一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法
【專利摘要】一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，包括以下步驟：將黃龍病感病的蕓香科柑橘亞科植物葉片表皮夾在受體室和供體室之間，用硅膠密封固定；在受體室中加入含有待檢測(cè)滲透劑的硼酸緩沖液；在供體室中加入含有標(biāo)記物檸檬酸緩沖液；將該裝置放置暗處并在搖床上進(jìn)行滲透；分別在放置后的0min、15min、30min、45min和60min，測(cè)定受體室中標(biāo)記物的含量，并根據(jù)公式P＝F/cA計(jì)算出滲透參數(shù)P的值。本發(fā)明的檢測(cè)方法利用了黃龍病感病的蕓香科柑橘亞科植物葉片表皮的特性，步驟簡(jiǎn)單，可靠性高，可以快速?gòu)谋姸酀B透劑中篩選出一種高效滲透劑，有助于提高藥物的透皮運(yùn)輸效率，提高柑橘黃龍病的防治效果。
【專利說明】一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 柑橘黃龍病是世界柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害，是由一種限于韌皮部?jī)?nèi)寄生的革蘭 氏陰性細(xì)菌（Ca. Liberibacter)引起,能夠侵染包括柑橘屬、積屬、金柑屬和九里香等多種 蕓香科植物。柑橘感染黃龍病后形成均勻黃化型或者斑駁型黃稍，后期則呈現(xiàn)缺鋅花葉等 一系列典型病癥，表現(xiàn)為經(jīng)濟(jì)壽命短、產(chǎn)量低、果實(shí)品質(zhì)劣，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 自20世紀(jì)初在我國(guó)華南地區(qū)首次報(bào)道以來，在世界各大柑橘產(chǎn)區(qū)相繼發(fā)生，特別 對(duì)世界主要的兩大柑橘主產(chǎn)區(qū)美國(guó)佛羅里達(dá)州和巴西圣保羅州的柑橘產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì) 損失。目前，該病主要分布在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50個(gè)國(guó)家和地區(qū)，中 國(guó)19個(gè)柑橘生產(chǎn)?。ㄊ?、自治區(qū)）中已有11個(gè)受到該病危害，其面積占柑橘總栽培面積的 80%以上、產(chǎn)量占總產(chǎn)量的85%左右，嚴(yán)重制約柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。
[0004] 化學(xué)治療被認(rèn)為是一種防治柑橘黃龍病的有效手段，通過葉面噴施藥物防治作物 病害已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。但是由于柑橘黃龍病病原菌寄生于柑橘韌皮部?jī)?nèi)，有效藥物必 須透過柑橘葉片表皮，才能進(jìn)入柑橘韌皮部?jī)?nèi)。柑橘葉片表皮主要由蠟質(zhì)層、幾丁質(zhì)層和果 膠層組成，其中表皮蠟質(zhì)是覆蓋在葉片表面的一層疏水屏障，阻礙外界物質(zhì)透過葉片表皮 進(jìn)入柑橘體內(nèi)。滲透劑能夠改變表皮蠟層的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、增加葉片表面張力，從而提高其表 皮的滲透能力。因此，使用滲透劑作為輔劑，改變柑橘表皮蠟質(zhì)的性質(zhì)，能有效提高藥物透 過表皮運(yùn)輸?shù)礁涕夙g皮部的效率。
[0005] 目前未見有適用于黃龍病感病植株葉片表皮滲透劑應(yīng)用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本領(lǐng)域 技術(shù)人員長(zhǎng)期希望找到一種檢測(cè)防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的方法和指標(biāo)，用于快 速、準(zhǔn)確、有效地篩選出具有強(qiáng)大黃龍病感病植株葉片表皮滲透能力的滲透劑，應(yīng)用于有效 藥物的透皮轉(zhuǎn)運(yùn)，以達(dá)到防治黃龍病的最終目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的 方法和指標(biāo)，用于快速、準(zhǔn)確、有效地篩選出具有強(qiáng)大黃龍病感病植株葉片表皮滲透能力的 滲透劑，應(yīng)用于有效藥物的透皮轉(zhuǎn)運(yùn)，達(dá)到防治黃龍病的最終目的。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0008] -種滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0009] (1)用黃龍病感病的蕓香科柑橘亞科植物葉片表皮將一個(gè)容器隔離成兩個(gè)互相獨(dú) 立的腔室，用硅膠密封固定葉片表皮與容器連接處，兩個(gè)互相獨(dú)立的腔室一個(gè)作為供體室， 另一個(gè)作為受體室；
[0010] (2)在受體室中加入含有滲透劑的硼酸緩沖液；
[0011] (3)在供體室中加入含有標(biāo)記物的檸檬酸緩沖液；
[0012] (4)將該裝置放置暗處，并在搖床上進(jìn)行滲透；
[0013] (5)分別在放置后的Omin、15min、30min、45min和60min,利用分光光度計(jì)測(cè)定受 體室中標(biāo)記物的含量，并根據(jù)公式（a)計(jì)算出滲透參數(shù)P的值，
[0014] P = F/cA (a)
[0015] 其中，P為滲透參數(shù)；F為標(biāo)記物透皮運(yùn)輸?shù)木€性斜率；c表示供體室中標(biāo)記物的濃 度，單位為mol · cnT3 ;A為分離表皮在滲透系統(tǒng)中的實(shí)際面積，單位為cm2 ;
[0016] (6)滲透參數(shù)P的值用于評(píng)價(jià)滲透劑的滲透效能，P值越大，則滲透劑滲透效能越 好。
[0017] 所述柑橘葉片表皮通過如下方法分離：
[0018] 選取黃龍病感病的蕓香科柑橘亞科植物葉片，將該葉片完全浸沒在50mM、pH值為 4. 0的檸檬酸緩沖液中培養(yǎng)，直到表皮完全從葉片分離，再用50mM、pH值為4. 0的檸檬酸緩 沖液將離體表皮漂洗干凈，并晾干。
[0019] 所述檸檬酸緩沖液含有2%的果膠酶和0. 2%的纖維素酶。
[0020] 所述硼酸緩沖液的濃度為50?100mM，硼酸緩沖液的pH值為8. 0?10. 0。
[0021] 所述檸檬酸緩沖液的濃度為10?20mM，檸檬酸緩沖液的pH值為2. 0?4. 0。
[0022] 所述標(biāo)記物為4-硝基酚。
[0023] 利用分光光度計(jì)測(cè)定受體室中4-硝基酚的含量時(shí)，選擇波長(zhǎng)為399nm。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具備的有益效果：
[0025] 針對(duì)黃龍病感病的蕓香科柑橘亞科植物葉片表皮的特性，提供一種檢測(cè)防治柑橘 黃龍病的滲透劑滲透效能的方法，該方法步驟簡(jiǎn)單，試劑易于配制，滲透效能指標(biāo)的可靠性 高，可以快速?gòu)谋姸酀B透劑中篩選出一種高效滲透劑，有助于提高藥物的透皮運(yùn)輸效率，提 高柑橘黃龍病的防治效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明所述檢測(cè)方法使用的一個(gè)滲透裝置。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面通過實(shí)施例，結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 1.葉片表皮的分離
[0030] 采取黃龍病感病的檸檬葉片，利用直徑為7mm的打孔器，獲得直徑為7mm的葉圓 片，將該葉圓片完全浸沒在50mM、pH值為4. 0的含有2%果膠酶和0. 2%纖維素酶的檸檬酸 緩沖液培養(yǎng)。待表皮完全從葉片分離后，用pH值為4. 0的檸檬酸緩沖液將表皮漂洗干凈， 并晾干。
[0031] 2.滲透劑滲透效能的檢測(cè)
[0032] (1)將由步驟1獲得的黃龍病感病的檸檬葉圓片表皮放置在滲透裝置隔板上的通 孔3上，將該滲透裝置隔離出兩個(gè)互相獨(dú)立的腔室，用硅膠密封固定葉片表皮與容器連接 處，兩個(gè)互相獨(dú)立的腔室一個(gè)作為供體室1，另一個(gè)作為受體室2 ;
[0033] (2)在受體室2中加入2ml含0. 1 %滲透劑的lOOmM、pH值為9. 0的硼酸緩沖液。 滲透劑分別為Brij35, Brij58, Brij98,二甲基亞砜，N-甲基吡咯烷酮，尿素，氮酮和油酸。
[0034] (3)在供體室1中加入200 μ 1含15mM的4-硝基酚的10mM檸檬酸緩沖液，上述檸 檬酸緩沖液的pH值為3. 0 ;
[0035] (4)然后將該滲透裝置放置暗處，并在轉(zhuǎn)速為60rpm的搖床上進(jìn)行滲透，
[0036] (5)分別在放置后0、15、30、45和60min，利用分光光度計(jì)（DU640)于波長(zhǎng)399處 測(cè)定受體室2中4-硝基酚的含量，并根據(jù)公式（a)計(jì)算出滲透參數(shù)P的值，P值用于評(píng)價(jià) 滲透劑的滲透效能，P值越大，則滲透劑滲透效能越好。
[0037] P = F/cA (a)
[0038] 其中，P為滲透參數(shù)；F為4-硝基酚透皮運(yùn)輸?shù)木€性斜率；c表示供體室1中標(biāo)記 物的濃度，單位為mol κπΓ2 ;A為分離表皮在滲透裝置中的實(shí)際有效面積，即為通孔的面積， 單位為cm2。
[0039] 利用上述方法對(duì)不同滲透劑進(jìn)行了檢測(cè)，獲得的滲透參數(shù)如表1所示，從表1可以 看出，滲透劑Brij35的P值為1. 841，與空白對(duì)照相比，增加3. 34倍，其P值和增加的倍數(shù) 在所有滲透劑中最高，因此，檢測(cè)表明Brij35是一種高效的理想滲透劑。
[0040] 表1 :不同滲透劑的滲透參數(shù)P值比較
[0041]
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 用黃龍病感病的蕓香科柑橘亞科植物葉片表皮將一個(gè)容器隔離成兩個(gè)互相獨(dú)立的 腔室，用硅膠密封固定葉片表皮與容器連接處，兩個(gè)互相獨(dú)立的腔室一個(gè)作為供體室，另一 個(gè)作為受體室； (2) 在受體室中加入含有待檢測(cè)滲透劑的硼酸緩沖液； (3) 在供體室中加入含有標(biāo)記物的檸檬酸緩沖液； (4) 將該滲透裝置放置暗處，并在搖床上進(jìn)行滲透； (5) 分別在放置后的0min、15min、30min、45min和60min,利用分光光度計(jì)測(cè)定受體室 中標(biāo)記物的含量，并根據(jù)公式（a)計(jì)算出滲透參數(shù)P的值： P = F/cA (a) 其中，P為滲透參數(shù)；F為標(biāo)記物透皮運(yùn)輸?shù)木€性斜率；c表示供體室中標(biāo)記物的濃度， 單位為mol · cnT2 ;A為分離表皮在滲透系統(tǒng)中的實(shí)際面積，單位為cm2 ; (6) 滲透參數(shù)P值用于評(píng)價(jià)滲透劑的滲透效能，P值越大，則滲透劑滲透效能越好。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述蕓香科柑橘亞科植物葉片表皮通過如下方法分離：選取黃龍病感病的蕓香科柑橘 亞科植物葉片，將該葉片完全浸沒在50mM、pH值為4. 0的檸檬酸緩沖液中培養(yǎng)，直到表皮完 全從葉片分離，再用50mM、pH值為4. 0的檸檬酸緩沖液將離體表皮漂洗干凈，并晾干。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，其特征 在于，所述檸檬酸緩沖液含有2%的果膠酶和0. 2%的纖維素酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述硼酸緩沖液的濃度為50?100mM，硼酸緩沖液的pH值為8. 0?10. 0。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述檸檬酸緩沖液的濃度為10?20mM，檸檬酸緩沖液的pH值為2. 0?4. 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述標(biāo)記物為4-硝基酚。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測(cè)方法，其特征在 于，利用分光光度計(jì)測(cè)定受體室中4-硝基酚的含量時(shí)，選擇波長(zhǎng)為399nm。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104266980SQ201410414436
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月21日
【發(fā)明者】張木清, 楊川毓 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)