一種矮牽牛染色體的制片方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種矮牽牛染色體的制片方法，該方法為：于晴天早晨8:00-10:00取矮牽牛幼蕾，先置于0.002mol.L^8-羥基喹啉水溶液進(jìn)行低溫預(yù)處理，再轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液固定，經(jīng)0.075mol.I/1氯化鉀低滲，接著在lmol.L—HC1溶液60°C水浴解離，沖洗后蒸餾水低滲，醋酸洋紅染色液染色。將幼蕾移入載玻片，切取雌蕊柱頭部位，制片、鏡檢。本發(fā)明方法確定了不同倍性矮牽牛最佳取樣時(shí)花蕾大小、預(yù)處理方法、解離及染色的方法和時(shí)間以及制片流程，獲得的染色體分散均勻，易于計(jì)數(shù)或進(jìn)行核型分析，具有操作簡(jiǎn)單方便效率高的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種矮牽牛染色體的制片方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到一種矮牽牛染色體的制片方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 矮牽牛Vilm.)原產(chǎn)于南美洲，又名碧冬茄為茄科碧冬茄屬植 物，花朵碩大、色彩豐富，花型變化頗多，在國(guó)際上早已成為主要的盆花和裝飾植物，廣泛應(yīng) 用于庭院、露天花壇、廣場(chǎng)的美化裝飾與綠化，被喻為"世界花壇花卉之王"。矮牽牛在美國(guó) 栽培十分普遍，常用在窗臺(tái)美化、城市景觀布置，其生產(chǎn)的規(guī)模和數(shù)量列美國(guó)花壇和庭園植 物的第二位；在歐洲的意大利、法國(guó)、西班牙、荷蘭和德國(guó)等國(guó)，矮牽牛廣泛用于街旁美化和 家庭裝飾；在日本，矮牽牛常用于各式栽植槽的布置和公共場(chǎng)所的景觀配置。我國(guó)矮牽牛于 20世紀(jì)初開始引種栽培，僅在大城市有零星栽培，直到 80年代初，開始從美國(guó)、荷蘭、日本 等國(guó)引進(jìn)，作為花壇后起之秀市場(chǎng)對(duì)矮牽牛需求越來(lái)越大，栽培范圍越來(lái)越廣泛現(xiàn)在己成 為一種重要花卉，普遍用于花壇、廣場(chǎng)等裝飾與綠化，對(duì)其進(jìn)行品種選育和細(xì)胞遺傳學(xué)等相 關(guān)研究具有重要意義。
[0003]遠(yuǎn)源雜交、倍性育種是植物遺傳育種的重要方法，都需要對(duì)染色體的遺傳行為進(jìn) 行觀察和分析，需要提供高質(zhì)量的染色體圖片，優(yōu)良的細(xì)胞染色體制片方法是進(jìn)行染色體 核型分析、染色體識(shí)別等研究的基礎(chǔ)。
[0004]現(xiàn)有的染色體制片方法，根尖一般是觀察有絲分裂最常用的材料，取材時(shí)根尖長(zhǎng) 度很關(guān)鍵，根尖過(guò)長(zhǎng)絕大部分細(xì)胞已經(jīng)過(guò)了有絲分裂期，根尖過(guò)短則處于有絲分裂前期，需 要大量種子進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)試驗(yàn)，對(duì)無(wú)種子或種子稀少材料不適宜，且試驗(yàn)過(guò)程繁瑣周期長(zhǎng)。 對(duì)花丼植物而言，開花期長(zhǎng)大量花蕾雌蕊很容易得到無(wú)需專門的培養(yǎng)，縮短了試驗(yàn)周期簡(jiǎn) 化了試驗(yàn)流程。幼小花蕾如取材大小適宜，其細(xì)胞有絲分裂指數(shù)（視野內(nèi)觀察到的有絲分 裂細(xì)胞數(shù)目/視野內(nèi)觀察到的總細(xì)胞數(shù)目X 100%)往往高于根尖。單利用矮牽?；ɡ俅迫?進(jìn)行染色體制片目前還未有報(bào)道。
[0005]有絲分裂中期時(shí)染色體濃縮變粗，能夠顯示出該物種所特有的染色體數(shù)目和形 態(tài)，有絲分裂中期適于做染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)分析和計(jì)數(shù)，但中期時(shí)間較短不易觀察。預(yù)處 理通過(guò)破壞紡錘絲的形成犾得更多的中期分裂相，還促使染色體染色體縮短和分散便于觀 察，預(yù)處理方法主要有低溫處理和化學(xué)藥劑處理。現(xiàn)有資料中僅有蔡華等在《生物學(xué)通報(bào)》 20〇 6年41卷第4期49-5〇頁(yè)發(fā)表的《觀賞花卉矮牽牛與野生牽?；ǖ娜旧w核型比較》中 報(bào)道米用8-羥基喹啉預(yù)處理矮牽牛根尖，按照此方法以雌蕊柱頭為材料重復(fù)試驗(yàn)，中期分 裂指數(shù)（撕內(nèi)觀察到的有絲分裂中期細(xì)臟目/撕內(nèi)觀察到的總細(xì)胞數(shù)目 χι〇〇%)偏 低。
[0006]植物細(xì)胞依靠細(xì)胞壁和胞間連相連接，為了得到分散良好的有絲分裂中期分裂 相，吊米取鹽酸解尚方法，不同植物材料鹽酸解離時(shí)間不盡相同，處理時(shí)間短細(xì)胞壁消除不 完全導(dǎo)致細(xì)胞分散不開，解離時(shí)間長(zhǎng)對(duì)染色體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、染色效果差。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服現(xiàn)有矮牽牛染色體制片技術(shù)的不足,本發(fā)明的目的在于提供了一種二、 四倍體矮牽牛染色體制片方法，該方法以幼小花蕾雌蕊柱頭作為材料，獲得的染色體分散 均勻、背景淺、易觀察到染色體數(shù)目和形態(tài)。
[0008]本發(fā)明所米用的技術(shù)方案為：一種矮牽牛染色體染色體的制片方法，該方法包括 如下步驟： (1) 于晴天早晨8:00-10:00取二倍體、四倍體矮牽牛長(zhǎng)度分別為和5?8mm的不 包含萼片的幼蕾； (2) 分別將二、四倍體矮牽牛幼蕾分開放置于〇· 〇〇2m〇l· L/1 8-輕基喹啉水溶液中 2-6?低溫避光預(yù)處理3小時(shí)，蒸餾水沖洗3-5次吸水紙吸干水后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液固定 12-24小時(shí)，經(jīng)體積濃度％%、體積濃度 8〇%乙醇依次沖洗然后轉(zhuǎn)入體積濃度7〇%乙醇中4。〇 保存?zhèn)溆茫?(3) 將步驟（2)中備用的幼蕾先用蒸餾水沖洗3-5次，再用吸水紙吸千水，再經(jīng) 0. 075mol· L_1氯化鉀溶液進(jìn)行低滲10分鐘，在1 mol· L-hCl溶液6CTC水浴解離5分鐘，蒸 餾水沖洗3-5次后蒸餾水低滲30分鐘，吸水紙吸干水； (4) 轉(zhuǎn)入體積百分濃度為45%的醋酸溶液配制的質(zhì)量濃度為1%的洋紅染色液中，在 2-6?低溫下染色12-24小時(shí)； (5) 用鑷子分別將二、四倍體矮牽牛幼蕾移入載玻片上，用刀片切取雌蕊中的柱頭部位 去除其余部位，用另外一塊載玻片十字交叉覆蓋，用力按壓不可移動(dòng)，分開兩載玻片，在兩 片載玻片上材料處分別滴上I- 2滴1%洋紅染色液，垂直覆上蓋玻片，用吸水紙吸去溢出蓋 玻片外多余洋紅染色液；在蓋玻片上覆蓋5-6層吸水紙，一手壓緊吸水紙，另一手用鉛筆尾 端垂直均勻敲擊蓋玻片直至材料呈現(xiàn)霧狀分散開，，再用拇指垂直用力按壓玻片10秒，按 壓時(shí)蓋玻片不能移動(dòng)，玻片置于酒精燈外焰來(lái)回晃動(dòng)拷片1-2秒；先在低倍鏡下找出處于 有絲分裂中期分裂相細(xì)胞，在100 X10倍油鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和顯微照相。
[0009] 步驟（2)中所述卡諾氏固定液是由無(wú)水乙醇和冰醋酸按體積比3:1制成的。
[0010] 步驟（4)中步驟（4)中所述45% (體積百分濃度）醋酸溶液配制的1% (質(zhì)量濃度） 洋紅染色液配制方法為：先加入45ml乙酸再加水55ml混勻得到100ml體積濃度為45%醋 酸溶液，然后將洋紅粉末1克緩慢倒入上述醋酸溶液中，邊煮邊攪拌，過(guò)濾后的濾液即為質(zhì) 量濃度為1%的洋紅染色液。
[0011] 為了增加染色效果，在質(zhì)量濃度為1%的洋紅染色液煮沸冷卻后加質(zhì)量濃度為4% 的鐵明礬溶液廣2滴，過(guò)濾后即可。
[0012] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所改進(jìn)和優(yōu)點(diǎn)在于： 1、取材時(shí)間和大?。喊珷颗Ｗ罴鸦ɡ偃訒r(shí)間和大小尚未見報(bào)道，本發(fā)明確定了取樣 時(shí)間為晴天早晨8:00-10:00,此時(shí)雌蕊柱頭體細(xì)胞有絲分裂處于旺盛時(shí)期，有絲分裂指數(shù) 較高。二、四倍體矮牽牛由于倍性不同，雌蕊柱頭體細(xì)胞處于有絲分裂旺盛時(shí)期花蕾(不包 含萼片)長(zhǎng)度也不同，確定分別為3飛mm和fSmm，此時(shí)雄蕊花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂結(jié)束不久。
[0013] 2、預(yù)處理改進(jìn)：將藥劑8-羥基喹啉水溶液和4°C低溫結(jié)合預(yù)處理3小時(shí)，能夠產(chǎn) 生以下更加明顯效果：阻止或破壞紡垂體微管的形成、提高細(xì)胞有絲分裂中期指數(shù)；促進(jìn) 染色體濃縮變短，減少染色體之間相互纏繞重疊；減少胞質(zhì)粘度，促進(jìn)染色體清晰。
[0014] 3、材料軟化與染色：利用鹽酸解離，解離時(shí)間長(zhǎng)對(duì)染色體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、染色效果 差。本發(fā)明將花蕾經(jīng)鹽酸短時(shí)間解離后，轉(zhuǎn)入45% (體積百分濃度)醋酸溶液配制的1% (質(zhì) 量濃度)洋紅染色液，在4°C低溫下染色12-24小時(shí)，既能利用醋酸繼續(xù)解離軟化細(xì)胞壁、破 壞細(xì)胞質(zhì)使染色背景清晰，對(duì)染色體結(jié)構(gòu)影響也較小，較長(zhǎng)染色時(shí)間使得染色體著色深。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1和圖2分別為不同二倍體矮牽牛雌蕊柱頭體細(xì)胞染色體制片在100X 10倍 ZEISS· Imager. A1光學(xué)顯微鏡下圖片。
[0016] 圖3和圖4分別為不同四倍體矮牽牛雌蕊柱頭體細(xì)胞染色體制片在100X 10倍 ZEISS. Imager. A1光學(xué)顯微鏡下圖片。
[0017]

【具體實(shí)施方式】： 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0018] 實(shí)施例1:利用二倍體矮牽牛雌蕊柱頭體細(xì)胞進(jìn)行染色體制片，其中二倍體矮牽 牛'夢(mèng)幻'種子購(gòu)買于浙江虹越花卉有限公司。
[0019] 質(zhì)量濃度為1%的洋紅染色液配制方法為：先加入45ml乙酸再加水55ml混勻得到 100ml體積濃度為45%醋酸溶液，然后將洋紅粉末1克緩慢倒入上述醋酸溶液中，邊煮邊攪 拌，為增加染色效果煮沸冷卻后加4% (質(zhì)量濃度）鐵明礬溶液廣2滴，過(guò)濾即可使用。
[0020] 卡諾氏固定液配制方法為：無(wú)水乙醇300ml和冰醋酸100ml均勻混合。
[0021] 二倍體矮牽牛雌蕊柱頭體細(xì)胞進(jìn)行染色體制片方法包括如下步驟： (1)于晴天早晨8:00-10:00取二倍體矮牽牛長(zhǎng)度為3?6圓不包含萼片的花蕾。
[0022] (2)放置于〇. 〇〇2mol. Γ1 8-羥基喹啉水溶液中4°C低溫避光預(yù)處理3小時(shí)，蒸餾 水沖洗3次吸水紙吸干水后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液固定24小時(shí)，經(jīng)體積濃度為95%、體積濃度為 80%乙醇依次沖洗然后轉(zhuǎn)入體積濃度為70%乙醇中4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0023] (3)將步驟（2)中備用的花蕾蒸餾水沖洗3次吸水紙吸千水，經(jīng)0. 〇75mol. L71氯化 鉀低滲10分鐘，在1 mol. L-1HC1溶液60°C水浴解離5分鐘，蒸餾水沖洗3次蒸餾水低滲30 分鐘，吸水紙吸干水，得到低滲處理后的花蕾。
[0024] (4)將步驟（3)中低滲處理后的花蕾轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度為1%洋紅染色液，在4Γ低溫 下染色18小時(shí)，得到染色后的幼蕾。
[0025] (5)用鑷子將染色后的幼蕾移入載玻片上，用刀片切取雌蕊中的柱頭部位去除其 余部位，用另外一塊載玻片十字交叉覆蓋，用力按壓不可移動(dòng)，分開兩載玻片，分別滴上1 -2 滴1%洋紅染色液，垂直覆上蓋玻片，用吸水紙吸去多余染色液。在玻片上覆蓋5-6層吸水 紙，一手壓緊吸水紙，另一手用鉛筆尾端垂直均勻敲擊玻片10余下使材料呈現(xiàn)霧狀細(xì)胞分 散開，用拇指垂直用力按壓玻片10秒(玻片不能移動(dòng))，玻片置于酒精燈外焰來(lái)回晃動(dòng)拷片 1-2秒。依次在5倍、10倍和20倍低倍鏡下找出處于有絲分裂中期分裂相細(xì)胞，在100X 10 倍油鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和顯微照相。結(jié)果如圖1和圖2所示，處于有絲分裂中期分裂相 的體細(xì)胞分布相對(duì)集中，染色體分散良好、著色深背景色相對(duì)淺反差大易觀察染色體，適合 染色體計(jì)數(shù)或進(jìn)行核型分析，經(jīng)計(jì)數(shù)染色體數(shù)目2n=14。
[0026]實(shí)施例2 :利用四倍體矮牽牛雌蕊柱頭體細(xì)胞進(jìn)行染色體制片 其中，四倍體矮牽牛'紅霞'種子來(lái)源于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院。
[0027]質(zhì)量濃度為1%的洋紅染色液配制方法為：先加入45ml乙酸再加水55ml混勻得到 100ml體積濃度為45%醋酸溶液，然后將洋紅粉末1克緩慢倒入上述醋酸溶液中，邊煮邊攪 拌，為增加染色效果煮沸冷卻后加4% (質(zhì)量濃度）鐵明礬溶液廣2滴，過(guò)濾即可使用。
[0028] 卡諾氏固定液配制方法為：無(wú)水乙醇300ml和冰醋酸l〇〇ml均勻混合。
[0029]四倍體矮牽牛雌蕊柱頭體細(xì)胞進(jìn)行染色體制片的方法包括如下步驟： (1)于晴天早晨8:00-10:00取四倍體矮牽牛長(zhǎng)度為5?8_不包含萼片的花蕾。
[0030] (2)放置于0· 002mol. Γ1 8-羥基喹啉水溶液中代低溫避光預(yù)處理3小時(shí)，蒸餾 水沖洗3次吸水紙吸干水后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液固定24小時(shí),經(jīng)體積濃度為95%、體積濃度為 S0%乙醇依次沖洗然后轉(zhuǎn)入體積濃度為70%乙醇中4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0031] (3)將步驟（2)中備用的花蕾蒸餾水沖洗3次吸水紙吸干水，經(jīng)〇· 〇75mol. L；1氯化 鉀低滲10分鐘，在1 mol. PHCl溶液6〇°C水浴解離5分鐘，蒸餾水沖洗3次后蒸餾水低滲 3〇分鐘，吸水紙吸干水，得到低滲處理后的花蕾。
[0032] (4)將步驟（3)中低滲處理后的花蕾轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度為1%洋紅染色液，中在4°C低 溫下染色12小時(shí)，得到染色后的幼蕾。
[0033] (5)用鑷子將染色后的幼蕾移入載玻片上，用刀片切取雌蕊中的柱頭部位去除其 余部位，用另外一塊載玻片十字交叉覆蓋，用力按壓不可移動(dòng)，分開兩載玻片，分別滴上1 一2 滴1%洋紅染色液，垂直覆上蓋玻片，用吸水紙吸去多余染色液。在玻片上覆蓋5-6層吸水 紙，一手壓緊吸水紙，另一手用鉛筆尾端垂直均勻敲擊玻片10余下，使材料呈現(xiàn)霧狀細(xì)胞 分散開，用拇指垂直用力按壓玻片10秒(玻片不能移動(dòng))，玻片置于酒精燈外焰來(lái)回晃動(dòng)拷 片1-2秒。先在低倍鏡下找出處于有絲分裂中期分裂相細(xì)胞，在ιοοχ 1〇倍油鏡下進(jìn)行染 色體計(jì)數(shù)和顯微照相。結(jié)果如圖3和圖4所示，處于有絲分裂中期分裂相的體細(xì)胞分布相 對(duì)集中，染色體分散良好、著色深背景色相對(duì)淺反差大易觀察染色體，適合染色體計(jì)數(shù)或進(jìn) 行核型分析，經(jīng)計(jì)數(shù)染色體數(shù)目2n=28。
[0034] 實(shí)施例3 :與實(shí)施例1基本相同，所不同的是步驟（2)和步驟（3)和步驟（4): 步驟（2):將二倍體矮牽牛幼蕾分開放置于0. 002mol. L_1 8-羥基喹啉水溶液中6Γ低 溫避光預(yù)處理3小時(shí)，蒸餾水沖洗5次吸水紙吸干水后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液固定12小時(shí)，經(jīng) 體積濃度95%、體積濃度80%乙醇依次沖洗然后轉(zhuǎn)入體積濃度 7〇%乙醇中4?保存?zhèn)溆茫?步驟（3):將步驟（2)中備用的幼蕾先用蒸餾水沖洗5次，再用吸水紙吸干水，再經(jīng) 〇· 〇75m〇l. Γ1氯化鉀溶液進(jìn)行低滲10分鐘，在1 mol· L_1HC1溶液60°c水浴解離5分鐘，蒸 Μ水沖洗5次后蒸餾水低滲30分鐘，吸水紙吸千水。
[0035] (4)將步驟（3)中低滲處理后的花蕾轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度為1%洋紅染色液，在4°C低溫 Τ染色24小時(shí)，得到染色后的幼蕾。
[QQ36] 實(shí)施例4:與實(shí)施例2基本相同，所不同的是步驟（2):將四倍體矮牽牛幼蕾分開放 置于〇. 002mol. L-1 8-羥基喹啉水溶液中2?低溫避光預(yù)處理3小時(shí)，蒸餾水沖洗3次吸水 紙吸干水后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液固定18小時(shí)，經(jīng)體積濃度％%、體積濃度80%乙醇依次沖洗然 后轉(zhuǎn)入體積濃度70%乙醇中4Γ保存?zhèn)溆谩?br> 【權(quán)利要求】
1. 一種矮牽牛染色體的制片方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 于晴天早晨8:00-10:00取二倍體、四倍體矮牽牛長(zhǎng)度分別為3飛咖1和5?8圓的不 包含萼片的幼蕾； (2) 分別將二、四倍體矮牽牛幼蕾分開放置于0· 002mol. Γ1 8-羥基喹啉水溶液中 2-6°C低溫避光預(yù)處理3小時(shí)，蒸餾水沖洗3-5次吸水紙吸干水后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液固定 12-24小時(shí)，經(jīng)體積濃度95%、體積濃度80%乙醇依次沖洗然后轉(zhuǎn)入體積濃度70%乙醇中4°C 保存?zhèn)溆茫? (3) 將步驟（2)中備用的幼蕾先用蒸餾水沖洗3-5次，再用吸水紙吸干水，再經(jīng) 0· 〇75mol. Γ1氯化鉀溶液進(jìn)行低滲10分鐘，在1 mol. L-1HC1溶液6(TC水浴解離5分鐘，蒸 餾水沖洗3-5次后蒸餾水低滲30分鐘，吸水紙吸干水； (4) 轉(zhuǎn)入體積百分濃度為45%的醋酸溶液配制的質(zhì)量濃度為丨％的洋紅染色液中，在 2-6°C低溫下染色12-24小時(shí)； (5) 用鑷子分別將二、四倍體矮牽牛幼蕾移入載玻片上，用刀片切取雌蕊中的柱頭部位 去除其余部位，用另外一塊載玻片十字交叉覆蓋，用力按壓不可移動(dòng)，分開兩載玻片，在兩 片載玻片上材料處分別滴上1-2滴1%洋紅染色液，垂直覆上蓋玻片，用吸水紙吸去溢出蓋 玻片外多余洋紅染色液；在蓋玻片上覆蓋5-6層吸水紙，一手壓緊吸水紙，另一手用鉛筆尾 端垂直均勻敲擊蓋玻片直至材料呈現(xiàn)霧狀分散開，，再用拇指垂直用力按壓玻片10秒，按 壓時(shí)蓋玻片不能移動(dòng)，玻片置于酒精燈外焰來(lái)回晃動(dòng)拷片1-2秒；先在低倍鏡下找出處于 有絲分裂中期分裂相細(xì)胞，在100X10倍油鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和顯微照相。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種矮牽牛染色體的制片方法，其特征在于，步驟（2)中所述 卡諾氏固定液是由無(wú)水乙醇和冰醋酸按體積比3:1制成的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種矮牽牛染色體的制片方法，其特征在于，步驟（4)中所述 45% (體積百分濃度）醋酸溶液配制的1% (質(zhì)量濃度）洋紅染色液配制方法為：先加入45tnl 乙酸再加水55ml混勻得到l〇〇ml體積濃度為45%醋酸溶液，然后將洋紅粉末1克緩慢倒入 上述醋酸溶液中，邊煮邊攪拌，過(guò)濾后的濾液即為得到質(zhì)量濃度為1%的洋紅染色液。
4·根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種矮牽牛染色體的制片方法，其特征在于，在質(zhì)量濃度為 1%的洋紅染色液煮沸冷卻后加質(zhì)量濃度為4%的鐵明礬溶液1?2滴，過(guò)濾后即可。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK104215485SQ201410453232
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】魏躍, 嵇怡, 樊開青, 劉艷, 張瑩, 史紅林, 陳嘯寅, 顏志明, 王全智 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院