一種泥蚶血紅蛋白過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及到一種泥蚶血紅蛋白過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟：向磷酸鹽緩沖液中加入愈創(chuàng)木酚和雙氧水，控制愈創(chuàng)木酚和雙氧水的濃度，得到底物；向半微量比色皿中加入底物，25～40℃下將待測(cè)Tg-Hb置于比色皿壁上，混合搖勻；用分光光度計(jì)測(cè)其吸光度，記錄A470；酶活力(U/ml)＝4×△A470/min×VA×N÷(ε470×VB)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行、檢測(cè)速度快、誤差小、易標(biāo)準(zhǔn)化，能夠在其失活前完成檢測(cè)，徹底解決了Tg-Hb過(guò)氧化物酶對(duì)底物雙氧水不穩(wěn)定問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】一種泥蚶血紅蛋白過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到血紅蛋白過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法，具體指一種泥蚶血紅蛋白過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]血紅蛋白是所有脊椎動(dòng)物和部分無(wú)脊椎動(dòng)物血液中所含有的一大類含鐵的呼吸蛋白，除具有運(yùn)輸氧氣的主要功能外，還具有穩(wěn)定血壓、抗菌、運(yùn)輸硫化物、調(diào)節(jié)酸堿平衡、過(guò)氧化酶活性等多種生物學(xué)功能，是最具有研究?jī)r(jià)值的蛋白質(zhì)家族之一。
[0003]泥蚶是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雙殼類軟體動(dòng)物，在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中它是一個(gè)較為特別的含有血紅蛋白的種類，具有補(bǔ)血、溫中、健胃的功效。泥蚶的血液中存在大量的血紅蛋白，并且研究發(fā)現(xiàn)，泥蚶血紅蛋白(Tg-Hb)的抗菌能力與其過(guò)氧化物酶活性相關(guān)。因此，檢測(cè)泥蚶血紅蛋白過(guò)氧化物酶酶活性對(duì)研究泥蚶血紅蛋白的抗菌作用，甚至泥蚶的抗菌性能具有重要的意義。
[0004]血紅蛋白的過(guò)氧化酶活性通常采用終止反應(yīng)法進(jìn)行檢測(cè)。如將底物(胺或酚和雙氧水)與血紅蛋白混合,在一定pH、溫度下反應(yīng)10分鐘,然后用酸堿或變性劑終止反應(yīng),測(cè)酶反應(yīng)前后吸光值的變化(Λ A)，通過(guò)Λ A計(jì)算血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活力。但是這些方法操作過(guò)程繁瑣，不易控制反應(yīng)，誤差較大，無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化。
[0005]另外，由于Tg-Hb對(duì)底物之一雙氧水不穩(wěn)定，在上述測(cè)酶活常用的雙氧水濃度下會(huì)逐漸失活，3分鐘后基本無(wú)活性，如果測(cè)酶活時(shí)減少雙氧水用量，則又會(huì)因底物不足影響反應(yīng)速度。所以，采用終止反應(yīng)法檢測(cè)Tg-Hb的誤差尤其大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀提供一種具有簡(jiǎn)單、快速、誤差小、易標(biāo)準(zhǔn)化的Tg-Hb中過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法，在其失活前完成檢測(cè)，解決其對(duì)底物雙氧水不穩(wěn)定問(wèn)題。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:該Tg-Hb過(guò)氧化物酶的活性檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟:
[0008]向45-55mml/L pH6.5_7.5磷酸鹽緩沖液中加入愈創(chuàng)木酚和雙氧水，控制愈創(chuàng)木酚的濃度為2-6mmol/L，優(yōu)選4mmol/L，雙氧水濃度為l-2mmol/L，優(yōu)選2mmol/L ;得到底物；
[0009]向半微量比色皿中加入Iml底物，控制底物溫度為25?40°C，優(yōu)選35°C ；
[0010]將9-1 Iul待測(cè)Tg-Hb置于比色皿壁上，加蓋后在5s內(nèi)混合搖勻；用分光光度計(jì)在470nm下采用動(dòng)力學(xué)模式測(cè)其吸光度；每5秒記錄數(shù)據(jù)A47tl,記錄2分鐘；儀器顯示的活度或slope即為Λ A47(l/min ;對(duì)于不能直接顯示活度或slope的分光光度計(jì),可用A47c!對(duì)時(shí)間作圖，從圖中求出每分鐘吸光度值的變化，即Λ A47(l/min ；
[0011]調(diào)整Tg-Hb 的量,使Λ A47(l/min 不大于 0.4 ；
[0012]每分鐘吸光度的變化值即為過(guò)氧化物酶活力，每分鐘轉(zhuǎn)化IumolH2O2為一個(gè)酶活，酶活力(U/ml)的計(jì)算方法如下:
[0013]酶活力(U/ml)= 4X Δ A470/minXVaXN+ ( ε 470 XVB)
[0014]= 15 X Δ A470/minXN
[0015]其中:ε 47Q = 26.GmT1.cnT1，為產(chǎn)物四鄰甲氧基聯(lián)酚消光系數(shù)；
[0016]Va為底物溶液量，單位ml ；
[0017]Vb為加入的樣品溶液體積，單位ml ；
[0018]N為稀釋倍數(shù)。
[0019]優(yōu)選所述記錄時(shí)長(zhǎng)為I分鐘。
[0020]更好的，在所述底物和所述待測(cè)Tg-Hb混合均勻10秒后開(kāi)始記錄，記錄時(shí)長(zhǎng)為30秒。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的Tg-Hb過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行、檢測(cè)速度快、誤差小、易標(biāo)準(zhǔn)化，能夠在其失活前完成檢測(cè)，徹底解決了 Tg-Hb過(guò)氧化物酶對(duì)底物雙氧水不穩(wěn)定問(wèn)題。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1和圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中兩種檢測(cè)方法檢測(cè)的Tg-Hb酶活性與其濃度的關(guān)系圖；其中圖1為Tg-Hb I，圖2為Tg-Hb II。?表示本發(fā)明方法測(cè)定的酶活，■表示OPDA法測(cè)定的酶活。
[0023]圖3本發(fā)明實(shí)施例3中pH值與相對(duì)酶活力的關(guān)系圖；
[0024]圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中溫度和相對(duì)酶活力的關(guān)系圖；
[0025]圖5、圖6為實(shí)施例5中不同濃度的愈創(chuàng)木酚對(duì)Tg-Hb酶活影響圖；其中圖5為Tg-Hb I，圖 6 為 Tg-Hb II ；
[0026]圖7和圖8為實(shí)施例6中不同濃度的雙氧水對(duì)Tg-Hb酶活影響圖；其中圖7為Tg-Hb I，圖 8 為 Tg-Hb II ；

【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0028]實(shí)施例1
[0029]本發(fā)明與常規(guī)過(guò)氧化物酶活性測(cè)定方法的對(duì)比。
[0030]取lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL5 種濃度的 Tg-HbI 樣品和 2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL5種濃度的Tg-Hb II樣品，用兩種方法檢測(cè)其過(guò)氧化物酶活性。
[0031]本發(fā)明檢測(cè)方法如下:
[0032]向50mml/L、pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中加入愈創(chuàng)木酚和雙氧水，控制愈創(chuàng)木酚的濃度為4mmol/L，雙氧水濃度為2mmol/L，得到底物；
[0033]向半微量比色皿中加入Iml底物，控制底物溫度為25°C ；
[0034]將1ul待測(cè)Tg-HbTg-Hb置于比色皿壁上，加蓋后在5s內(nèi)混合搖勻；用分光光度計(jì)在470nm波長(zhǎng)下采用動(dòng)力學(xué)模式測(cè)其吸光度，設(shè)置延時(shí)10秒，測(cè)量時(shí)間10?40秒，每5秒記錄數(shù)據(jù)A47tl,儀器顯示的slope (斜率)即為Λ A47(l/min。
[0035]調(diào)整Tg-Hb 的量，使Λ A470/min 不大于 0.4 ；
[0036]每分鐘吸光度的變化值即為過(guò)氧化物酶活力大小，以每分鐘轉(zhuǎn)化IumolH2O2為一個(gè)酶活，按下式計(jì)算酶活力(U/ml):按下式計(jì)算酶活力(U/ml):
[0037]酶活力(U/ml)= 4X Δ A470/minXVaXN+ ( ε 470 XVB)
[0038]= 15 X Δ A470/minXN
[0039]其中:ε 47(l = 26.emT1.cnT1，產(chǎn)物四鄰甲氧基聯(lián)酚消光系數(shù)，
[0040]Va = 1.0ml (底物溶液)，
[0041]Vb:0.0lml (加入的樣品溶液體積)，
[0042]N:l(稀釋倍數(shù))
[0043]現(xiàn)有OPDA法血紅蛋白過(guò)氧化物酶的檢測(cè)方法:
[0044]在25°C、0.lmol/L Na2HPO4 —檸檬酸緩沖液(ρΗ5.0)配制成含4.6mmol/L鄰苯二胺(OPDA)、0.lmmol/L H2O2的溶液,分別加入不同濃度的Tg-Hb開(kāi)始反應(yīng),反應(yīng)1min用Imol/L H2SO4 (2ml)終止反應(yīng)，430nm處檢測(cè)吸光度的變化。
[0045]兩種方法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。圖中?表示本發(fā)明方法測(cè)定的酶活，■表示OPDA法測(cè)定的酶活。
[0046]由圖1和圖2可知，該發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果是:在I?5mg/mL的濃度范圍內(nèi)，Tg-HbI酶活與其濃度呈很好的線性關(guān)系；在2?10mg/mL的濃度范圍內(nèi)，Tg-Hb II的濃度與酶活也呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.9963,0.9990，均在0.99以上。而用OPDA法測(cè)的兩種Tg-Hb的酶活與其濃度均未呈現(xiàn)線性關(guān)系，隨著Tg-Hb濃度的增大，檢測(cè)的酶活結(jié)果逐漸偏低。
[0047]實(shí)施例2
[0048]本實(shí)施例為底物選擇。
[0049]在50mml/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液中加入雙氧水，使其濃度為2mmol/L，然后加入愈創(chuàng)木酚，配制一系列濃度的愈創(chuàng)木酚溶液。用不同濃度愈創(chuàng)木酚溶液作底物，在25°C、470nm波長(zhǎng)下測(cè)定兩種Tg-Hb的酶活，繪制雙倒數(shù)圖，計(jì)算Km值。同樣方法測(cè)定鄰苯二酚、左旋多巴、苯酚、對(duì)苯二酚、L-酪氨酸、對(duì)甲酚的Km值。結(jié)果如表I所示。
[0050]表I Tg-HbI/Tg-HbII在不同底物下的米氏常數(shù)
[0051]


Km
底物-

Tg-HbITg-HbII
愈創(chuàng)木酚0.150.39
鄰苯二酚0.0970.087
左旋多巴1.442.65
? 酚108.255.77
對(duì)苯二酚1328 664.49
L-酪氨酸--
對(duì)甲酚--
[0052]Km值可作為反應(yīng)酶與底物的親和力大小的表征:Km值大，表明親和力??；Km值小，表明親和力大。Km值小親和力最大的是鄰苯二酚的，其次是愈創(chuàng)木酚。但因?yàn)猷彵蕉拥亩拘暂^大，考慮到安全性的問(wèn)題，選用愈創(chuàng)木酚作為Tg-Hb過(guò)氧化物酶活性測(cè)定的底物。
[0053]實(shí)施例3
[0054]檢測(cè)緩沖液pH值的選擇
[0055]先配制pH為2、3、4、5的50mmol/L的檸檬酸鈉緩沖液和pH為6、7、8、9、10的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，加入愈創(chuàng)木酚和雙氧水，使愈創(chuàng)木酚的濃度為4mmol/L，雙氧水濃度為2mmol/L，得到底物；在25°C、470nm波長(zhǎng)下測(cè)定兩種Tg-Hb的酶活，相對(duì)酶活力與pH值的關(guān)系如圖3所示。
[0056]由圖3可以看出，Tg-Hb I/Tg-Hb 11的最適pH均為5，在此pH下測(cè)其酶活比較靈敏。但Tg-Hb在pH低于6的溶液中容易發(fā)生解聚，失去其天然結(jié)構(gòu)。pH7.0接近生理pH，雖然在此條件下測(cè)定值較低，但可測(cè)定天然狀態(tài)Tg-Hb的過(guò)氧化物酶活性，因此，采用PH7.0的緩沖液作為測(cè)定pH。
[0057]實(shí)施例4
[0058]檢測(cè)溫度的選擇
[0059]在50mml/L、pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液加入愈創(chuàng)木酚和雙氧水，使愈創(chuàng)木酚的濃度為4mmol/L，雙氧水濃度為2mmol/L，得到底物；分別控制底物在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C和50°C，用分光光度計(jì)在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定兩種Tg-Hb的酶活，相對(duì)酶活力與溫度的關(guān)系如如圖4所示。
[0060]由圖4可以看出，30?40°C是其最適溫度，優(yōu)選35°C;但在25°C的時(shí)候，相對(duì)酶活力也挺高的?？紤]到室溫25°C比較好控制，所以，也可以選定25°C進(jìn)行檢測(cè)。
[0061]實(shí)施例5
[0062]底物愈創(chuàng)木酚濃度的確定
[0063]將愈創(chuàng)木酚、雙氧水加入到50mml/L、pH值為7的磷酸鹽緩沖液中，分別配置愈創(chuàng)木酌■濃度為 0.2mmol/L、0.5mmoI /I,、Immol /T,、2_o1 /T,、4mmo1 /T,.Bmmol /Τ,、8_ο1 /I,,雙氧水濃度均為2mmol/L的底物。用分光光度計(jì)在25°C、470nm波長(zhǎng)下測(cè)定兩種Tg-Hb的酶活，每5S記一個(gè)數(shù)據(jù)，記錄2min，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。圖中線1_7愈創(chuàng)木酚濃度分別為0.2mmol/L、0.5mmol/L>Immol/T,、2mmo1 /T,、4mmo1 /T,.Bmmol/T,、8mmo1 /L
[0064]由圖5和圖6看出，當(dāng)愈創(chuàng)木酹濃度為0.2mmol/L?4mmol/L,Tg-Hb的酶活與愈創(chuàng)木酚的濃度成正相關(guān)的關(guān)系，并且隨著愈創(chuàng)木酚底物濃度的增加，其反應(yīng)延滯期逐漸縮短，但是當(dāng)愈創(chuàng)木酚的濃度超過(guò)4mmol/L之后，其酶活與愈創(chuàng)木酚的濃度成負(fù)相關(guān)性，可見(jiàn)，高濃度的愈創(chuàng)木酚對(duì)酶活起抑制作用。因此，適合測(cè)定兩種Tg-Hb的愈創(chuàng)木酚濃度均為2?6mmol/L,最適的濃度則為4mmol/L。
[0065]實(shí)施例6
[0066]H2O2濃度的確定
[0067]將愈創(chuàng)木酚、雙氧水加入到50mml/L、pH值為7的磷酸鹽緩沖液中，分別配置H2O2濃度為 0.2mmol/L, 0.Smmol /T,, lmmol/L, 1.5mmol/L, 2mmol/L, 2.5mmol/L, 3mmol/L,愈創(chuàng)木酚濃度為4mmol/L的底物。用分光光度計(jì)在25°C、470nm波長(zhǎng)下測(cè)定兩種Tg-Hb的酶活，每5S記一個(gè)數(shù)據(jù)，記錄2min，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。圖中線1_7雙氧水濃度分別為0.2mmol/L，
0.Smmol /T,, lmmol/L, 1.5mmol/L, 2mmol/L, 2.5mmol/L, 3mmol/L。
[0068]由圖7和圖8可以看出，隨著雙氧水濃度的升高，反應(yīng)延滯期逐漸變短，但是當(dāng)濃度逐漸變高的時(shí)候，其線性反應(yīng)期也在縮短。連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活其監(jiān)測(cè)時(shí)間至少30秒，所以，適合Tg-HbI測(cè)定的雙氧水濃度為I?2mmol/L,最適的濃度為2mmol/L。在測(cè)定時(shí)，延時(shí)10秒,測(cè)定時(shí)間10?40秒；適合Tg-Hb II測(cè)定的雙氧水濃度為I?2.5mmol/L,最適的濃度為2mmol/L。在測(cè)定時(shí),延時(shí)5秒,測(cè)定時(shí)間5?40秒。綜合考慮，能同時(shí)測(cè)定兩種Tg-Hb的雙氧水濃度為I?2mmol/L,最適的濃度為2mmol/L。在測(cè)定時(shí),延時(shí)10秒,測(cè)定時(shí)間10?40秒。
【權(quán)利要求】
1.一種泥蚶血紅蛋白過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟: 向45-55mml/L pH6.5-7.5磷酸鹽緩沖液中加入愈創(chuàng)木酚和雙氧水，控制愈創(chuàng)木酚的濃度為2-6mmol/L，雙氧水濃度為l-2mmol/L，得到底物； 向半微量比色皿中加入Iml底物，控制底物溫度為25?40°C ; 將9-llul待測(cè)Tg-Hb置于比色皿壁上，加蓋后在5s內(nèi)混合搖勻；用分光光度計(jì)在470nm下采用動(dòng)力學(xué)模式測(cè)其吸光度，用分光光度計(jì)在470nm下采用動(dòng)力學(xué)模式測(cè)其吸光度；每5秒記錄數(shù)據(jù)A47tl,記錄2分鐘；儀器顯示的活度或slope即為Λ A470/min ;對(duì)于不能直接顯示活度或slope的分光光度計(jì)，可用A47tl對(duì)時(shí)間作圖，從圖中求出每分鐘吸光度值的變化,即 Λ A47(l/min ； 調(diào)整Tg-Hb的量，使Λ A47(l/min不大于0.4 ； 酶活力(U/ml) = 4X Δ A470MnXVaXN^- ( ε 470 XVB) 其中..ε 470 = 26.emT1.cnT1，為產(chǎn)物四鄰甲氧基聯(lián)酚消光系數(shù)； Va為底物溶液量，單位ml ； Vb為加入的樣品溶液體積,單位ml ； N為稀釋倍數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的泥蚶血紅蛋白過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于所述記錄時(shí)長(zhǎng)為I分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的泥蚶血紅蛋白過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于所述底物和所述待測(cè)Tg-Hb混合均勻10秒后開(kāi)始記錄,記錄時(shí)長(zhǎng)為30秒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的泥蚶血紅蛋白過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于愈創(chuàng)木酚的濃度為4mmol/L，雙氧水濃度為2mmol/L。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104198406SQ201410398692
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】王素芳, 林志華, 包永波, 劉建鋒 申請(qǐng)人:浙江萬(wàn)里學(xué)院