一種抗體修飾的納米銀及其試劑盒與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗體修飾的納米銀(AgNPs)，它以直徑為10～30nm的納米銀球為內核，銀球外表面靜電吸附有羊抗鼠IgG抗體。本發(fā)明還公開了上述抗體修飾的納米銀的制備方法、包含該抗體修飾的納米銀的試劑盒、及該抗體修飾的納米銀在制備檢測鼠IgG的試劑中的應用。本發(fā)明的抗體修飾的納米銀(納米銀-抗體)相比商品化的納米金-抗體具有與目標物反應時間快，顯色時間短，檢測濃度范圍寬且價格便宜的優(yōu)勢。此種納米銀-抗體具有取代納米金-抗體的能力。
【專利說明】一種抗體修飾的納米銀及其試劑盒與應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測【技術領域】，具體涉及一種用于檢測IgG的抗體修飾的納米銀及其試劑盒與應用。

【背景技術】
[0002]免疫診斷試劑常規(guī)應用的檢測方法有放射免疫分析(RIA)，酶聯免疫吸附分析法(ELISA)，化學發(fā)光免疫分析法，納米標記物免疫分析法。與酶標記物相比，納米標記物具有良好的化學穩(wěn)定性和制備可控性，因此基于納米材料標記的免疫測定技術靈敏度高、特異性強、精密度好、結果準確、操作簡便、快速、無污染，該技術正在進入微量物質測定的各個領域。其中，納米金標記物由于其顯色效果突出、檢測方便而被廣泛應用于各類試紙條，納米金催化銀增強顯色反應也被進一步應用于免疫分析中。
[0003]近年來，具有優(yōu)良光學特性的納米銀正被越來越多地應用于蛋白質和DNA等生物分子的檢測分析。首先，納米銀相比于納米金成本更低廉，可以大大降低生產的成本；其次，由于納米銀具有更高的摩爾消光系數，其顏色變化會更靈敏；最后，納米銀具有很強的催化性能?？梢姡{米銀具有摩爾消光系數高、表面增強拉曼散色效應強和催化活性好等獨特的物理化學性能。然而，納米銀標記物用于免疫顯色分析的報道并不多，研究和發(fā)展納米銀標記物及其相應的顯色分析系統是十分有必要的。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種適用于IgG檢測的抗體修飾的納米銀試劑。
[0005]本發(fā)明還要解決的技術問題是提供包含上述納米銀材料的試劑盒，用于IgG的檢測。
[0006]本發(fā)明最后要解決的技術問題是提供上述試劑盒在檢測IgG中的應用。
[0007]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0008]一種抗體修飾的納米銀，它以直徑為10?30nm的納米銀球為內核，納米銀球外表面吸附有羊抗鼠IgG。
[0009]本發(fā)明還提供了上述抗體修飾的納米銀的制備方法，包括如下步驟:
[0010](I)在冰浴條件下,將聚乙烯卩比咯燒酮(Polyvinylpyrrolidone,PVP)溶液加入硼氫化鈉溶液中，攪拌并逐滴加入硝酸銀溶液，繼續(xù)攪拌至室溫，得納米銀溶液；
[0011](2)將羊抗鼠IgG抗體溶液加入至納米銀溶液中，于冰箱中過夜反應；
[0012](3)將步驟(2)反應體系的上清液離心，沉淀加入BSA緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟I?3次；最后離心得到的沉淀用lmg/mL BSA溶液重懸即得。
[0013]其中步驟(I)中，硝酸銀溶液濃度為2-20mmol/L ;硼氫化鈉溶液的濃度為3-30mmol/L ;聚乙烯吡咯烷酮的濃度為O?5%，優(yōu)選0.1?1% ;硝酸銀溶液、硼氫化鈉溶液、聚乙烯卩比咯燒酮(Polyvinylpyrrolidone, PVP)溶液的體積比為I: (1-10): (0-1),優(yōu)選1:(1-10):(0.1-1)。
[0014]步驟⑵中，羊抗鼠IgG抗體溶液的濃度為1-lOmg/mL ;羊抗鼠IgG抗體溶液與納米銀溶液的體積比為(0.1?10):10o
[0015]步驟(3)中，BSA緩沖溶液的濃度為lmg/mL，BSA緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的0.1?5倍。
[0016]本發(fā)明還提供了上述抗體修飾的納米銀在IgG檢測中的應用。
[0017]本發(fā)明還提供了一種用于檢測IgG的試劑盒，包括磷酸鹽緩沖液、羊抗鼠IgG、鏈霉親和素、銀增強試劑A和銀增強試劑B、牛血清白蛋白溶液、抗體修飾的納米銀。
[0018]本發(fā)明還提供了上述用于檢測IgG的試劑盒在檢測鼠IgG中的應用。
[0019]所述應用，包括以下步驟:
[0020](I)配制溶液:
[0021 ] 洗滌液:將20 X PBS用二次水稀釋20倍至I X PBS，加入0.05 %體積比的Tween-20即得PBST洗滌液；
[0022]探針和樣品稀釋液:將0.1g牛血清白蛋白溶解于10mLlXPBS溶液中即得Img/ml BSA ；
[0023]封閉液:將Ig牛血清白蛋白溶解于10mLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封閉液；
[0024]目標物:用lmg/ml BSA配制不同濃度的IgG ；
[0025]探針:用BSA溶液配制所需濃度的探針；
[0026]顯色液:將銀增強試劑A和銀增強試劑B按體積比1:1的混合液；
[0027](2)將目標物、陰性對照物、陽性對照物分別在醛基修飾的玻璃片上點樣，37°C條件下固定2-4h ；
[0028](3)每孔加入10?50μ L封閉液，在20_37°C條件下封閉I?3小時，用洗滌液蕩洗5?15min,洗漆3?4次,吹干；
[0029](4)每孔加入20?50 μ L納米銀-抗體探針，在20-37°C條件下反應10?60分鐘，用洗滌液蕩洗5?15min，洗滌3?4次，并用去離子水沖洗3?4次，吹干；
[0030](5)每孔加入20?50 μ L顯色液,避光反應5?20min,去離子水沖洗3?4遍，吹干；
[0031](6)用CCD生物芯片掃描儀掃描，根據得到的灰度值信號做標準曲線，得到IgG的線性范圍。
[0032]有益效果:利用本發(fā)明的納米銀-抗體進行IgG的檢測，相比納米金-抗體，具有靈敏度更高，檢測時間更短的優(yōu)勢，且此顯色方法操作簡單易行，檢測結果可視化，無需特殊昂貴的檢測儀器，目視即可達到孔內半定量檢測；成本低廉，可實現大批量檢測，適于推廣使用。
[0033]本發(fā)明通過兩種檢測IgG的方法的比較，第一種方法是以納米銀-抗體作為檢測探針，第二種方法是以納米金-抗體作為檢測探針，證明了納米銀-抗體作為檢測探針檢測的濃度范圍寬，顯色時間短，與目標物反應快。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為本發(fā)明抗體修飾的納米銀的制備及檢測鼠IgG的原理圖；
[0035]圖2為納米銀及本發(fā)明抗體修飾的納米銀的紫外-可見光譜圖(UV-Vis)；
[0036]圖3為本發(fā)明抗體修飾的納米銀的透射電鏡圖(TEM)；
[0037]圖4納米金-抗體檢測鼠IgG的結果圖，反應時間為30min ；
[0038]圖5為納米銀-抗體檢測鼠IgG的結果圖，反應時間為30min ；
[0039]圖6納米金-抗體檢測鼠IgG的結果圖，反應時間為15min ；
[0040]圖7及納米銀-抗體檢測鼠IgG的結果圖，反應時間為15min。

【具體實施方式】
[0041]根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
[0042]實施例1:抗體修飾的納米銀的制備。
[0043]在冰浴條件下，首先將2mL0.25% PVP加入至20mL3mmol/L硼氫化鈉溶液中，然后將10mL2mmol/L的硝酸銀溶液逐滴加入，不斷攪拌至反應完全，繼續(xù)攪拌至室溫，即可得到納米銀溶液。得到的納米銀的表征圖如圖2。
[0044]將2mg/mL50 μ L羊抗鼠IgG抗體加入至0.5mL納米銀溶液中，放于4°C冰箱過夜反應，取上清液離心，14°C 15000r/min20min離心后去除上清，沉淀加入BSA緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟2次,每次15minl4°C轉速為15000r/min,最后離心得到的沉淀用50 μ L BSA溶液重懸，即得，4°C保存。其中，BSA緩沖溶液的濃度為lmg/mL，BSA緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的I倍。
[0045]實施例2:抗體修飾的納米銀的制備。
[0046]在冰浴條件下，首先將2mLl % PVP加入至20mL3mmol/L硼氫化鈉溶液中，然后將2mL2mmol/L的硝酸銀溶液逐滴加入，不斷攪拌至反應完全，繼續(xù)攪拌至室溫，即可得到納米銀溶液。得到的納米銀的表征圖與圖2—致。
[0047]將4mg/mL50 μ L羊抗鼠IgG抗體加入至0.5mL納米銀溶液中，放于4°C冰箱過夜反應，取上清液離心，14°C 15000r/min20min離心后去除上清，沉淀加入BSA緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟2次,每次15minl4°C轉速為15000r/min,最后離心得到的沉淀用50 μ L BSA溶液重懸，即得，4°C保存。其中，BSA緩沖溶液的濃度為lmg/mL，BSA緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的3倍。
[0048]實施例3:抗體修飾的納米銀的制備。
[0049]在冰浴條件下，首先將2mL0.1 % PVP加入至20mL15mmol/L硼氫化鈉溶液中，然后將20mL10mmol/L的硝酸銀溶液逐滴加入，不斷攪拌至反應完全，繼續(xù)攪拌至室溫，即可得到納米銀溶液。得到的納米銀的表征圖與圖2—致。
[0050]將lmg/mL0.5mL羊抗鼠IgG抗體加入至0.5mL納米銀溶液中，放于4°C冰箱過夜反應，取上清液離心，14°C 15000r/min20min離心后去除上清，沉淀加入BSA緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟2次,每次15minl4°C轉速為15000r/min,最后離心得到的沉淀用1uL BSA溶液重懸，即得，4°C保存。其中，BSA緩沖溶液的濃度為lmg/mL，BSA緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的0.1倍。
[0051]實施例4:抗體修飾的納米銀的制備。
[0052]在冰浴條件下，首先將2mL5% PVP加入至20mL30mmol/L硼氫化鈉溶液中，然后將4mL20mmol/L的硝酸銀溶液逐滴加入，不斷攪拌至反應完全，繼續(xù)攪拌至室溫，即可得到納米銀溶液。得到的納米銀的表征圖與圖2—致。
[0053]將lOmg/mLlO μ L羊抗鼠IgG抗體加入至ImL納米銀溶液中，放于4°C冰箱過夜反應，取上清液離心，140C 15000r/min20min離心后去除上清，沉淀加入BSA緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟I次，15minl4°C轉速為15000r/min,最后離心得到的沉淀用50 μ LBSA溶液重懸，即得，4°C保存。其中，BSA緩沖溶液的濃度為lmg/mL，BSA緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的5倍。
[0054]實施例5:抗體修飾的納米銀的制備。
[0055]在冰浴條件下，將20mL3mmol/L的硝酸銀溶液逐滴加入至40mL2mmol/L硼氫化鈉溶液中，不斷攪拌至反應完全，繼續(xù)攪拌至室溫，即可得到納米銀溶液。得到的納米銀的表征圖與圖2 —致。
[0056]將2mg/mL50 μ L羊抗鼠IgG抗體加入至ImL納米銀溶液中，放于4°C冰箱過夜反應，取上清液離心，140C 15000r/min20min離心后去除上清，沉淀加入BSA緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟3次,每次15minl4°C轉速為15000r/min,最后離心得到的沉淀用50 μ L BSA溶液重懸，即得，4°C保存。其中，BSA緩沖溶液的濃度為lmg/mL，BSA緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的2倍。
[0057]實施例6:用于檢測IgG的試劑盒。
[0058]用于檢測IgG(bs_0296p)的試劑盒，該試劑盒包含如下試劑:
[0059]PBS (SB0627-500mL購自上海生工生物工程有限公司)及Tween-20 (T0777_500mL購自天津科美有限公司)用于配制洗滌液；
[0060]羊抗鼠IgG(bs_0296G)購自北京博奧森；
[0061]牛血清白蛋白(Roche738328)購自北京博奧森生物技術有限公司；
[0062]抗體修飾的納米銀(探針)實施例4或5的方法合成；
[0063]銀增強試劑A、B (顯色液，S5020-100mL, S5145_100mL)購自 Sigma-Aldrich ；
[0064]所有溶液均用高純水配制。
[0065]實施例7:檢測IgG的方法I。
[0066]利用實施例6的試劑盒檢測標準樣本中的IgG含量的方法:
[0067](I)探針和樣品稀釋液:將0.1g牛血清白蛋白溶解于10mL IXPBS溶液中即得lmg/ml BSA ；
[0068]封閉液:將Ig牛血清白蛋白溶解于10mLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封閉液；
[0069]目標物:用lmg/ml BSA配制不同濃度的IgG ；
[0070]對照物:用lmg/ml BSA配制所需濃度的納米金-抗體探針；
[0071]探針:用lmg/ml BSA配制所需濃度的納米銀-抗體探針。
[0072]顯色液:將銀增強試劑A和銀增強試劑B按體積比1:1的混合液；
[0073](2)將目標物、陰性對照物、陽性對照物分別在醛基修飾的玻璃片上點樣，37°C條件下固定3h ；
[0074](3)每孔加入30 μ L封閉液，在37°C條件下封閉I小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3次，吹干；
[0075](4)每孔加入30 μ L納米銀-抗體探針或者納米金-抗體探針,在37°C條件下反應30分鐘，用洗滌液蕩洗5，洗滌3次，并用去離子水沖洗3次，吹干；
[0076](5)每孔加入30 μ L顯色液,避光反應納米銀_抗體反應7min,納米金-抗體顯色1min,去離子水沖洗3遍,吹干；
[0077](6)用CCD生物芯片掃描儀掃描，根據得到的灰度值信號做標準曲線與通過納米金-抗體得到的標準曲線進行比較。
[0078]本實施例方法中，對兩種探針的檢測性能進行了考察，結果見圖4和5。其中，圖4為納米金-抗體的實驗數據；圖5為納米銀-抗體的檢測。從圖中可看出納米銀-抗體探針檢測的濃度范圍更低。
[0079]實施例8:檢測IgG的方法II。
[0080]利用實施例6的試劑盒檢測標準樣本中的IgG含量的方法:
[0081](I)探針和樣品稀釋液:將0.1g牛血清白蛋白溶解于10mL IXPBS溶液中即得lmg/ml BSA ；
[0082]封閉液:將Ig牛血清白蛋白溶解于10mLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封閉液；
[0083]目標物:用lmg/ml BSA配制不同濃度的IgG ；
[0084]對照物:用lmg/ml BSA配制所需濃度的納米金-抗體探針；
[0085]探針:用lmg/ml BSA配制所需濃度的納米銀-抗體探針。
[0086]顯色液:將銀增強試劑A和銀增強試劑B按體積比1:1的混合液；
[0087](2)將目標物、陰性對照物、陽性對照物分別在醛基修飾的玻璃片上點樣，37°C條件下固定3h ；
[0088](3)每孔加入30 μ L封閉液，在37°C條件下封閉I小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3次，吹干；
[0089](4)每孔加入30 μ L納米銀-抗體探針或者納米金-抗體探針,在37°C條件下反應15分鐘，用洗滌液蕩洗5，洗滌3次，并用去離子水沖洗3次，吹干；
[0090](5)每孔加入30 μ L顯色液,避光反應納米銀_抗體反應7min,納米金-抗體顯色9min,去離子水沖洗3遍,吹干；
[0091](6)用CCD生物芯片掃描儀掃描，根據得到的灰度值信號做標準曲線與通過納米金-抗體得到的標準曲線進行比較。
[0092]本實施例方法中，在減少與目標物反應時間的情況下，對兩種探針的檢測性能進行了考察，，結果見圖6和7。其中，圖6為納米金-抗體的實驗數據；圖7為納米銀-抗體的檢測。從圖中可看出納米銀-抗體探針檢測的濃度范圍更寬，線性關系更好，納米銀-抗體探針相比納米金-抗體探針具有明顯的優(yōu)勢。
【權利要求】
1.一種抗體修飾的納米銀，其特征在于:它以直徑為10?30nm的納米銀球為內核，納米銀球外表面吸附有羊抗鼠IgG。
2.權利要求1所述的一種抗體修飾的納米銀的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)在冰浴條件下，將聚乙烯吡咯烷酮溶液加入硼氫化鈉溶液中，攪拌并逐滴加入硝酸銀溶液，繼續(xù)攪拌至室溫，得納米銀溶液； (2)將羊抗鼠IgG抗體溶液加入至納米銀溶液中，于冰箱中過夜反應； (3)將步驟(2)反應體系的上清液離心，沉淀加入BSA緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟I?3次；最后離心得到的沉淀用lmg/mL BSA溶液重懸即得。
3.根據權利要求2所述的一種抗體修飾的納米銀的制備方法，其特征在于:步驟(I)中，硝酸銀溶液濃度為2-20mmol/L ;硼氫化鈉溶液的濃度為3-30mmol/L ;聚乙烯吡咯烷酮的濃度為O?5%;硝酸銀溶液、硼氫化鈉溶液、聚乙烯吡咯烷酮溶液的體積比為1:(1-10):(0-1)。
4.根據權利要求2所述的一種抗體修飾的納米銀的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，羊抗鼠IgG抗體溶液的濃度為1-lOmg/mL ;羊抗鼠IgG抗體溶液與納米銀溶液的體積比為(0.1 ?10):10ο
5.根據權利要求2所述的一種抗體修飾的納米銀的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，BSA緩沖溶液的濃度為lmg/mL，BSA緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的0.1?5倍。
6.權利要求1所述的抗體修飾的納米銀在IgG檢測中的應用。
7.一種用于檢測IgG的試劑盒，其特征在于:包括磷酸鹽緩沖液、羊抗鼠IgG、鏈霉親和素、銀增強試劑A和銀增強試劑B、牛血清白蛋白溶液、抗體修飾的納米銀。
8.權利要求7所述的用于檢測IgG的試劑盒在檢測鼠IgG中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于:包括以下步驟: (1)配制溶液: 洗滌液:將20 X PBS用二次水稀釋20倍至1XPBS，加入0.05%體積比的Tween-20即得PBST洗滌液； 探針和樣品稀釋液:將0.1g牛血清白蛋白溶解于10mLl XPBS溶液中即得lmg/mlBSA ； 封閉液:將Ig牛血清白蛋白溶解于10mLlXPBS溶液中即得10mg/ml BSA封閉液； 目標物:用lmg/ml BSA配制不同濃度的IgG ； 探針:用BSA溶液配制所需濃度的探針； 顯色液:將銀增強試劑A和銀增強試劑B按體積比1:1的混合液； (2)將目標物、陰性對照物、陽性對照物分別在醛基修飾的玻璃片上點樣，37°C條件下固定2-4h; (3)每孔加入10?5(^1^封閉液，在20-371:條件下封閉I?3小時，用洗滌液蕩洗5?15min,洗漆3?4次,吹干； (4)每孔加入20?50μ L納米銀-抗體探針，在20-37°C條件下反應10?60分鐘，用洗滌液蕩洗5?15min，洗滌3?4次，并用去離子水沖洗3?4次，吹干；(5)每孔加入20?50μ L顯色液,避光反應5?20min,去離子水沖洗3?4遍,吹干； (6)用CCD生物芯片掃描儀掃描，根據得到的灰度值信號做標準曲線，得到IgG的線性范圍。
【文檔編號】G01N33/552GK104237501SQ201410398798
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權日:2014年8月13日
【發(fā)明者】許丹科, 李慧, 牛奇奇 申請人:南京大學