一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用懸浮細(xì)胞MO7e評(píng)價(jià)促血小板生成素受體（TPO受體）激動(dòng)劑體外活性的分析方法。該方法通過(guò)評(píng)價(jià)樣品對(duì)細(xì)胞的促增殖發(fā)育能力來(lái)反映樣品與TPO受體結(jié)合活性以及促血小板生成活性。本發(fā)明一方面解決了現(xiàn)有技術(shù)中BaF3-hMpl細(xì)胞系構(gòu)建難度大耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定的問(wèn)題；另一方面解決了懸浮細(xì)胞MTT法顯色時(shí)間長(zhǎng)并且產(chǎn)生不溶性甲臜產(chǎn)物，導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性差、準(zhǔn)確度低的問(wèn)題；同時(shí)采用優(yōu)于存活率評(píng)價(jià)指標(biāo)的四參數(shù)數(shù)據(jù)處理方法，可直接定義樣品活性值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)醫(yī)藥生物工程與【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種新穎的利用懸浮細(xì)胞M07e評(píng)價(jià)促血小板生成素受體(ΤΡ0受體)激動(dòng)劑體外活性的分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002]促血小板生成素受體(ΤΡ0受體)激動(dòng)劑特異性與TPO受體C-Mpl結(jié)合，促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖發(fā)育，進(jìn)而產(chǎn)生血小板，通常用于治療化療引起的血小板減少或血小板減少性紫癜。此類(lèi)生物制品包括重組人血小板生成素(rhTPO)、聚乙二醇修飾的重組人巨核細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育因子(PEG-rhMG-DF)、TPO肽類(lèi)模擬物，另外還有TPO非肽類(lèi)模擬物。它們均可結(jié)合并活化TPO受體(Mpl)從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
[0003]第一代TPO受體激動(dòng)劑以重組人血小板生成素rhTPO (特比澳等)為代表，其與內(nèi)源性TPO的氨基酸序列相同，能與巨核細(xì)胞表面TPO受體Mpl結(jié)合進(jìn)而引起巨核細(xì)胞增殖，進(jìn)而產(chǎn)生血小板。
[0004]TPO模擬肽-Fe融合蛋白(羅米司亭等)為一種新型重組蛋白，屬于第二代TPO受體激動(dòng)劑，是一種長(zhǎng)效TPO受體激動(dòng)劑。該蛋白是在抗體Fe片段羧基端連接了兩段TPO模擬肽，該模擬肽可以與TPO受體特異結(jié)合，誘導(dǎo)骨髓中的造血干細(xì)胞分化為巨核細(xì)胞，并促進(jìn)巨核細(xì)胞的生長(zhǎng)、成熟和分化，使巨核細(xì)胞最終釋放血小板。
[0005]艾曲波帕為口服非肽類(lèi)小分子TPO受體激動(dòng)劑，可特異結(jié)合TPO受體，引起受體二聚化，激活酪氨酸激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活(JAK-STAT)等信號(hào)通路，進(jìn)而引起巨核細(xì)胞增殖分化，產(chǎn)生血小板。
[0006]由于TPO受體激動(dòng)劑具有刺激細(xì)胞增殖的作用，因此通常采用相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行體外生物學(xué)活性評(píng)價(jià)。有文獻(xiàn)報(bào)道使用BaF3-hMpl細(xì)胞進(jìn)行rhTPO或羅米司亭體外活性分析。但是這種方法所用細(xì)胞系BaF3-hmpl細(xì)胞是在原細(xì)胞基礎(chǔ)上導(dǎo)入c_mpl基因，進(jìn)而在細(xì)胞表面表達(dá)TPO的受體Mpl，細(xì)胞系的構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，受體數(shù)量不均一，細(xì)胞穩(wěn)定性較差。活性檢測(cè)結(jié)果容易受到細(xì)胞穩(wěn)定性的影響而有較大變動(dòng)。此方法采用MTT比色法，產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不易溶解，需加入DMSO溶解甲臜產(chǎn)物，且往往因溶解不全而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。此方法采用存活率指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)不同濃度rhTPO或羅米司亭對(duì)BaF3-mpl細(xì)胞增殖的影響，但是計(jì)算存活率的方法不能換算成樣品活性值。
[0007]本發(fā)明人過(guò)潛心研究發(fā)現(xiàn)采用從白血病患者外周血中分離所得的M07e細(xì)胞株能夠特異性地表達(dá)TPO受體Mpl，無(wú)需任何改造，簡(jiǎn)單方便實(shí)用。相比現(xiàn)有技術(shù)中采用BaF3-mpl細(xì)胞株更均一，性質(zhì)更加穩(wěn)定。采用M07e細(xì)胞株進(jìn)行體外活性檢測(cè)，評(píng)價(jià)結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度均有大幅度提高，同時(shí)大大縮短構(gòu)建和篩選細(xì)胞株所需的3個(gè)月?5個(gè)月，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。
[0008]另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)聯(lián)合采用一種新型顯色劑-CCK-8 (cell counting 8)進(jìn)行活性評(píng)價(jià)能夠進(jìn)一步解決現(xiàn)有技術(shù)中存在采用有機(jī)溶劑，安全性低，測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確的缺陷。此試劑利用了 Dojindo開(kāi)發(fā)的水溶性四唑鹽-WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎗硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS )存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臜染料。WST-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。CCK-8比色法無(wú)需裂解細(xì)胞，可直接進(jìn)行比色，該方法步驟簡(jiǎn)便，顯色時(shí)間僅需2小時(shí)(MTT法需要過(guò)夜顯色)，并且準(zhǔn)確性和重復(fù)性得到了明顯提高。
[0009]根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典三部(2010版)附錄X，多種細(xì)胞因子活性采用細(xì)胞增殖法/MTT比色法測(cè)定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用四參數(shù)法進(jìn)行處理，最終計(jì)算出樣品生物學(xué)活性。據(jù)此，根據(jù)本發(fā)明測(cè)定方法可以通過(guò)四參數(shù)法處理數(shù)據(jù)，能夠直接計(jì)算出TPO受體激動(dòng)劑活性值，較以往的存活率評(píng)價(jià)方法更直觀(guān)體現(xiàn)TPO受體激動(dòng)劑的體外活性。
[0010]本發(fā)明人根據(jù)長(zhǎng)期研究和實(shí)踐，建立了一種新型的利用懸浮細(xì)胞(M07e)評(píng)價(jià)TPO受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法:細(xì)胞與TPO受體激動(dòng)劑孵育一段時(shí)間后，加入顯色試劑CCK-8對(duì)吸光度值進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而將檢測(cè)值進(jìn)行四參數(shù)回歸分析。結(jié)果在一定范圍內(nèi)使得TPO受體激動(dòng)劑的濃度對(duì)數(shù)值與M07e細(xì)胞增殖量呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，可以準(zhǔn)確真實(shí)地反映出體外活性的情況。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，此方法中涉及的M07e細(xì)胞本身表達(dá)TPO受體，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，無(wú)需單獨(dú)在細(xì)胞表面表達(dá)受體，細(xì)胞穩(wěn)定性強(qiáng)。此檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，用時(shí)短，成本低，重現(xiàn)性高。
[0012]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
利用懸浮細(xì)胞M07e進(jìn)行促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的評(píng)價(jià)。
[0013]其中，該方法含有如下步驟:
(1)細(xì)胞復(fù)蘇及傳代；
(2)細(xì)胞活力評(píng)價(jià)；
(3)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品制備；
(4)樣品活性檢測(cè)；
(5)顯色方法；
(6)原始數(shù)據(jù)處理。
[0014]進(jìn)一步地，該方法的詳細(xì)步驟如下所示:
(1)細(xì)胞復(fù)蘇及傳代:
將細(xì)胞株從液氮罐中取出，迅速放入37°c水浴中，輕輕震搖使其快速融解；在超凈臺(tái)中將其移入離心管中，加入濃度為10%-20%的FBS+1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；800-1000rpm離心3-10min后棄去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)基及生長(zhǎng)因子重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF，吹打混勻，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；瓶壁上標(biāo)明細(xì)胞名稱(chēng)、操作日期、細(xì)胞代次；
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞吹打混勻，取100 μ I細(xì)胞懸液測(cè)定活細(xì)胞濃度、細(xì)胞存活率；將細(xì)胞懸液用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度約為5X 104個(gè)/ml?1X 104個(gè)/ml，每瓶15ml ;輕輕搖勻，37°C，5%- 10%C02條件下培養(yǎng)；復(fù)蘇后最多傳至20代棄用；
(2)細(xì)胞活力評(píng)價(jià):
取50?100 μ I細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)等體積混合；于細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定活細(xì)胞濃度、細(xì)胞存活率；細(xì)胞傳代濃度為5X 104個(gè)/ml?1X 104個(gè)/ml，每3?4天傳代一次；
(3)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品制備
取一支TPO受體激動(dòng)劑，注射用水溶解至蛋白濃度為0.02?0.07mg/ml，用濃度為10%-20%的FBS+1640培養(yǎng)基進(jìn)行5?10倍梯度稀釋?zhuān)渲??9個(gè)濃度的活性標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(4)樣品活性檢測(cè):
取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M07e細(xì)胞，吹打混勻，800-1000rpm離心；上清液高速離心后加入空白對(duì)照孔；沉淀細(xì)胞用無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗滌兩次；再用濃度為10%-20%的FBS+1640培養(yǎng)基重懸；用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5 X 105?2.2 X 105個(gè)/ml ;樣品及空白對(duì)照50μ1/孔，細(xì)胞150μ1/孔加入96孔板中，37°C，5%- 10% C02條件下培養(yǎng)48?72小時(shí)；
(5)顯色方法:
將CCK-8試劑用濃度為10%-20%的FBS+1640培養(yǎng)基等體積稀釋?zhuān)患尤?6孔板中；每孔20 μ 1，搖勻，放入C02培養(yǎng)箱中孵育2h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm和600nm處吸光度；
(6)原始數(shù)據(jù)處理
以標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的稀釋倍數(shù)為X值，以對(duì)應(yīng)的吸光度為y值，用Gen5 1.10軟件作四參數(shù)回歸曲線(xiàn)'Y= (A-D) / (1+ (X/C) a B) + D;
其中:A:曲線(xiàn)上漸近線(xiàn)估值即最大吸光度值；
B:曲線(xiàn)的斜率；
C:最大有效量一半時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度；
D:曲線(xiàn)下漸近線(xiàn)估值即最小吸光度值；
將標(biāo)準(zhǔn)品溶液四參數(shù)曲線(xiàn)的(A+D)/2代入標(biāo)準(zhǔn)品與樣品方程，得到標(biāo)準(zhǔn)品Er與樣品
Es ；
其中:A:標(biāo)準(zhǔn)品最大吸光度值即為450nm扣除600nm吸光度，再減去空白對(duì)照；
D:標(biāo)準(zhǔn)品最小吸光度值即為450nm扣除600nm吸光度，再減去空白對(duì)照；
其中:樣品活性/比活性計(jì)算公式:供試品活性/比活性計(jì)算公式:
供試品活性(U/ml) =Pr X ；
供試品比活性(U/mg)=；
其中:
Pr:標(biāo)準(zhǔn)品活性，U/ml ；
Ds:樣品預(yù)稀釋倍數(shù)；
Dr:標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；
Es:樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)；
Er:標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)。
[0015]其中，步驟(I)中所使用的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基，且添加的M07e生長(zhǎng)所依賴(lài)的GM-CSF終濃度為5?10ng/ml。
[0016]其中，步驟(2)中進(jìn)行細(xì)胞活力評(píng)價(jià)時(shí)，用于樣品檢測(cè)的細(xì)胞活力范圍為:活細(xì)胞濃度7X 15個(gè)/ml?12X 15個(gè)/ml，細(xì)胞存活率彡90%。
[0017]其中，步驟(3)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的濃度范圍為:0.00005ng/ml?5000ng/ml，采用5?10倍梯度稀釋對(duì)樣品進(jìn)行處理。
[0018]其中，步驟(4)中樣品活性檢測(cè)過(guò)程使用培養(yǎng)基不含有M07e細(xì)胞復(fù)蘇和傳代時(shí)所依賴(lài)的生長(zhǎng)因子，而是加入一定濃度待檢測(cè)的TPO受體激動(dòng)劑。
[0019]其中，步驟(5)中的顯色方法為細(xì)胞培養(yǎng)48?72小時(shí)后加入CCK-8顯色試劑。
[0020]其中，步驟(6)中的原始數(shù)據(jù)處理采用四參數(shù)計(jì)算法。
[0021]其中，促血小板生成素受體激動(dòng)劑含有重組人全長(zhǎng)血小板生成素rhTPO或聚乙二醇修飾的重組人巨核細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育因子PEG-rhMG-DF或TP0/IL3融合蛋白或TPO肽類(lèi)模擬物或TPO非肽類(lèi)模擬物和抗體類(lèi)小分子TPO受體激動(dòng)劑中的任意一種。
[0022]本發(fā)明的有益效果在于:
(1)省去了構(gòu)建細(xì)胞系及篩選細(xì)胞系的2?5個(gè)月的時(shí)間；
(2)本細(xì)胞株可穩(wěn)定表達(dá)TPO受體，大大提高了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性、重復(fù)性；
(3)本方法使用CCK-8進(jìn)行顯色，與傳統(tǒng)MTT法相比，顯色時(shí)間僅I?4小時(shí)，節(jié)省傳統(tǒng)方法中需要過(guò)夜放置的時(shí)間，并且在懸浮細(xì)胞顯色不會(huì)出現(xiàn)沉淀；
(4)本檢測(cè)方法采用四參數(shù)回歸計(jì)算法處理原始數(shù)據(jù)，與傳統(tǒng)存活率計(jì)算方式相比，數(shù)據(jù)結(jié)果更可靠、直觀(guān)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為T(mén)MP-Fc四參數(shù)擬合曲線(xiàn)。
[0024]圖2為重組人促血小板生成素模擬肽-Fe融合蛋白(TMP-Fc)四參數(shù)擬合曲線(xiàn)(5倍稀釋梯度)。
[0025]圖3為重組人促血小板生成素模擬肽-Fe融合蛋白(TMP-Fc)四參數(shù)擬合曲線(xiàn)(10倍稀釋梯度)。
[0026]圖4為羅米司亭體外活性檢測(cè)四參數(shù)擬合曲線(xiàn)。
[0027]圖5為人重組血小板生成素rhTPO體外活性檢測(cè)四參數(shù)擬合曲線(xiàn)。

【具體實(shí)施方式】
[0028]以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將其理解為本發(fā)明的范圍僅限于以下實(shí)施例。凡基于本發(fā)明的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的范圍。顯然，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明的基本技術(shù)思想的前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換和變更。
[0029]實(shí)施例一重組人促血小板生成素模擬肽-Fe融合蛋白(TMP-Fc)體外活性評(píng)價(jià)(5倍稀釋梯度)
(I)細(xì)胞復(fù)蘇及傳代
將細(xì)胞株從液氮罐中取出，迅速放入37°C水浴中，輕輕震搖使其快速融解。在超凈臺(tái)中將其移入離心管中，加入10% FBS+1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。800rpm離心5min后棄去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)基及生長(zhǎng)因子重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，終濃度1ng/ml，吹打混勻，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。瓶壁上標(biāo)明細(xì)胞名稱(chēng)、操作日期、細(xì)胞代次。
[0030]將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞吹打混勻，取100 μ I細(xì)胞懸液測(cè)定活細(xì)胞濃度、細(xì)胞存活率等。將細(xì)胞懸液用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度約為1X 14個(gè)/ml，每瓶15ml。輕輕搖勻，37°C，8% CO2條件下培養(yǎng)。復(fù)蘇后最多傳至第4代用于本次檢測(cè)。
[0031](2)細(xì)胞活力評(píng)價(jià)
取100 μ I細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)等體積混合，于細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定活細(xì)胞濃度11 X 15個(gè)/ml、細(xì)胞存活率95.3%。
[0032]( 3 )標(biāo)準(zhǔn)品及樣品制備
取一支TMP-Fc，注射用水溶解至蛋白濃度為0.025mg/ml，用10% FBS+1640培養(yǎng)基進(jìn)行5倍梯度稀釋?zhuān)渲?個(gè)濃度的樣品溶液
(4)樣品活性檢測(cè)
取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M07e細(xì)胞，吹打混勻，800rpm離心。上清液高速離心后加入空白對(duì)照孔。沉淀細(xì)胞用無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗滌兩次，再用10% FBS+1640培養(yǎng)基重懸。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1.8X 15個(gè)/ml。樣品及空白對(duì)照50μ1/孔，細(xì)胞150μ1/孔加入96孔板中，37°C，8% CO2條件下培養(yǎng)60小時(shí)。
[0033](5)顯色方法
將CCK-8試劑用10% FBS+1640培養(yǎng)基等體積稀釋(現(xiàn)用現(xiàn)配)，加入96孔板中。每孔20 μ 1，搖勻，放入CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm和600nm處吸光度。
[0034](6)原始數(shù)據(jù)處理
以標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的濃度為X值，以對(duì)應(yīng)的吸光度(450nm扣除600nm吸光度，再減去空白對(duì)照)為y值，用Gen5 1.10軟件作四參數(shù)回歸曲線(xiàn)。
[0035]Y= (A-D) / (1+ (X/C) " B) + D
A:曲線(xiàn)上漸近線(xiàn)估值(最大吸光度值)B:曲線(xiàn)的斜率C:最大有效量一半時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度D:曲線(xiàn)下漸近線(xiàn)估值(最小吸光度值)
將標(biāo)準(zhǔn)品溶液四參數(shù)曲線(xiàn)的(A+D)/2代入標(biāo)準(zhǔn)品與樣品方程，得到待測(cè)樣品半數(shù)有效濃度。
[0036]結(jié)果如圖2所示，在TMP-Fc濃度為0.0032ng/ml?1250ng/ml的范圍內(nèi)，M07e細(xì)胞增殖量與TMP-Fc濃度的以10為底的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2 =0.998。TMP-Fc半效濃度為2.8ng/ml。
[0037]實(shí)施例二重組人促血小板生成素模擬肽-Fe融合蛋白(TMP-Fc)體外活性評(píng)價(jià)(10倍稀釋梯度)
細(xì)胞復(fù)蘇及傳代、細(xì)胞活力評(píng)價(jià)、樣品檢測(cè)、顯色方法、數(shù)據(jù)處理詳細(xì)步驟見(jiàn)案例一，樣品制備采用10倍梯度稀釋?zhuān)渲?個(gè)濃度的樣品溶液
結(jié)果如圖3所示，在TMP-Fc濃度為0.0005ng/ml?5000ng/ml的范圍內(nèi)，M07e細(xì)胞增殖量與TMP-Fc濃度的以10為底的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2 =0.999。TMP-Fc半效濃度為 3.0ng/mL.
[0038]實(shí)施例三羅米司亭體外活性評(píng)價(jià)
細(xì)胞復(fù)蘇及傳代、細(xì)胞活力評(píng)價(jià)、樣品檢測(cè)、顯色方法、數(shù)據(jù)處理詳細(xì)步驟見(jiàn)案例一。
[0039]樣品制備:取羅米司亭樣品，用10% FBS+1640培養(yǎng)基稀釋蛋白濃度至0.05mg/ml,采用10倍梯度稀釋?zhuān)渲?個(gè)濃度的樣品溶液。
[0040]結(jié)果如圖4所示，在羅米司亭濃度為0.0005ng/ml?5000ng/ml的范圍內(nèi)，M07e細(xì)胞增殖量與羅米司亭濃度濃度的以10為底的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2 =0.995。羅米司亭濃度半效濃度為3.0ng/mL.
[0041]實(shí)施例四rhTPO細(xì)胞活性評(píng)價(jià)
細(xì)胞復(fù)蘇及傳代、細(xì)胞活力評(píng)價(jià)、樣品檢測(cè)、顯色方法、數(shù)據(jù)處理詳細(xì)步驟見(jiàn)案例一。
[0042]樣品制備:取人重組血小板生成素rhTPO樣品，用10% FBS+1640培養(yǎng)基稀釋蛋白濃度至512ng/ml，采用2倍梯度稀釋?zhuān)渲?個(gè)濃度的樣品溶液。
[0043]結(jié)果如圖5所示，rhTPO濃度在O?256ng/ml之間濃度曲線(xiàn)呈上升狀態(tài)，rhTPO濃度為256ng/ml時(shí)，M07e細(xì)胞增殖達(dá)到平臺(tái)期。rhTPO半效濃度為51.2ng/ml。
[0044]比較例(MTT及CCK-8顯色方法的比較)
分別采用MTT顯色法及CCK-8顯色法檢測(cè)TMP-Fc對(duì)M07e細(xì)胞的增殖效果，樣品與細(xì)胞孵育72小時(shí)后進(jìn)行顯色，其中MTT顯色法每孔加入100 μ I DMSO后過(guò)夜放置，次日發(fā)現(xiàn)藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜仍未完全溶解，無(wú)法檢測(cè)其吸收值；CCK-8法加入顯色劑10μ 1，放置2小時(shí)檢測(cè)450nm/600nm吸收值。
[0045]MTT法顯色形成甲臜沉淀，需要再加入DMSO過(guò)夜溶解，而CCK-8顯色后直接形成水溶性甲臜染料，省去甲臜溶解時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，顯色時(shí)間短(2h)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CCK-8法檢測(cè)的OD值與活細(xì)胞數(shù)的相關(guān)度要優(yōu)于MTT法，是一種靈敏度高、重復(fù)性好的細(xì)胞活性檢測(cè)方法。基于上述原因，選擇CCK-8法作為該發(fā)明的顯色方法。
[0046]驗(yàn)證例
(1)線(xiàn)性與范圍
樣品濃度范圍線(xiàn)性R2
實(shí)例一0.0032ng/ml ?1250ng/ml0.998
實(shí)例二0.0005ng/ml ?5000ng/ml0.999
實(shí)例三0.0005ng/ml ?5000ng/ml0.997
(2)重現(xiàn)性
根據(jù)
【發(fā)明內(nèi)容】
中具體步驟及線(xiàn)性與范圍要求稀釋TMP-Fc樣品，重復(fù)測(cè)定6次計(jì)算RSD，表I結(jié)果顯示，采用該方法檢測(cè)TMP-Fc體外活性的重現(xiàn)性RSD= 8.1% ,RSD ( 20%，符合一般生物制品活性檢測(cè)精密度要求。
[0047]表I TMP-Fc樣品重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
樣品比活性值U/mg平均值U/mg RSD
1447897
2435795
33890734009339.5%
4409427
5345565
6377843
(3)準(zhǔn)確度
TMP-Fc樣品與TMP-Fc標(biāo)準(zhǔn)品按照一定比例混合，分別制成50%、100%、150%添加回收率樣品，按
【發(fā)明內(nèi)容】
中具體步驟測(cè)定未添加對(duì)照、50%、100%及150%添加回收率樣品的活性，并與理論添加值比較，回收率在70%?130%范圍內(nèi)滿(mǎn)足本方法準(zhǔn)確度要求。
[0048]TMP-Fc樣品50%、100%、150%添加試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，在添加樣品中，50%、100%、150%添加回收率測(cè)定值范圍為80%~120%之間，因此該方法準(zhǔn)確度符合要求。
[0049] 表2 TMP-Fc樣品準(zhǔn)確度驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

【權(quán)利要求】
1.一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于該方法是利用懸浮細(xì)胞M07e進(jìn)行促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的評(píng)價(jià)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于該方法含有如下步驟: (1)細(xì)胞復(fù)蘇及傳代； (2)細(xì)胞活力評(píng)價(jià)； (3)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品制備； (4)樣品活性檢測(cè)； (5)顯色方法； (6)原始數(shù)據(jù)處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于該方法含有如下步驟: (1)細(xì)胞復(fù)蘇及傳代: 將細(xì)胞株從液氮罐中取出，迅速放入37°C水浴中，輕輕震搖使其快速融解；在超凈臺(tái)中將其移入離心管中，加入濃度為10%-20%的FBS+1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；800-1000rpm離心3-10min后棄去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)基及生長(zhǎng)因子重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF，吹打混勻，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；瓶壁上標(biāo)明細(xì)胞名稱(chēng)、操作日期、細(xì)胞代次； 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞吹打混勻，取100 μ I細(xì)胞懸液測(cè)定活細(xì)胞濃度、細(xì)胞存活率；將細(xì)胞懸液用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度約為5 X 14個(gè)/ml?10 X 14個(gè)/ml，每瓶15ml ;輕輕搖勻，37°C，5%- 10%C02條件下培養(yǎng)；復(fù)蘇后最多傳至20代棄用； (2)細(xì)胞活力評(píng)價(jià): 取50?100 μ I細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)等體積混合；于細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定活細(xì)胞濃度、細(xì)胞存活率；細(xì)胞傳代濃度為5X 14個(gè)/ml?1X 14個(gè)/ml，每3?4天傳代一次； (3)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品制備 取一支TPO受體激動(dòng)劑，注射用水溶解至蛋白濃度為0.02?0.07mg/ml，用濃度為10%-20%的FBS+1640培養(yǎng)基進(jìn)行5?10倍梯度稀釋?zhuān)渲??9個(gè)濃度的活性標(biāo)準(zhǔn)品溶液； (4)樣品活性檢測(cè): 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M07e細(xì)胞，吹打混勻，800-1000rpm離心；上清液高速離心后加入空白對(duì)照孔；沉淀細(xì)胞用無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗滌兩次；再用濃度為10%-20%的FBS+1640培養(yǎng)基重懸；用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5 X 15?2.2 X 15個(gè)/ml ;樣品及空白對(duì)照50μ1/孔，細(xì)胞150μ1/孔加入96孔板中，37°C，5%- 10% CO2條件下培養(yǎng)48?72小時(shí)； (5)顯色方法: 將CCK-8試劑用濃度為10%-20%的FBS+1640培養(yǎng)基等體積稀釋?zhuān)患尤?6孔板中；每孔20 μ 1，搖勻，放入CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm和600nm處吸光度； (6)原始數(shù)據(jù)處理 以標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的稀釋倍數(shù)為X值，以對(duì)應(yīng)的吸光度為y值，用Gen5 1.10軟件作四參數(shù)回歸曲線(xiàn)；Y= (A-D) / (1+ (X/C) a B) + D; 其中:A:曲線(xiàn)上漸近線(xiàn)估值即最大吸光度值；B:曲線(xiàn)的斜率；C:最大有效量一半時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度；D:曲線(xiàn)下漸近線(xiàn)估值即最小吸光度值； 將標(biāo)準(zhǔn)品溶液四參數(shù)曲線(xiàn)的(A+D)/2代入標(biāo)準(zhǔn)品與樣品方程，得到標(biāo)準(zhǔn)品Er與樣品Es ； 其中:A:標(biāo)準(zhǔn)品最大吸光度值即為450nm扣除600nm吸光度，再減去空白對(duì)照； D:標(biāo)準(zhǔn)品最小吸光度值即為450nm扣除600nm吸光度，再減去空白對(duì)照； 其中:樣品活性/比活性計(jì)算公式:供試品活性/比活性計(jì)算公式: 供試品活性(U/ml) =Pr X ； 供試品比活性(U/mg)=; 其中: Pr:標(biāo)準(zhǔn)品活性，U/ml ； Ds:樣品預(yù)稀釋倍數(shù)； Dr:標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)； Es:樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)； Er:標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于步驟(I)中所使用的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基，且添加的M07e生長(zhǎng)所依賴(lài)的GM-CSF終濃度為5?10ng/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于步驟(2)中進(jìn)行細(xì)胞活力評(píng)價(jià)時(shí)，用于樣品檢測(cè)的細(xì)胞活力范圍為:活細(xì)胞濃度7X 15個(gè)/ml?12X 15個(gè)/ml，細(xì)胞存活率彡90%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于步驟(3)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的濃度范圍為:0.00005ng/ml?5000ng/ml，采用5?10倍梯度稀釋對(duì)樣品進(jìn)行處理。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于步驟(4)中樣品活性檢測(cè)過(guò)程使用培養(yǎng)基不含有M07e細(xì)胞復(fù)蘇和傳代時(shí)所依賴(lài)的生長(zhǎng)因子，而是加入一定濃度待檢測(cè)的TPO受體激動(dòng)劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于，步驟(5)中的顯色方法為細(xì)胞培養(yǎng)48?72小時(shí)后加入CCK-8顯色試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于步驟(6)中的原始數(shù)據(jù)處理采用四參數(shù)計(jì)算法。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的一種評(píng)價(jià)促血小板生成素受體激動(dòng)劑體外活性的分析方法，其特征在于，促血小板生成素受體激動(dòng)劑含有重組人全長(zhǎng)血小板生成素rhTPO或聚乙二醇修飾的重組人巨核細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育因子PEG-rhMG-DF或TP0/IL3融合蛋白或TPO肽類(lèi)模擬物或TPO非肽類(lèi)模擬物和抗體類(lèi)小分子TPO受體激動(dòng)劑中的任意一種。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104181290SQ201410387494
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】常翠云, 賈慧, 齊連權(quán), 劉福星, 崔穎, 劉利波 申請(qǐng)人:北京泰德制藥股份有限公司