒光光譜。濃度為1.00×10-5mol·L-1試劑s3的DMF/H2O（2/3，v/v）溶液，分別不加金屬離子或加入2.00×10-4mol·L-1金屬離子Zn2+，Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+,Sr2+，Hg2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Cd2+，Pb2+，Ag+，Al3+，F(xiàn)e3+，Cr3+后的熒光光譜。Zn2+的加入使s3在454nm處的熒光強度增強。而其他上述實驗金屬離子的加入，除Cd2+略有增加外，幾乎不會改變s3的熒光強度。測試的激發(fā)波長為360nm。圖2共存金屬離子對試劑s3檢測Zn2+的熒光強度影響。在濃度為1.00×10-5mol·L-1的s3的DMF/H2O（2/3，v/v）溶液中，加入2.00×10-4mol·L-1的Zn2+后測定s3在波長為454nm處的熒光強度值。再分別向s3-Zn2+混合溶液中加入等量的其他金屬離子：Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+,Sr2+，Hg2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Cd2+，Pb2+，Ag+，Al3+，F(xiàn)e3+，Cr3+后的熒光強度值的變化。黑色條表示在s3溶液中分別加入不同金屬離子的熒光強度。紅色條表示在s3-Zn2+混合溶液再分別加入上述其他共存金屬離子后在454nm處的熒光強度值的變化。表明s3檢測Zn2+的熒光強度除受到Hg2+，Cu2+，F(xiàn)e3+離子共存的影響外，其它實驗金屬離子沒有引起s3-Zn2+體系熒光強度的變化。測試的激發(fā)波長為360nm，熒光發(fā)射波長為454nm。圖3不同濃度的Zn2+對試劑s3的熒光滴定光譜圖。在濃度為1.00×10-5mol·L-1試劑s3的DMF/H2O（2/3，v/v）溶液中分別加入不同濃度Zn2+到s3溶液中，隨著Zn2+的加入，分別測得的熒光光譜。在454nm處的發(fā)射峰逐漸升高。測試的激發(fā)波長為360nm。圖4試劑s3的熒光光譜法檢測Zn2+的校準曲線?？v坐標為發(fā)射波長為454nm處的熒光強度值，橫坐標為Zn2+的濃度。激發(fā)波長為360nm。Zn2+響應的濃度線性范圍為1.0×10-7～2.2×10-5mol·L-1。圖5試劑s3的DMF溶液在不同陰離子存在下的熒光光譜。濃度為1.00×10-5mol·L-1試劑s3的DMF溶液，分別不加陰離子或加入2.00×10-4mol·L-1陰離子F-，Cl-，Br-，I-，HSO4-，AcO-，NO3-，ClO4-，PF6-，H2PO4-后的熒光光譜。F-或AcO-的加入使s3在480nm處的熒光顯著增強。而其他上述實驗陰離子的加入幾乎不會改變s3的熒光強度。最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為400nm和480nm。圖6共存陰離子對試劑s3熒光法檢測F-的影響。在濃度為1.00×10-5mol·L-1試劑s3的DMF溶液中，加入2.00×10-4mol·L-1的F-后熒光顯著增強。再分別向s3-F-混合溶液中加入同等量的其他陰離子Cl-，Br-，I-，HSO4-，AcO-，NO3-，ClO4-，PF6-，H2PO4-后的熒光強度變化。黑色條表示在s3溶液中分別加入不同陰離子的熒光強度。紅色條表示在s3-F-混合溶液中分別加入上述其他陰離子共存后的熒光強度變化。表明s3檢測F-的熒光強度不受上述其他陰離子包括AcO-共存的影響。最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為400nm和480nm。圖7共存陰離子對試劑s3熒光法檢測AcO-的影響。在濃度為1.00×10-5mol·L-1試劑s3的DMF溶液中，加入2.00×10-4mol·L-1的AcO-后熒光顯著增強。再分別向s3-AcO-混合溶液中加入同等量的其他陰離子F-，Cl-，Br-，I-，HSO4-，NO3-，ClO4-，PF6-，H2PO4-后的熒光強度變化。黑色條表示在s3溶液中分別加入不同陰離子的熒光強度。紅色條表示在s3-AcO-混合溶液中分別加入上述其他陰離子共存后的熒光強度變化。表明熒光試劑s3檢測AcO-的熒光強度，除受到F-的干擾外，不受上述其他陰離子的影響。最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為400nm和480nm。圖8不同濃度的F-對s3的熒光法滴定光譜圖。在濃度為1.00×10-5mol·L-1s3的DMF溶液中分別加入不同濃度F-到s3溶液中，隨著F-的加入，分別測得的熒光光譜。在480nm處的發(fā)射峰逐漸升高。測試的激發(fā)波長為400nm。圖9熒光光譜法用s3檢測F-的校準曲線?？v坐標為發(fā)射波長為480nm處的熒光強度，橫坐標為F-的濃度。激發(fā)波長為400nm。線性范圍為1.0×10-7～1.1×10-5mol·L-1。圖10不同濃度的AcO-對s3的熒光法滴定光譜圖。在濃度為1.00×10-5mol·L-1s3的DMF溶液中分別加入不同濃度AcO-到s3溶液中，隨著AcO-的加入，分別測得的熒光光譜曲線。在480nm處的發(fā)射峰逐漸升高。測試的激發(fā)波長為400nm。圖11熒光光譜法用s3檢測AcO-的校準曲線?？v坐標為發(fā)射波長為480nm處的熒光強度，橫坐標為AcO-的濃度。激發(fā)波長為400nm。AcO-響應的濃度線性范圍為1.0×10-7~1.1×10-5mol·L-1。具體實施方式實施例一：本發(fā)明分析方法中各試劑的配制方法是：（1）試劑s3溶液的配制：稱取44mg的s3，用DMF溶解，配制成100mL溶液，濃度為1.00×10-3mol·L-1；（2）Zn2+標準溶液：稱取59.5mg分析純Zn(NO3)2，用二次蒸餾水溶解，并配制成100mL溶液，Zn2+的濃度為2.00×10-3mol·L-1；根據(jù)需要用二次蒸餾水逐級稀釋到適宜的濃度；其它共存金屬離子溶液的配制相同。（3）AcO-，F(xiàn)-儲備液(2.00×10-3mol×L-1)：分別稱取60.3mg，52.2mg四丁基醋酸銨，四丁基氟化銨用DMSO溶解，配制成100mL溶液。其他陰離子的配制相同。本發(fā)明所用熒光分光光度計型號為CaryEclipse熒光分光光度計，美國VARIAN公司生產(chǎn)。本發(fā)明方法中的熒光試劑s3，可作為微量Zn2+、F-或AcO-離子的熒光檢測試劑。具有檢測性能優(yōu)越、檢測的穩(wěn)定性好、背景干擾小、選擇性高、檢測限低、不需要分離、能在水溶性或非水介質(zhì)條件下測試等優(yōu)點。操作及控制方法簡便，性能獨特。實施例二：（1）對金屬離子檢測在10.0mL容量瓶中加入試劑s3的DMF儲備液（1.00×10-4mol·L-1，1mL），金屬離子Zn2+（2.00×10-3mol·L-1，1mL），用DMF/H2O（2/3，v/v）溶液稀釋至刻度，搖勻進行熒光光譜測定。設(shè)置熒光激發(fā)波長為360nm，在1cm的比色皿中加入約3ml的試劑s3（1.00×10-5mol·L-1）的DMF/H2O（2/3，v/v）溶液進行熒光光譜測試，試劑s3在454nm波長處有弱熒光發(fā)射，在紫外燈下基本觀察不到熒光。加入Zn2+（2.00×10-4mol·L-1）后，試劑s3溶液的在454nm處的熒光強度顯著增強（增加6.7倍），相同條件下，在試劑s3溶液中分別加入Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+,Sr2+，Hg2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Ag+，Pb2+，Cd2+，Al3+，Cr3+，F(xiàn)e3+金屬離子后，除Cd2+略有增加外，幾乎不會改變試劑s3的熒光光譜及強度。試劑s3僅對Zn2+有選擇性熒光檢測響應性能，選擇波長為454nm波長處的熒光強度值進行定量測定（附圖1）。與上述熒光法相同測試條件下，試劑s3檢測Zn2+在454nm波長處的熒光值在上述其他金屬離子分別作為共存離子存在于試劑s3-Zn2+混合溶液中，當共存金屬離子濃度與測試的Zn2+離子相當時試劑s3檢測Zn2+的熒光強度除受到Hg2+，Cu2+，F(xiàn)e3+離子共存的影響外，其它金屬離子均不影響試劑s3對Zn2+的熒光測定（附圖2）。在上述熒光測試條件下，分別測定Zn2+濃度改變與試劑s3的熒光光譜變化，獲得熒光滴定光譜曲線（附圖3）及校準曲線(附圖4)。由校準曲線的斜率和測定10次空白值的標準偏差，測定并計算得到試劑s3熒光法檢測Zn2+的濃度線性范圍和檢出限列于表2。（2）對陰離子檢測在10.0mL容量瓶中加入試劑s3的DMF儲備液(1.00×10-4mol·L-1，1mL)，陰離子F-或AcO-（2.00×10-3mol·L-1，1mL）。用DMF溶液稀釋至刻度，搖勻，移入1cm的石英比色皿進行熒光光譜測定。試劑s3溶液熒光光譜測定的激發(fā)波長為400nm。所用試劑、試驗用水及熒光分光光度計型號及制造廠家均同上。在DMF溶液中，試劑s3（1.00×10-5mol·L-1）本身具有很弱的熒光發(fā)射，在紫外燈下基本觀察不到熒光。分別加入F-或AcO-（2.00×10-4mol·L-1）后使試劑s3溶液在480nm處的熒光顯著增強（F-增強85%，AcO-增強70%），除F-、AcO-的加入有顯著的熒光增強外，其他實驗陰離子Cl-，Br-，I-，HSO4-，NO3-，ClO4-，PF6-，H2PO4-對試劑s3溶液均無明顯的信號響應，表明試劑s3僅對F-或AcO-有選擇性熒光增強檢測響應性能（附圖5）。在上述熒光法測試條件下，試劑s3檢測F-、AcO-的熒光強度在上述陰離子分別作為共存離子存在于試劑s3-F-混合溶液中，當共存離子濃度與測試的F-離子相當時，包括AcO-在內(nèi)的上述共存離子對試劑s3檢測F-的熒光強度影響的相對偏差在3%以內(nèi)，不干擾測定（附圖6）。在上述熒光法測試條件下，試劑s3檢測AcO-的熒光強度在上述陰離子分別作為共存離子存在于試劑s3-AcO-混合溶液中，當共存離子濃度與測試的AcO-離子相當時，除F-外，其他上述共存陰離子對試劑s3檢測AcO-的熒光強度影響的相對偏差在3%以內(nèi)，不干擾測定（附圖7）。在DMF溶液中，以400/480nm為熒光激發(fā)和發(fā)射波長，分別測定F-、AcO-濃度改變時相應的試劑s3溶液的熒光強度變化（附圖8、10），獲得校準曲線（附圖9、11）。分別由校正曲線的斜率和測定10次空白值的標準偏差，測定并計算得到試劑s3檢測特定離子的濃度線性范圍和檢出限列于表3。實施例二：試劑s3的制備合成方法（1）7-乙酸酐香豆素的合成N2保護下，在250mL的圓底燒瓶中，加入7-羥基香豆素（9.3g,57.3mmol），二氯甲烷120mL，攪拌，再加入乙酸酐（11.7g，114.6mmol），吡啶7-8滴，室溫下反應12h，反應完成后先減壓蒸餾除去溶劑，用水溶解后用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑，粗產(chǎn)品柱層析分離（洗脫劑：氯仿）得白色產(chǎn)品7-乙酸酐香豆素11.16g，產(chǎn)率95.4%。（2）中間體原料7-羥基-8-醛基香豆素的合成N2保護下，冰浴下，在250mL的圓底燒瓶中，加入7-乙酸酐香豆素（15g，73.51mmol），三氟乙酸100mL，攪拌，待溫度降至0℃時，再加入六次甲基四胺（15g，106.26mmol），冰浴下反應1h，將反應溫度逐漸升至室溫，再回流攪拌反應8h，減壓蒸餾除去溶劑，在剩余溶液中加入水150mL，將混合物升至60℃攪拌30min，過濾，濾液用氯仿萃取，飽和食鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑，沉淀部分合并，柱層析分離（洗脫劑：氯仿/甲醇，v/v，100/1）得乳白色產(chǎn)品7-羥基-8-醛基香豆素2.61g，產(chǎn)率18.6%。（3）熒光試劑s3即1,5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲的合成N2保護下，在250ml三口燒瓶中，加入7-羥基-8-醛基香豆素（600mg，3.16mmol）和70mL無水乙醇，攪拌，升溫待其溶解后，降至室溫。將碳酰肼（142mg，1.58mmol）溶于20mL無水乙醇后逐滴加入，加熱回流反應5h。反應完成后過濾，用氯仿甲醇重結(jié)晶，得到乳白色目標產(chǎn)物470mg，產(chǎn)率為68.7%。m.p.＞300℃;1HNMR(CDCl3,400MHz),δ(ppm):4.349(s,1H),6.282(d,1H,J=9.6Hz),6.881(d,1H,J=8.8Hz),7.559(d,1H,J=8.8Hz),7.969(d,1H,J=9.2Hz),8.822(s,1H),11.391(s,1H);ESI-MS:m/z457.0[M+Na]+。