用于卡那霉素檢測(cè)的電化學(xué)適體電極及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及檢測(cè)用傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于卡那霉素檢測(cè)的電化學(xué)適體電極，在玻碳電極上自下而上依次修飾有石墨烯-聚苯胺復(fù)合物、聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物、卡那霉素抗體，最后封閉電極表面的為BSA和10個(gè)腺嘌呤堿基的單鏈DNA。制備方法簡(jiǎn)單，性能穩(wěn)定，電極的重復(fù)性好，適用于食品安全中卡那霉素的檢測(cè)和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實(shí)際應(yīng)用。制作電極的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價(jià)廉的要求。以玻碳電極為固定載體固定基于核酸適配體的夾心型電化學(xué)傳感系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中卡那霉素的快速在線檢測(cè)，檢出限為4.6×10-6μgmL-1。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于卡那霉轟檢測(cè)的電化學(xué)適體電極及其制備方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明涉及檢測(cè)用傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于卡那霉素檢測(cè)的電化學(xué)適體電 極，還涉及所述電化學(xué)適體電極的制備方法。
[000引【背景技術(shù)】 卡那霉素（Ka)是一種氨基糖巧類(lèi)抗生素，是由鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)生的，被廣泛用于治療 誤譯誘導(dǎo)的感染和間接抑制蛋白質(zhì)合成期間易位。和其他氨基糖式類(lèi)一致，Ka可W在動(dòng)物 體中累積并且轉(zhuǎn)移到食物鏈中，該可能對(duì)人類(lèi)健康引起潛在的危險(xiǎn)，比如出現(xiàn)失去聽(tīng)力，腎 臟毒性和藥物過(guò)敏反應(yīng)。歐盟組織已經(jīng)確定了可食用組織和牛奶中Ka的最大殘留量。在 該方面，確立一個(gè)靈敏的高選擇性的方法臨床診斷和在食品安全分析中檢測(cè)Ka是至關(guān)重 要的。目前報(bào)道的檢測(cè)Ka的方法包括高效液相色譜法，毛細(xì)管電泳法，表面等離子體共振 方法和英光共振方法。該些方法有檢測(cè)成本高，儀器操作復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)操作人員等缺點(diǎn)。 [000引
【發(fā)明內(nèi)容】
為了解決W上現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法中檢測(cè)成本高，儀器操作復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè) 操作人員的缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)了基于核酸適配子的新型夾也構(gòu)型的用于卡那霉素檢測(cè)的電化學(xué)適 體電極。
[0004] 本發(fā)明還提供了所述電化學(xué)適體電極的制備方法。
[0005] 本發(fā)明是通過(guò)W下步驟得到的： 一種用于卡那霉素檢測(cè)的電化學(xué)適體電極，在玻碳電極上自下而上依次修飾有石墨 帰-聚苯胺復(fù)合物、聚醜胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物、卡那霉素抗體，最后封閉 電極表面的為BSA和10個(gè)腺嘿嶺堿基的單鏈DNA。
[0006] 所述的電化學(xué)適體電極，優(yōu)選石墨帰-聚苯胺復(fù)合物的厚度在100 ±10nm，聚 醜胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物的厚度為100-200 nm，卡那霉素抗體的厚度為 1 + 0. 1 y m，BSA和10個(gè)腺嘿嶺堿基的單鏈DNA的厚度和為500 ±20皿。
[0007] 所述的電化學(xué)適體電極，優(yōu)選石墨帰-聚苯胺復(fù)合物中石墨帰與苯胺的質(zhì)量比為 3. 3:100。
[0008] 所述的電化學(xué)適體電極，優(yōu)選聚醜胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物中聚醜 胺-胺型樹(shù)枝狀高分子與金的摩爾比為1:3。
[0009] 所述的電化學(xué)適體電極的制備方法，優(yōu)選包括W下步驟： (1) 對(duì)玻碳電極進(jìn)行處理洗涂，將石墨帰-聚苯胺納米復(fù)合物滴加到電極表面，室溫下 干燥，用二次水沖洗； (2) 浸入聚醜胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物中3小時(shí)，用二次水沖洗，干燥； (3) 在表面滴加卡那霉素抗體的PBS緩沖液，室溫下過(guò)夜； (4) 用0. 1%的牛血清白蛋白和10個(gè)腺嘿嶺堿基的單鏈DNA封閉電極2 h，即得。
[0010] 所述的制備方法，優(yōu)選石墨帰-聚苯胺納米復(fù)合物是通過(guò)W下步驟得到的： (1) 石墨粉經(jīng)過(guò)氧化得到氧化石墨帰， (2) 氧化石墨帰同苯胺按照質(zhì)量比3. 3:100制備石墨帰-聚苯胺納米復(fù)合物。
[0011] 所述的制備方法，優(yōu)選聚醜胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物中聚醜胺-胺 型樹(shù)枝狀高分子與金的摩爾比為1:3。
[0012] 所述的制備方法，優(yōu)選步驟（3)中在表面滴加10 y L溶解有5 y mol?？敲?素抗體（KAb)的PBS緩沖液，室溫下過(guò)夜。
[0013] 所述的制備方法，優(yōu)選石墨帰-聚苯胺納米復(fù)合物是通過(guò)W下步驟得到的：2.75 血苯胺溶解在100血1 mol L-1的肥1中得到苯胺的濃度為0.3 mol [1，加入100 mg氧 化石墨帰，超聲1 h后，0. 17g (NH4)2S408和10血1 mol L-I肥1快速加入混合液并劇烈攬 動(dòng)，顏色變?yōu)樯罹G色時(shí)，聚合開(kāi)始，使用二次蒸觸水過(guò)濾洗涂若干次后，得到石墨帰-聚苯 胺復(fù)合物；稱(chēng)量0.1 g石墨帰-聚苯胺復(fù)合物溶解在50 mL的超純水中，用0.1 mL80%的水 合脫在95 C下還原1 h，洗涂除去過(guò)量的水合脫；復(fù)合物分散在10血含有1 mol L-I肥1 和0.06 g (NH4)2S40g，室溫下攬動(dòng)過(guò)夜。用二次水，己醇，甲醇逐步洗涂聚合物，過(guò)濾收集， 并在60 C的干燥箱中干燥，溶解在二甲基甲醜胺中，得到1 mg m。的均勻息浮物。
[0014] 所述的制備方法，優(yōu)選聚醜胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物是通過(guò)W下步 驟得到的： 將2. 5 ml濃度為0. 3 mmol L-1的HAuCL溶液添加到2. 5 ml 0. 1 mmol L-1的聚醜 胺-胺樹(shù)形分子水溶液中，攬拌20 min得混合溶液；將2.5 mL的0.1 mmol。的巧樣酸軸 逐滴加入上述混合溶液中，反應(yīng)4 h，溶液顏色變?yōu)樯罴t色，即得。
[0015] 本發(fā)明的工作原理： 在玻碳電極上首先修飾增效物質(zhì)GR-PANI和PAMAM-Au,不但能促進(jìn)電極表面電子轉(zhuǎn) 移，而且增效物質(zhì)之間的特殊基團(tuán)的連接能保證它們的層層組裝。金納米粒子與卡那霉素 抗體（KAb)的氨基，通過(guò)A11-NH2,,的作用，把抗體修飾到電極上。然后，抗體（KAb)與卡那 霉素有專(zhuān)一的識(shí)別能力，卡那霉素就能成功修飾到電極上。在卡那霉素的另一端，生物素標(biāo) 記的核酸適體（Bio-Apt)通過(guò)核酸適體與目標(biāo)物的特異性識(shí)別能力，也被成功修飾。最后， 標(biāo)記有鏈霉親和素的辣根過(guò)氧化物酶（SA-HRP)通過(guò)Bio-SA之間的強(qiáng)作用力被連接到電極 上。在檢測(cè)過(guò)程中，通過(guò)電極上的HRP催化檢測(cè)底液中的對(duì)苯二酷（冊(cè)）和雙氧水（?化）的 氧化還原產(chǎn)生電信號(hào)，連接電化學(xué)工作站，W Ag/AgCl為參比電極，W Pt電極為對(duì)電極，電 位設(shè)置為-0. 2到0. 6 V，脈沖寬度0. 05V，脈沖寬度掃描為0. 06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù) 讀取電信號(hào)的變化，根據(jù)電極表面產(chǎn)生的電流的大小起到對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)的作用。電極上固 定的HRP的量與修飾的被檢測(cè)物卡那霉素的量有直接關(guān)系，被檢測(cè)物越多，固定的HRP的量 也越多，催化產(chǎn)生的電信號(hào)也越強(qiáng)。
[0016] 本發(fā)明采用的GR-PANI和PAMAM-Au復(fù)合物導(dǎo)電性強(qiáng)，成為構(gòu)建傳感器的優(yōu)良材 料；使用辣根過(guò)氧化物酶（HRP)，通過(guò)與&〇2和冊(cè)的反應(yīng)，放大信號(hào)；采用了夾也型的檢測(cè) 模型，分別在檢測(cè)物Ka的兩端引入抗體和適配體，檢測(cè)更為靈敏；制備的傳感器靈敏度高， 檢測(cè)速度快；檢測(cè)Ka的方法，操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏，便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
[0017] 本發(fā)明的有益效果： 1、由于使用玻碳電極，其電極簡(jiǎn)便、小型化、易攜帶、可多次使用。
[0018] 2、反應(yīng)層是使用表面修飾技術(shù)固定在工作電極上，優(yōu)化使用材料的用量與濃度， 制得的夾也型電極對(duì)環(huán)境溫度的要求不明顯，室溫下使用即可。
[0019] 3、制備方法簡(jiǎn)單，性能穩(wěn)定，電極的重復(fù)性好，適用于食品安全中卡那霉素的檢測(cè) 和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實(shí)際應(yīng)用。
[0020] 4、制作電極的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價(jià)廉的要求。
[0021] 5、W玻碳電極為固定載體固定基于核酸適配體的夾也型電化學(xué)傳感系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn) 對(duì)食品中卡那霉素的快速在線檢測(cè)，檢出限為4. 6X10^6 yg m[i。
[0022]

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】 圖1為電化學(xué)適體電極的制備工藝流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，下述說(shuō)明僅是實(shí)例性的，不限定 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 首先制備石墨帰-聚苯胺納米復(fù)合物和聚醜胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合 物 1、 石墨帰-聚苯胺（GR-PANI)納米復(fù)合物的制備： (1)氧化石墨帰（GO)的制備： 氧化石墨帰（GO)的制備是根據(jù)經(jīng)典的方法。簡(jiǎn)而言之，1.0 g石墨粉加入到含有0.5 g硝酸軸（NaN〇3)和3. 0 g高猛酸鐘（KMn〇4)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%的50血濃硫酸（H2SO4)中。 溫度低于20 C下，反應(yīng)1 h，升溫到35C，繼續(xù)攬拌30 min。然后緩慢加入約100血的離 子水，持續(xù)攬拌20 min后，加入50 mL &〇2 (30%)，來(lái)還原殘留的氧化劑，溶液漸漸變成亮 黃色；趁熱過(guò)濾，用HCl溶液和去離子水洗涂直到濾液中無(wú)硫酸根被檢測(cè)到為止。沉淀物 在60 C的恒溫箱中干燥，最終得到GO。
[0025] (2)合成石墨帰-聚苯胺（GR-PANI)復(fù)合物 2. 75血苯胺（99%)溶解在100血1 mol L-1的肥1中得到苯胺的濃度為0.3 mol [1， 加入100 mg已制備的GO。超聲1 h后，0. 17g (NH4)2S408和10血1 mol L-I肥1快速加 入混合液并劇烈攬動(dòng)。顏色變?yōu)樯罹G色時(shí)，聚合開(kāi)始。使用二次蒸觸水過(guò)濾洗涂多次后，得 到石墨帰-聚苯胺（GO-PANI)復(fù)合物。稱(chēng)量0. 1 g GO-PANI溶解在50 mL的超純水中，用 0.1血水合脫（80%)在95 C下還原1 h。用二次水洗涂復(fù)合物通過(guò)過(guò)濾除去過(guò)量的水合 脫。
[0026] 最后，上述合成的復(fù)合物分散在10 mL含有1 mol [1肥1和0. 06 g (NH4)2S408， 室溫下攬動(dòng)過(guò)夜。用二次水，己醇，甲醇逐步洗涂聚合物，過(guò)濾收集，并在60 C的干燥箱中 干燥。
[0027] 為了準(zhǔn)備進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，制備的GR-PANI溶解在二甲基甲醜胺（DMF)中，并超聲1 h，得到1 mg ml/i的均勻息浮物。
[0028] 2、聚醜胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物（PAMAM-Au)的制備： 將2. 5血HAuCL溶液（0. 3 mmol。）添加到2. 5血0. 1 mmol L4聚醜胺-胺樹(shù)形 分子（PAMAM)(取0. 15 y L樹(shù)狀分子加2. 5血水)溶液中，攬拌20 min ;將2. 5血巧樣酸 軸（0.1 mmol [I)逐滴加入上述溶液中，反應(yīng)時(shí)間為4 h后，溶液顏色變?yōu)樯罴t色，形成零 價(jià)金配合物，即得。
[0029] 實(shí)施例1 一種本發(fā)明所述夾也型電化學(xué)傳感器的制備方法，包括W下步驟： a、 玻碳電極首先在0. 3和0. 05 --m的氧化鉛漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用二次 水沖洗； b、 10 y L已經(jīng)制備的GR-PANI滴加在電極表面，在室溫下干燥過(guò)夜；修飾好的電極浸 入在制備的PAMAM-Au溶液中，保持3 h ; C、待用二次水沖洗幾次之后，10 U L溶解5 y mol [1卡那霉素抗體（KAb)的PBS溶液 滴加在電極表面，室溫下保持90 min,用二次水和PBS沖洗電極除去未結(jié)合的KAb ; d、 10 Ul BSA (0.1%)和聚（A)i。鏈（10個(gè)腺嘿嶺堿基的單鏈DNA，5 y mol [I)被用 來(lái)封閉電極表面沒(méi)有被結(jié)合的位點(diǎn)，即得夾也型電化學(xué)傳感器。
[0030] 檢測(cè)方法如下： e、 所得電極在PBS緩沖液中充分?jǐn)垊?dòng)清洗后，在不同濃度待檢測(cè)卡那霉素（Ka)溶液中 賠育，并用PBS緩沖液沖洗； 110 UL 5. 5 X mol L4生物素標(biāo)記的核酸適體（Bio-KBA)通過(guò)與目標(biāo)物之間的 強(qiáng)識(shí)別能力，被修飾在電極表面，賠育4 h; g、PBS沖洗之后，10 UL 0.96 y mol。鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶（SA-HRP) 通過(guò)SA與Bio之間強(qiáng)的作用力修飾在電極上； K W Ag/AgCl為參比電極，W Pt電極為對(duì)電極，電位設(shè)置為-0. 2到0. 6 V，脈沖寬度 0.05V，脈沖寬度掃描為0.06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取電信號(hào)的變化，檢測(cè)目標(biāo)物。
[0031] 上述方法中所用的PBS緩沖液是由方法配制：稱(chēng)取化2冊(cè)〇4 7. 1 g，KCl 0.2 g和 KH2PO4 6. 8 g，KCl 0. 2 g分別溶于500血二次水中，得到兩種溶液用抑計(jì)混合調(diào)整，得到 抑值為7. 4,濃度為0. Ol mol。的PBS緩沖液。
[00礎(chǔ) 實(shí)施例2 10 U L溶解5 y mol L4卡那霉素抗體（KAb)的PBS溶液滴加在電極表面，室溫下一次 改變賠育時(shí)間（30,60,90,120,150,180 min),用二次水和PBS沖洗電極除去未結(jié)合的KAb, 制作不同電極，用于選擇KAb最佳的賠育時(shí)間，其他同實(shí)施例1。

【權(quán)利要求】
1. 一種用于卡那霉素檢測(cè)的電化學(xué)適體電極，其特征在于在玻碳電極上自下而上依次 修飾有石墨烯-聚苯胺復(fù)合物、聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物、卡那霉素抗 體，最后封閉電極表面的為BSA和10個(gè)腺嘌呤堿基的單鏈DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)適體電極，其特征在于石墨烯-聚苯胺復(fù)合物的厚度 在100 ± 10nm，聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物的厚度為100-200 nm，卡那霉 素抗體的厚度為1±〇· 1 μ m，BSA和10個(gè)腺嘌呤堿基的單鏈DNA的厚度和為500±20nm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)適體電極，其特征在于石墨烯-聚苯胺復(fù)合物中石墨 烯與苯胺的質(zhì)量比為3. 3:100。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)適體電極，其特征在于聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分 子-金納米復(fù)合物中聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子與金的摩爾比為1: 3。
5. -種權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的電化學(xué)適體電極的制備方法，其特征在于包括以 下步驟： (1) 對(duì)玻碳電極進(jìn)行處理洗滌，將石墨烯-聚苯胺納米復(fù)合物滴加到電極表面，室溫下 干燥，用二次水沖洗； (2) 浸入聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米復(fù)合物中3小時(shí)，用二次水沖洗，干燥； (3) 在表面滴加卡那霉素抗體的PBS緩沖液，室溫下過(guò)夜； (4) 用0. 1%的牛血清白蛋白和10個(gè)腺嘌呤堿基的單鏈DNA封閉電極2 h，即得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于石墨烯-聚苯胺納米復(fù)合物是通過(guò)以 下步驟得到的： (1) 石墨粉經(jīng)過(guò)氧化得到氧化石墨烯， (2) 氧化石墨烯同苯胺按照質(zhì)量比3. 3:100制備石墨烯-聚苯胺納米復(fù)合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米 復(fù)合物中聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子與金的摩爾比為1:3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟（3)中在表面滴加10 μ L溶解 有5 μπιο? Γ1卡那霉素抗體（KAb)的PBS緩沖液，室溫下過(guò)夜。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于石墨烯-聚苯胺納米復(fù)合物是通過(guò)以 下步驟得到的：2.75 mL苯胺溶解在100 mL 1 mol Γ1的HC1中得到苯胺的濃度為0.3 mol L-1，加入100 mg氧化石墨烯，超聲1 h后，0.17g (順4)23408和10 mL 1 mol L-1 HC1快速加 入混合液并劇烈攪動(dòng)，顏色變?yōu)樯罹G色時(shí)，聚合開(kāi)始，使用二次蒸餾水過(guò)濾洗滌若干次后， 得到石墨烯-聚苯胺復(fù)合物；稱(chēng)量0.1 g石墨烯-聚苯胺復(fù)合物溶解在50 mL的超純水中， 用0. 1 mL80%的水合肼在95 °C下還原1 h，洗滌除去過(guò)量的水合肼；復(fù)合物分散在10 mL 含有1 mol L-1 HC1和0· 06 g (NH4)2S408，室溫下攪動(dòng)過(guò)夜， 用二次水，乙醇，甲醇逐步洗滌聚合物，過(guò)濾收集，并在60 °C的干燥箱中干燥，溶解在 二甲基甲酰胺中，得到1 mg ml/1的均勻懸浮物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子-金納米 復(fù)合物是通過(guò)以下步驟得到的： 將2. 5 mL濃度為0. 3 mmol L 1的HAuC14溶液添加到2. 5 mL 0. 1 mmol L 1的聚醜 胺-胺樹(shù)形分子水溶液中，攪拌20min得混合溶液；將2. 5 mL的0. 1 mmol Γ1的檸檬酸鈉 逐滴加入上述混合溶液中，反應(yīng)4h，溶液顏色變?yōu)樯罴t色，即得。
【文檔編號(hào)】G01N27/30GK104237344SQ201410442491
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】黃加棟, 徐偉, 王玉, 劉素, 崔敏, 李 杰, 王虹智, 郭玉娜, 許穎, 崔杰, 邱婷婷 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)