單壁碳納米角-鉑鈀納米粒和巨細胞病毒pp65抗體修飾電極及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了單壁碳納米角-鉑鈀納米粒和巨細胞病毒pp65抗體修飾電極及其制備方法和應用，電極是由全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的單壁碳納米角處理后吸附硫堇，然后結合單壁碳納米角-鉑鈀納米粒，再孵育巨細胞病毒pp65抗體，最后用辣根過氧化物酶(HRP)封閉，制得的電極結合有殼聚糖修飾后的單壁碳納米角，由于單壁碳納米角具有大的比表面積和良好的生物相容性，氨基修飾后進一步有利于穩(wěn)定鉑、鈀粒子，提高巨細胞病毒pp65抗體的結合量，增加其峰電流值，同時鉑、鈀納米粒子及HRP能催化過氧化氫放大檢測信號，從而提高檢測低濃度巨細胞病毒抗原的靈敏度。
【專利說明】單壁碳納米角-鉑鈀納米粒和巨細胞病毒pp65抗體修飾電極及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于診斷領域，具體涉及單壁碳納米角-鉬鈀納米粒和巨細胞病毒PP65抗體修飾電極，還涉及該電極的制備方法和應用。

【背景技術】
[0002]巨細胞病毒(Cyt0mega0ViruS，CMV)是皰疹病毒家族，具有嚴格的種屬特異性。在發(fā)達國家成人CMV的隱形感染率40%?90%，我國CMV的隱形感染率高達90%左右。CMV是導致胎兒先天性感染的最常見的病原體。流行病學調(diào)查結果顯示，約0.5%?2.5%新生兒中感染過CMV。感染CMV的孕婦可通過胎盤、產(chǎn)道、哺乳方式垂直傳播給胎兒或新生兒，也可通過親密接觸進行水平傳播，最終導致胎兒畸形、新生兒智力低下或發(fā)育遲緩；CMV亦可通過輸血和器官移植傳播，是免疫功能低下的艾滋病患者、腫瘤患者死亡的主要原因，是導致器官移植失敗的重要原因之一。多項研究表明，CMV感染還與動脈粥樣硬化等多種疾病有關，所以CMV的檢測顯得尤為重要。CMV pp65抗原是CMV活動性感染的早期標志物，主要存在于人類肝細胞，血管內(nèi)皮細胞，膽管內(nèi)皮細胞，外周血白細胞中，可作為檢測CMV活動性感染的指標。
[0003]現(xiàn)有的檢測方法主要包括細胞培養(yǎng)、病毒學檢測、免疫檢測，核酸檢測等，其中細胞培養(yǎng)是診斷CMV感染的金標準，但是這些方法均存在著操作繁瑣，檢測效率低，特異性差等缺點。例如，細胞培養(yǎng)耗費大，對技術人員要求高，臨床應用受限；病毒學檢查需從受檢者的血、尿、唾液或組織等中分離并培養(yǎng)出CMV，操作過程費時費力；血清學CMV IgG、IgM抗體檢測特異性差，對新生兒或嚴重免疫缺陷者可能存在假陰性，并且會受類風濕因子等干擾；分子生物學核酸檢測則需專業(yè)人員和特殊儀器來完成，費用高，并且無法區(qū)分潛伏性感染。因此，人們急需一種靈敏度高，特異性好，快速和準確的檢測CMV的電化學免疫傳感器，這對優(yōu)生優(yōu)育，監(jiān)控疾病進展及成功移植器官具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供單壁碳納米角-鉬鈀納米粒(Pt-PdNPsOSffCNHs)和CMV pp65抗體修飾電極；本發(fā)明的目的之二在于提供上述Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極的制備方法；本發(fā)明的目的之三在于提供含有Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極的電化學傳感器，本發(fā)明的目的之四在于提供利用上述電化學生物傳感器檢測CMV pp65抗原的方法。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術方案:
[0006]1.Pt-PdNPsiSffCNHs和CMVpp65抗體修飾電極，所述電極是由全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜(Naf1n，Nf)分散的SWCNHs處理后吸附硫堇(Th1nine，Thi)，然后結合Pt-PdNPs@SWCNHs，再用CMV pp65抗體孵育、HRP封閉非特異結合位點即可。
[0007]優(yōu)選的，所述全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的單壁碳納米角(SWCNHs-Nf)由以下方法制備:將SffCNHs加入Nf中，超聲攪拌過夜制得。
[0008]更優(yōu)選的，所述Pt-PdNPs@SWCNHs由以下方法制備:向殼聚糖(Chitosan，CS)溶液中加入SWCNHs，超聲分散后離心，沉淀物用雙蒸水洗滌后分散于雙蒸水中，再向其中加入H2PtCl6和K2PdCl4,攪拌，然后滴加硼氫化鈉(NaBH4)，超聲、離心、洗滌沉淀，將沉淀用雙蒸水分散即可。
[0009]2.所述Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極的制備方法，包括如下步驟:
[0010]a.將玻碳電極表面打磨，拋光，干燥，得預處理的電極；
[0011]b.將步驟a所得預處理的電極用SWCNHs-Nf修飾，23?26°C干燥，得SWCNHs-Nf修飾的電極；所述SWCNHs-Nf由將SWCNHs加入Nf中，超聲攪拌過夜制得；
[0012]C.將b步驟所得SWCNHs-Nf修飾的電極上吸附Thi，然后雙蒸水清洗；
[0013]d.將步驟c所得電極上吸附Pt-PdNPs@SWCNHs，然后用雙蒸水清洗，得Pt-PdNPsOSffCNHs修飾的電極；所述Pt-PdNPs@SWCNHs由如下方法制備:向CS溶液中加入SWCNHs，超聲分散后離心，沉淀物用雙蒸水洗滌后分散于雙蒸水中，再向其中加入H2PtCl6和K2PdCl4,攪拌，然后滴加NaBH4，超聲、離心、洗滌沉淀，將沉淀用雙蒸水分散即可；
[0014]e.將步驟d所得Pt-PdNPs@SWCNHs修飾的電極上孵育CMV pp65抗體；然后用HRP封閉非特異性位點，制得Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極。
[0015]3.含有所述Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極的電化學生物傳感器。
[0016]優(yōu)選的，所述的電化學生物傳感器包括工作電極、對電極、參比電極和測試底液；所述工作電極為所述Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極，所述對電極為鉬電極，所述參比電極為飽和甘汞電極；所述測試底液為含有0.lmol/L KCl、pH為5.5的濃度為
0.1mol/LHAc-NaAc 溶液。
[0017]4.利用所述電化學生物傳感器檢測CMV抗原的方法，包括如下步驟^fPt-PdNPsIgSWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極與樣品溶液共孵育；然后以Pt_PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極為工作電極、鉬電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極電位，含有0.lmol/LKCUpH 5.5，濃度為0.lmol/L HAc-NaAc溶液為測試底液構建電化學生物傳感器，采用差分脈沖伏安法(DPV)進行掃描測定，電位掃描范圍為-0.5V-0.0V，根據(jù)電位-0.252V處峰電流和CMV pp65抗原標準曲線計算樣品中CMV抗原的濃度。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:公開了 Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極，通過在電極上結合SWCNHs，并將SWCNHs進行氨基化，再在表面固定鉬、鈀粒子，由于SWCNHs本身具有大的比表面積和和良好的生物相容性，氨基化的SWCNHs上擁有豐富的氨基有利于穩(wěn)定鉬、鈀粒子，為CMV pp65抗體提供良好的生物學環(huán)境，最終使電極表面的CMV pp65抗體的固載量成倍增加，提高CMV pp65抗體的結合量，增加其峰電流值，同時鉬、鈀納米粒子及HRP能催化過氧化氫(H2O2)放大檢測信號，從而提高檢測低濃度CMV pp65抗原的靈敏度，最低檢測限為30pg/mL。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0020]圖1為Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極的制作示意圖。
[0021]圖2為電極所修飾的納米材料的掃描電鏡圖(A =SffCNHs-Nf ；B =SffCNHs-CS ；C:Pt-PdNPsiSffCNHs)。
[0022]圖3為電極制備過程的循環(huán)伏安法(CV)表征圖(a:玻碳裸電極；b =SffCNHs-Nf修飾的玻碳電極；c:吸附活性物質Thi后的SWCNHs-Nf修飾的玻碳電極；d =Pt-PdNPsiSffCNHs修飾玻碳電極；e:結合CMV pp65抗體的玻碳電極；f:HRP封閉后的玻碳電極；g:Pt-PdNPsiSffCNHs和CMV pp65抗體修飾電極檢測CMV pp65抗原)。
[0023]圖4為分別以HRP和牛血清白蛋白(Bull Serum Albumin, BSA)作為封閉劑檢測不同濃度CMV pp65抗原的DPV曲線和標準曲線(A:HRP作為封閉劑檢測不同濃度CMV pp65抗原的DPV曲線；B:BSA作為封閉劑檢測不同濃度CMV pp65抗原的DPV曲線；a為HRP作為封閉劑的標準曲線；b為BSA作為封閉劑的標準曲線)。

【具體實施方式】
[0024]下面將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0025]本發(fā)明實施例中使用的主要儀器與試劑:CHI660A型電化學工作站購自上海晨輝儀器有限公司；掃描電鏡購自日本日立公司；CMV pp65抗原和CMV pp65抗體購自英國Abcam 公司；SWCNHs 購自深圳奈米港口有限公司；H2PtCl6.6Η20, K2PdCl4, Thi, Nf, CS, NaBH4,BSA購自美國Sigma公司。
[0026]實施例1
[0027]Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極的制備方法，制備原理如圖1所示，包括如下步驟:
[0028]a.將玻碳電極表面打磨，拋光，干燥，得預處理的電極；
[0029]b.將步驟a所得預處理的電極滴加5 μ L濃度為0.5mg/mL的SWCNHs-Nf懸液，23?26°C干燥，得SWCNHs-Nf修飾的電極；其中SWCNHs-Nf懸液由Img SffCNHs加入2mL質量分數(shù)為1% Nf分散劑，超聲攪拌過夜后制得；
[0030]c.將b步驟所得SWCNHs-Nf修飾的電極上滴加20 μ L濃度為0.5mg/mL的Thi，吸附15min后用雙蒸水清洗；
[0031 ] d.將步驟c所得電極上滴加20 μ L Pt-PdNPsiSffCNHs懸液，吸附16h后用雙蒸水清洗，得Pt-PdNPs@SWCNHs修飾的電極；其中Pt-PdNPs@SWCNHs懸液由如下方法制備:向2mL質量分數(shù)為0.1 %的CS溶液中加入Img的SWCNHs，超聲分散4h后離心，雙蒸水洗滌3次，沉淀物分散于ImL雙蒸水中，再向其中加入ImL質量分數(shù)為0.5%的H2PtCl6和ImL質量分數(shù)為0.5%的K2PdCl4,攪拌24h，緩慢逐滴加1mL濃度為0.01mol/L的NaBH4,再繼續(xù)超聲lh，離心洗滌沉淀，最后將沉淀用2mL雙蒸水分散，制得Pt-PdNPsOSWCNHs懸液；
[0032]e.將步驟d所得Pt-PdNPs@SWCNHs修飾的電極上滴加1yL濃度為30 μ g/mL的CMV pp65抗體，4°C過夜；然后向電極上滴加10 μ L質量分數(shù)為0.25% HRP，4°C孵育3h，封閉非特異性位點，制得Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極。
[0033]制得的Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極是由SWCNHs-Nf滴于干凈電極表面，再吸附Thi，然后連接上自主合成的Pt-PdNPsOSWCNHs，再用CMV pp65抗體孵育，最后用HRP封閉非特異性位點即可。
[0034]將制得的Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極用掃描電鏡進行了表征，結果如圖2中所示，A為SWCNHs-Nf，可以看出SWCNHs在Nf的作用下不規(guī)則的聚集起來，表面光滑但有模糊感為CS分散的單壁碳納米角(SWCNHs-CS)，圖中明顯看出CS聚集了更多的SWCNHs，并且材料表面呈毛玻璃狀，形成朦朧的表面，說明CS上的氨基成功的修飾在了SffCNHs上；C為Pt-PdNPs@SWCNHs，可以看出CS分散的SWCNHs表面隨機地分散著許多亮點結構，并在重疊聚集區(qū)形成強光區(qū)，說明Pt-PdNPsOSWCNHs復合材料的合成是成功的，這種貫穿的網(wǎng)狀結構將為電子提供快捷的傳導通路，為固定抗體提供更大的比表面積。
[0035]實施例2
[0036]檢測CMV pp65抗原的電化學生物傳感器，包括工作電極、對電極、參比電極和測試底液。其中所述工作電極為實施例1制得Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極，對電極為鉬電極，參比電極為飽和甘汞電極，測試底液為含有0.lmol/L KCl濃度為0.lmol/LHAc-NaAc 溶液(pH 5.5)。
[0037]Pt-PdNPsiSffCNHs和CMV pp65抗體修飾電極制備過程中電流的變化，用CV曲線表征。按上述條件分別測定裸玻碳電極、SffCNHs-Nf修飾的玻碳電極、Thi吸附SWCNHs-Nf修飾的玻碳電極、Pt-PdNPsiSffCNHs結合Thi吸附SWCNHs-Nf修飾的玻碳電極、CMV pp65抗體孵育Pt-PdNPs@SWCNHs修飾后的玻碳電極、HRP封閉抗體孵育后的Pt-PdNPs@SWCNHs修飾的玻碳電極、CMV pp65抗原結合Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極的電流變化，并根據(jù)峰電流變化繪制CV曲線(圖3)。如圖3所示，在檢測底液中，裸玻碳電極無氧化還原峰(a) ;SWCNHs-Nf修飾的玻碳電極也沒有氧化還原峰(b);但吸附活性物質Thi后的SWCNHs-Nf修飾的玻碳電極出現(xiàn)了明顯的氧化還原峰(c)，氧化峰峰值達60 μ A左右，明顯較Nf膜修飾玻碳電極并吸附Thi后所得峰值增加(見圖3左上角)；Pt-PdNPS@SWCNHS修飾電極后，由于材料本身位阻和CS阻礙電子傳遞的原因，峰電流降低約20μ A(d);在電極結合CMV pp65抗體后，由于抗體蛋白質阻礙電子傳遞，峰電流進一步降低(e) ；HRP孵育后，封閉了非特異性位點，同時也阻礙了電子傳遞，因此傳感器峰電流值繼續(xù)減低(f);最后，制得的Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極在加入CMV pp65抗原孵育后，由于電極表面生成蛋白質大分子CMV pp65抗原和抗體的復合物，嚴重阻礙了電極表面的電子傳輸，所以傳感器峰電流值降到了最低(g)。因此，圖3表明了 Pt-PdNPsOSWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極制備是成功的。
[0038]利用檢測CMV pp65抗原的電化學生物傳感器檢測CMV pp65抗原，具體方法為:將Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極與樣品溶液共4°C孵育Ih ;采用CV進行測定，電位掃描范圍為-0.2V — 0.6V，電位掃描速度為50mV/s，根據(jù)CV曲線判斷電極的修飾情況。采用DPV進行掃描測定，電位掃描范圍為-0.5V-0.0V，根據(jù)電位-0.252V處峰電流和CMV pp65抗原標準曲線計算樣品中CMV pp65抗原的濃度。
[0039]在上述檢測條件下，檢測不同濃度的CMV pp65抗原，結果如圖4中A所示，其標準曲線如a所示。結果可以看出，CMV濃度在0.1ng/mL?100ng/mL的范圍時,其濃度與峰電流呈良好的線性關系，其線性回歸方程為:y = 0.410x-65.697，相關系數(shù)為0.994，最低檢測限為30pg/mL。
[0040]然后按照實施例1的方法制備Pt-PdNPs@SWCNHs和CMV pp65抗體修飾電極，區(qū)別在于使用BSA作封閉劑，再以制得的電極構建檢測CMV抗原的電化學生物傳感器，檢測不同濃度的CMV pp65抗原，結果如圖4中B所示，其標準曲線如b所示。結果可以看出，CMV的濃度在0.5ng/mL?100ng/mL間，線性回歸方程為:y = 0.331χ-51.683，相關系數(shù)為0.993，最低檢測限為100pg/mL。
[0041]上述結果表明使用封閉劑HRP的同時，其可與鉬、鈀納米粒子共同催化H2O2放大檢測信號，比用BSA封閉時，僅有鉬鈀納米粒子催化H2O2獲得的信號大，具有更寬的線性范圍和更低的檢出限。因此，以HRP作為封閉劑時效果更佳。
[0042]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.單壁碳納米角-鉬鈀納米粒和巨細胞病毒PP65抗體修飾電極，其特征在于:所述電極是由全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的單壁碳納米角處理后吸附硫堇，然后結合單壁碳納米角-鉬鈀納米粒，再用巨細胞病毒PP65抗體孵育、辣根過氧化物酶封閉非特異結合位點即可。
2.根據(jù)權利要求1所述單壁碳納米角-鉬鈀納米粒和巨細胞病毒PP65抗體修飾電極，其特征在于，所述全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的單壁碳納米角由以下方法制備:將單壁碳納米角加入全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜中，超聲攪拌過夜制得。
3.根據(jù)權利要求1所述單壁碳納米角-鉬鈀納米粒和巨細胞病毒PP65抗體修飾電極，其特征在于，所述單壁碳納米角-鉬鈀納米粒由以下方法制備:向殼聚糖溶液中加入單壁碳納米角，超聲分散后離心，沉淀物用雙蒸水洗滌后分散于雙蒸水中，再向其中加入H2PtCl6和K2PdCl4，攪拌，然后滴加NaBH4，超聲、離心、洗滌沉淀，將沉淀用雙蒸水分散即可。
4.權利要求1-3任意項所述單壁碳納米角-鉬鈕納米粒和巨細胞病毒pp65抗體修飾電極的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: a.將玻碳電極表面打磨，拋光，干燥，得預處理的電極； b.將步驟a所得預處理的電極用全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的單壁碳納米角修飾，23?26°C干燥，得全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的單壁碳納米角修飾的電極；所述全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的單壁碳納米角由單壁碳納米角加入全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜中，超聲攪拌過夜制得； c.將b步驟所得全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的單壁碳納米角修飾的電極上吸附硫堇，然后雙蒸水清洗； d.將步驟C所得電極上吸附單壁碳納米角-鉬鈀納米粒，然后用雙蒸水清洗，得單壁碳納米角-鉬鈕納米粒修飾的電極；所述單壁碳納米角-鉬鈕納米粒由如下方法制備:向殼聚糖溶液中加入單壁碳納米角，超聲分散后離心，沉淀物用雙蒸水洗滌后分散于雙蒸水中，再向其中加入H2PtCl6和K2PdCl4，攪拌，然后滴加NaBH4，超聲、離心、洗滌沉淀，將沉淀用雙蒸水分散即可； e.將步驟d所得單壁碳納米角-鉬鈀納米粒修飾的電極上孵育巨細胞病毒pp65抗體；然后用辣根過氧化物酶封閉非特異性位點，制得單壁碳納米角-鉬鈀納米粒和巨細胞病毒pp65抗體修飾電極。
5.含有權利要求1-3任意項所述單壁碳納米角-鉬鈀納米粒和巨細胞病毒pp65抗體修飾電極的電化學生物傳感器。
6.根據(jù)權利要求5所述的電化學生物傳感器,其特征在于:包括工作電極、對電極、參比電極和測試底液；所述工作電極為所述單壁碳納米角-鉬鈀納米粒和巨細胞病毒PP65抗體修飾電極，所述對電極為鉬電極，所述參比電極為飽和甘汞電極；所述測試底液為含有．0.lmol/LKCl.pH為5.5的濃度為0.lmol/L醋酸-醋酸鈉溶液。
7.利用權利要求5或6所述電化學生物傳感器檢測巨細胞病毒抗原的方法，其特征在于，包括如下步驟:將單壁碳納米角-鉬鈀納米粒和巨細胞病毒PP65抗體修飾電極與樣品溶液共孵育；然后以單壁碳納米角-鉬鈀納米粒和巨細胞病毒PP65抗體修飾電極為工作電極、鉬電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，含有0.lmol/L KCl、pH為5.5的濃度為．0.lmol/L醋酸-醋酸鈉溶液為測試底液構建電化學生物傳感器，采用差分脈沖伏安法進行掃描測定，電位掃描范圍為-0.5V-0.0V，根據(jù)電位-0.252V處峰電流和巨細胞病毒抗原標準曲線計算樣品中巨細胞病毒抗原的濃度。
【文檔編號】G01N27/327GK104132984SQ201410411398
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權日:2014年8月20日
【發(fā)明者】黃微微, 蒲曉允, 張立群, 蔣棟能, 劉飛 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院