一種激酶通路相關(guān)“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物及定量檢測(cè)技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種激酶通路相關(guān)“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物及定量檢測(cè)技術(shù)。該組合式標(biāo)志物中的多肽具有如SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列，該組合式標(biāo)志物中的蛋白具有如SEQ?ID?NO:3所示氨基酸序列，該組合式標(biāo)志物中的多肽位于蛋白的D4和D5功能域。該組合式標(biāo)志物存在于人體代謝的K-K激酶通路中，其含量和存在形式與腫瘤代謝進(jìn)程密切相關(guān)。本發(fā)明還提供了該組合式標(biāo)志物的檢測(cè)技術(shù)，驗(yàn)證了本發(fā)明中的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物在6種惡性腫瘤樣本中的含量顯著高于正常樣本。本發(fā)明中的組合式標(biāo)志物能更精確反映樣本中標(biāo)志物的表達(dá)情況，具有更高的特異性和準(zhǔn)確度。
【專利說明】一種激酶通路相關(guān)“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物及定量檢測(cè)技術(shù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種激酶通路相關(guān)“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物及定量檢測(cè)技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤作為全球較大的公共衛(wèi)生問題之一，極大的危害人類的健康，并將成為新世紀(jì)人類第一殺手。目前，對(duì)腫瘤的治療方法和手段日漸豐富，腫瘤切除和器官移植仍然是腫瘤患者治療的主要方法。然而早期腫瘤具有發(fā)病隱匿、無明顯癥狀的特點(diǎn)，多數(shù)腫瘤患者就診時(shí)已失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是降低癌癥死亡率的重要措施。
[0003]目前可用于腫瘤輔助診斷的生物標(biāo)志物主要包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、激素、受體和RNA分子，主要存在于血清、血漿、尿和組織等生物樣本中。機(jī)體中的蛋白通過不同酶降解產(chǎn)生的各種大小不一、氨基酸序列不同的蛋白碎片，稱為多肽。多肽分子量普遍偏小，可順暢通過胞膜，由組織或器官進(jìn)入到血液循環(huán)中，未與蛋白完全解離的部分多肽也跟隨蛋白一同進(jìn)入血清中。這些解離或未完全解離的多肽統(tǒng)稱為血清多肽。當(dāng)機(jī)體發(fā)生病變甚至是癌變時(shí)，干擾了正常的蛋白代謝，刺激了酶降解蛋白形成多肽的進(jìn)程，也打破了血清多肽在機(jī)體內(nèi)存在的平衡。通過血清多肽圖譜(血肽圖)分析可找出與機(jī)體病變相關(guān)血清多肽，這些血清多肽就成為了研究某些疾病的潛在標(biāo)志物，稱之為血清多肽標(biāo)志物，蘊(yùn)含著豐富的疾病代謝信息。當(dāng)生理狀態(tài)發(fā)生變化，特別是向腫瘤狀態(tài)轉(zhuǎn)化時(shí)，蛋白代謝發(fā)生改變，導(dǎo)致多肽也發(fā)生改變，從而形成了 “多肽-疾病”關(guān)系鏈，因此血清多肽可進(jìn)行代謝相關(guān)疾病診斷。2006年Villanueva J的研究發(fā)現(xiàn)了 61種具有癌癥特征的肽段標(biāo)志物和不同蛋白酶活性之間存在著直接關(guān)聯(lián)，認(rèn)為血清多肽組中蘊(yùn)含的蛋白質(zhì)降解模式攜帶著重要的、具有臨床應(yīng)用價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物信息，指出幾種肽段模式在臨床上有望作為腫瘤的標(biāo)志物，對(duì)前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌的診斷有一定研究意義。從而肯定了多肽標(biāo)志物在疾病診斷的應(yīng)用前景。越來越多的研究也證實(shí)了多肽用于腫瘤等疾病診斷的臨床可行性。
[0004]目前，被研究人員所認(rèn)可的生物標(biāo)志物多為血清蛋白標(biāo)志物，也有少量游離型多肽標(biāo)志物。如通過聯(lián)檢甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清鐵蛋白(SF)等可顯著提高肝癌診斷的陽性率。隨著臨床應(yīng)用的深入，常規(guī)報(bào)道的血清蛋白或多肽標(biāo)志物及其檢測(cè)方式逐漸暴露出敏感性不強(qiáng)等共性問題。比如，AFP在輔助診斷肝癌的研究中，敏感性僅為40%~65%，特異性也只有76%~96%不等，尤其對(duì)腫瘤直徑小于3cm的肝癌早期患者的診斷敏感性及特異性更低，而且在不同腫瘤中均可以檢出不同表達(dá)水平的某些蛋白標(biāo)志物，降低了蛋白標(biāo)志物的可信度，給腫瘤等疾病的臨床診斷和評(píng)判帶來了困惑，限制了蛋白標(biāo)志物的臨床應(yīng)用。同時(shí)，由于單一多肽標(biāo)志物的分子量通常較小，抗原表位少，免疫原性低，因而增加了制備針對(duì)同一多肽不同抗原表位的特異性抗體的難度，也導(dǎo)致了雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)難以應(yīng)用到血清多肽標(biāo)志物的研究中。
[0005]近年來，單一標(biāo)志物或簡(jiǎn)單的血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)在腫瘤診斷中的應(yīng)用研究得到很高的重視。如通過聯(lián)檢甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清鐵蛋白(SF)、a-L-巖藻糖苷酶(AFU)可顯著提高肝癌診斷的陽性率，但由于各個(gè)標(biāo)志物彼此并無直接關(guān)聯(lián)性，且在多種疾病狀態(tài)中均可檢出，因而診斷特異性不強(qiáng)，同時(shí)成本上的數(shù)倍增加也限制了這種模式在常規(guī)體檢中的推廣。解決這些問題的關(guān)鍵在于挖掘與腫瘤代謝通路更加密切相關(guān)的多肽、蛋白標(biāo)志物，并開發(fā)出相關(guān)的高靈敏度檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品。目前，尚缺乏緊密聯(lián)系腫瘤代謝通路相關(guān)的全新標(biāo)志物及定量檢測(cè)技術(shù)。
[0006]激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)(Kallikrein—Kinin system, KKS)中的高分子量激肽原(High Molec μ Lar Weight Kininogen,縮寫為HK)是血衆(zhòng)中的一種糖蛋白，分子量120kDa,該分子可劃分為6個(gè)結(jié)構(gòu)域(D1-D6)。D1、D2和D3區(qū)組成重鏈；D3后是I個(gè)小區(qū)段D4，含有緩激肽片段；D5和D6區(qū)組成分子的輕鏈。HK在Lys362-Lys363和Arg371_Ser372之間被激活后，釋放D4區(qū)緩激肽BK，產(chǎn)生HKa。HKa由含D1、D2和D3的重鏈和含D5和D6的輕鏈組成，重鏈和輕鏈由I個(gè)二硫鍵連接起來。HK轉(zhuǎn)變?yōu)镠Ka后，發(fā)生結(jié)構(gòu)重排、構(gòu)象變化等使D5區(qū)暴露更加明顯，D5區(qū)是HKa的活性中心，發(fā)揮HKa的主要作用，如介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移等。目前，尚未見將激酶及其降解肽進(jìn)行組合后作為疾病標(biāo)志物的相關(guān)報(bào)道及應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種激酶通路相關(guān)“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物及定量檢測(cè)技術(shù)，該組合式標(biāo)志物系首次提出的一種全新的，與腫瘤代謝進(jìn)程緊密聯(lián)系的激酶通路相關(guān)多肽-蛋白組合式標(biāo)志物，該組合式標(biāo)志物的定量檢測(cè)技術(shù)，可獲取精確的組合式標(biāo)志物定量檢測(cè)結(jié)果，可用于相關(guān)腫瘤的早期診斷，具有更高的特異性。
[0008]本發(fā)明提供了一種“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物，其由多肽HKP09、多肽HKP15和蛋白HKa組成；
[0009]蛋白HKa為多肽HKP09和多肽HKP15的前體蛋白；
[0010]多肽HKP09的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0011]多肽HKP15的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
[0012]蛋白HKa的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0013]本發(fā)明首先通過對(duì)比腫瘤與正常樣本之間的血清多肽差異譜，篩選并精確查找到機(jī)體病變后異常表達(dá)的多肽，然后通過多肽反推到它所對(duì)應(yīng)的前體蛋白，最后找到兩者的組合形式，并最終確定“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物。
[0014]本發(fā)明提供的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的關(guān)鍵是前體蛋白結(jié)構(gòu)中的特定多肽與對(duì)應(yīng)的游離型的特定多肽序列結(jié)構(gòu)完全一致、免疫特性一致，多肽自然存在于前體蛋白表面，是前體蛋白的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，多肽和蛋白互不干擾各自的免疫學(xué)特異性結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明提供的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物首次將激酶降解的多肽HKP09及HKP15與其前體蛋白HKa進(jìn)行優(yōu)化組合，在檢測(cè)時(shí)可同時(shí)分析緊密聯(lián)系的多肽和前體蛋白，而不是完全孤立的去分析蛋白或者多肽。突破“混合式”或單一標(biāo)志物的局限，最終實(shí)現(xiàn)該新型標(biāo)志物與疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系。本發(fā)明提供的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物不同于單一蛋白標(biāo)志物或者單一多肽標(biāo)志物，也不能理解為單一多肽和蛋白的簡(jiǎn)單混合。
[0015]作為優(yōu)選，多肽HKP09或多肽HKP15以酰胺鍵或二硫鍵與蛋白HKa相連。
[0016]本發(fā)明還提供了一種非疾病診斷目的的檢測(cè)多肽-蛋白組合式標(biāo)志物的方法，包括:以抗蛋白HKa的抗體為捕獲抗體，以抗多肽HKP09和多肽HKP15的抗體為檢測(cè)抗體，定量檢測(cè)樣本中的多肽-蛋白組合式標(biāo)志物。
[0017]作為優(yōu)選，定量檢測(cè)具體為:捕獲抗體與蛋白特異性結(jié)合，檢測(cè)抗體與多肽或蛋白特異性結(jié)合，形成捕獲抗體-蛋白-多肽-檢測(cè)抗體復(fù)合物；根據(jù)“捕獲抗體-蛋白-多肽-檢測(cè)抗體”中檢測(cè)抗體的含量，獲得“蛋白-多肽組合式”標(biāo)志物的含量。
[0018]本發(fā)明提供的檢測(cè)方法中包含了兩類分別與組合式標(biāo)志物中的多肽和蛋白特異性結(jié)合的抗體，其中，捕獲抗體與HKa特異性結(jié)合，檢測(cè)抗體與HKP09或HKP15特異性結(jié)合，捕獲抗體與檢測(cè)抗體的抗原表位不同，且多肽和蛋白互不干擾各自的免疫學(xué)特異性結(jié)合位點(diǎn)，因此，捕獲抗體不會(huì)與組合式標(biāo)志物中的多肽特異性結(jié)合。通過兩種特異性抗體對(duì)“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物進(jìn)行定量檢測(cè)，從而更精確的反映樣品中標(biāo)志物的表達(dá)情況，具有更高的特異性和準(zhǔn)確度。
[0019]與多肽特異性結(jié)合的檢測(cè)抗體可先通過多肽偶聯(lián)制備免疫原，再進(jìn)行動(dòng)物免疫和細(xì)胞株篩選，與蛋白特異性結(jié)合的捕獲抗體可通過蛋白直接免疫動(dòng)物獲取單克隆抗體和多克隆抗體。
[0020]在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
[0021]優(yōu)選的，檢測(cè)抗體為單克隆抗體。
[0022]在一些實(shí)施方案中，捕獲抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
[0023]優(yōu)選的，捕獲抗體為單克隆抗體。
[0024]作為優(yōu)選，定量檢測(cè)為免疫學(xué)方法。
[0025]優(yōu)選的，定量檢測(cè)為免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫測(cè)定法、化學(xué)發(fā)光法或免疫印跡法。
[0026]更優(yōu)選的，定量檢測(cè)為雙抗體夾心ELISA。
[0027]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，非診斷目的定量檢測(cè)待測(cè)樣本中“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的雙抗體夾心ELISA方法的原理如圖1所示，該方法具體包括以下步驟:
[0028]步驟1:以與組合式標(biāo)志物中的蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體為捕獲抗體；以與組合式標(biāo)志物中的多肽特異性結(jié)合的單克隆抗體為檢測(cè)抗體；
[0029]步驟2:將捕獲抗體固定到固相材料表面，加入待測(cè)樣品或者不同濃度的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品，使捕獲抗體捕獲待測(cè)樣品中的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物；
[0030]步驟3:使檢測(cè)抗體與捕獲的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物上的多肽結(jié)合；
[0031]步驟4:定量檢測(cè)抗體上的標(biāo)記物質(zhì)，從而推導(dǎo)獲得“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的含量。
[0032]本發(fā)明提供的方法可直接對(duì)檢測(cè)抗體進(jìn)行標(biāo)記，也可通過經(jīng)標(biāo)記的抗體與檢測(cè)抗體結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)定量，本發(fā)明對(duì)此不作限定，其皆在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0033]在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)抗體標(biāo)記生物酶、吖啶酯、熒光素、放射性核素。
[0034]作為優(yōu)選，檢測(cè)抗體標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)。
[0035]在檢測(cè)抗體上標(biāo)記辣根過氧化物酶，則定量檢測(cè)抗體上的標(biāo)記物質(zhì)具體為:檢測(cè)抗體與捕獲的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物結(jié)合后，加入底物顯色液，經(jīng)顯色檢測(cè)OD45tl值，根據(jù)OD45tl值與不同濃度“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值，計(jì)算多肽-前體蛋白標(biāo)志物的含量。
[0036]在一些實(shí)施方案中，顯色液為TMB顯色液或鄰苯二胺(OPD)顯色液。
[0037] 本發(fā)明提供的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的抗體在制備檢測(cè)腫瘤相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0038]優(yōu)選的，腫瘤為肺癌、胃癌、乳腺癌、食管癌、腸癌或肝癌
[0039]本發(fā)明提供的方法可用于多種生物樣本的檢測(cè)，本發(fā)明對(duì)此不做限定，其實(shí)施皆在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0040]在一些實(shí)施方案中，待測(cè)物為血漿、血清、尿液或組織。
[0041]優(yōu)選的，待測(cè)物為血清。
[0042]本發(fā)明還提供了一種多肽分子標(biāo)志物，為多肽HKP09或多肽HKP15，其氨基酸序列分別如 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2 所示。
[0043]本發(fā)明提供的多肽HKP09或HKP15由其前體蛋白HKa代謝產(chǎn)生，并且屬于HKa的兩個(gè)不同功能域，其中，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽HKP09位于HKa蛋白的D4區(qū)，具體位于HKa蛋白的381~389位氨基酸。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽HKP15位于HKa蛋白的D5區(qū)，具體位于497~511位氨基酸。HKP09和HKP15均通過免疫共沉淀分析得到。
[0044]本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具有本發(fā)明提供的組合式分子標(biāo)志物在腫瘤樣本中的含量顯著(P〈0.001)高于正常樣本。因此，能夠作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用。本發(fā)明還提供了“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的定量檢測(cè)技術(shù)，由于采用兩種特異性抗體，分別與血清中的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的多肽和蛋白特異性結(jié)合，從而更精確的反映樣品中標(biāo)志物的表達(dá)情況，具有更高的特異性和準(zhǔn)確度。以腸癌的檢測(cè)為例，采用雙抗體夾心ELISA的方法檢測(cè)的特異性和靈敏度均可達(dá)到90%以上。
[0045]生物保藏說明
[0046]保藏編號(hào)為CGMCC N0.9331的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞3D11于2014年07月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0047]保藏編號(hào)為CGMCC N0.9332的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞2G6于2014年07月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1示“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物定量檢測(cè)技術(shù)原理圖；其中，ζ?示HKa蛋白，▲示多肽ΗΚΡ09或ΗΚΡ15，Y示抗HKa蛋白抗體，J1示抗多肽ΗΚΡ09或ΗΚΡ15抗體，馨示標(biāo)記物質(zhì)；
[0049]圖2示“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物在108例正常人中含量的分布圖；
[0050]圖3示“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物在正常與不同腫瘤的含量差異分析圖；
[0051]圖4示雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)腸癌樣品的ROC曲線圖；
[0052]圖5示雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)食管癌樣品的ROC曲線圖；
[0053]圖6示雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)胃癌樣品的ROC曲線圖；
[0054]圖7示雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)乳腺癌樣品的ROC曲線圖；
[0055]圖8示雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)肺癌樣品的ROC曲線圖；
[0056]圖9示雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)肝癌樣品的ROC曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0057]本發(fā)明提供了一種激酶通路相關(guān)“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物及定量檢測(cè)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0058]其他試劑或耗材均為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。
[0059]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0060]本發(fā)明的實(shí)施例中“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品用從血漿中提取的天然蛋白HKa替代。
[0061]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明:
[0062]實(shí)施例1:抗多肽HKP09/HKP15抗體的制備
[0063]將如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽標(biāo)志物記為HKP09，將如SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列多肽標(biāo)志物記為HKP15。
[0064]1、分別制備HKP15與BSA、HKP09與BSA的偶聯(lián)物
[0065]I)溶液配制:
[0066]MES生物偶聯(lián)緩沖液:0.lmol/L，pH值6.0
[0067]多肽溶液:用MES生物偶聯(lián)緩沖液將多肽HKP09或HKP15配置成濃度為5mg/mL ；
[0068]載體蛋白溶液:用MES生物偶聯(lián)緩沖液將載體蛋白BSA配置成濃度為10mg/mL ；
[0069]偶聯(lián)劑溶液:用MES生物偶聯(lián)緩沖液將EDC配置成濃度為10mg/mL ；
[0070]2)HKP09、HKP15 與 BSA 的偶聯(lián)物制備
[0071]取含5mg多肽的多肽溶液，與含5mg EDC的偶聯(lián)劑溶液混合，25V反應(yīng)5min，再加入含5mg BSA的載體蛋白溶液，25°C中速攪拌偶聯(lián)12小時(shí)。將偶聯(lián)物轉(zhuǎn)移至截留分子量為12~14kDa的透析袋中，以0.02mol/L，pH值為7.4的PBS緩沖液透析24小時(shí)。收集透析后的偶聯(lián)物，記為HKP09-BSA或HKP15-BSA。采用紫外分光光度法掃描計(jì)算偶聯(lián)比(多肽:蛋白)，結(jié)果表明:偶聯(lián)物HKP09-BSA的濃度為1.05mg/mL,偶聯(lián)物HKP15-BSA的濃度為
1.09mg/mL, HKP09 與 BSA 的偶聯(lián)比為 62:1。
[0072]2、動(dòng)物免疫與抗體篩選
[0073]取偶聯(lián)制備的兩種多肽免疫原HKP15-BSA、HKP09-BSA各50 μ g，總免疫抗原含量為100 μ g，混合均勻后，加入弗氏完全佐劑做乳化處理，免疫Balb/C小鼠。免疫劑量為30μ g/只，共進(jìn)行4次免疫后，取Balb/C小鼠尾血檢測(cè)免疫血清抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1:8000。通過細(xì)胞融合，分別采用HKP09和HKP15作為檢測(cè)抗原，進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選和克隆，最終篩選出最優(yōu)的細(xì)胞株記為3D11，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9331，于2014年07月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0074]3、抗多肽HKP09、HKP15抗體的純化與HRP標(biāo)記
[0075]采用親和層析法將所制備的抗多肽HKP09、HKP15抗體進(jìn)行純化，純化后抗體的濃度為0.47mg/mL,純化后的抗體純度達(dá)到95%以上。采用過碘酸鈉法對(duì)純化抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記,標(biāo)記后抗體濃度為0.9mg/mL,效價(jià)為1:4000。
[0076]實(shí)施例2:抗前體蛋白HKa抗體的制備
[0077]取前體蛋白HKa 10 μ g，加入生理鹽水稀釋成0.5mL，免疫Balb/c小鼠，共免疫4次，采集免疫血清并檢測(cè)效價(jià)。效價(jià)達(dá)到1:3200000后，取Balb/C小鼠脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞在PEG作用下融合后，通過細(xì)胞篩選，獲得能與HKa特異結(jié)合的單克隆細(xì)胞株，記為2G6，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9332，于2014年07月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0078]采用親和層析法將2G6所制備的單克隆抗體進(jìn)行純化，純化后單克隆抗體的濃度為0.66mg/mL,純化后的抗體純度達(dá)到95%以上。
[0079]實(shí)施例3:雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物在正常人和6種腫瘤患者血清中的含量
[0080]實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示:
[0081]表1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0082]

【權(quán)利要求】
1.一種“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物，其特征在于，由多肽HKP09、多肽HKP15和蛋白HKa組成； 所述蛋白HKa為多肽HKP09和多肽HKP15的前體蛋白； 所述多肽HKP09的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示； 所述多肽HKP15的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示； 所述蛋白HKa的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物，其特征在于，所述多肽HKP09或多肽HKP15以酰胺鍵或二硫鍵與所述蛋白HKa相連。
3.一種非疾病診斷目的檢測(cè)權(quán)利要求1~2任一項(xiàng)所述“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的方法，其特征在于，包括:以抗蛋白HKa的抗體為捕獲抗體，以抗多肽HKP09和多肽HKP15的抗體為檢測(cè)抗體，定量檢測(cè)樣本中的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述定量檢測(cè)具體為:所述捕獲抗體與所述蛋白特異性結(jié)合，所述檢測(cè)抗體與所述多肽或蛋白均能特異性結(jié)合，通過檢測(cè)形成的“捕獲抗體-蛋白-多肽-檢測(cè)抗體”復(fù)合物，獲得樣本中的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述定量檢測(cè)為免疫學(xué)方法；優(yōu)選的，所述定量檢測(cè)為免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫測(cè)定法、化學(xué)發(fā)光法或免疫印跡法；更優(yōu)選的，所述定量檢測(cè)為雙抗體夾心ELISA。
6.根據(jù)權(quán)利要求3~5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)抗體為多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選的為單克隆抗體；所述捕獲抗體為多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選的為單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求3~6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)抗體標(biāo)記生物酶、吖啶酯、熒光素、放射性核素，優(yōu)選的，檢測(cè)抗體標(biāo)記HRP酶。
8.權(quán)利要求1~2任一項(xiàng)所述的“多肽-蛋白組合式”標(biāo)志物的抗體在制備腫瘤相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為肺癌、胃癌、乳腺癌、食管癌、腸癌或肝癌。
10.一種多肽分子標(biāo)志物，為多肽HKP09或多肽HKP15，其氨基酸序列分別如SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO:2 所示。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK104177503SQ201410418619
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】魏開華, 侯利平, 宋純艷, 孫云波, 楊保安, 周婷婷, 甄蓓, 劉曙晨, 鄭俊杰 申請(qǐng)人:北京蛋白質(zhì)組研究中心, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所