一種總膽汁酸的測(cè)定試劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種總膽汁酸的測(cè)定試劑，該試劑包含兩個(gè)組份：試劑1：磷酸鹽緩沖液、Thio-NAD、EMULGENB-66?CTAB、NaCl?、2-羥基吡啶-N-氧化物；試劑2：甘氨酸鹽緩沖液、硫酸葡聚糖、EGTA、3α-HSD、EMULGENB-66、NADH、2-羥基吡啶-N-氧化物。本發(fā)明通過(guò)加入陽(yáng)離子和非離子表面活性劑EMULGENB-66?的組合，有效消除了膽紅素的干擾；本品加入選定的穩(wěn)定劑，使試劑在2-8度保存1年而不影響其性能；通過(guò)調(diào)整底物濃度和離子強(qiáng)度，使試劑的回收率到達(dá)98%以上。本發(fā)明試劑具有測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，抗干擾能力強(qiáng)，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種總膽汁酸的測(cè)定試劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種體外診斷試劑，特別是一種總膽汁酸的測(cè)定試劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 血清總膽汁酸可同時(shí)反映肝臟細(xì)胞分泌、合成、損傷三個(gè)方面狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)表明總 膽汁酸對(duì)肝硬化、肝癌的檢測(cè)陽(yáng)性率高達(dá)95%，總膽汁酸檢測(cè)的普及使得各類(lèi)急慢性肝炎、 肝硬化，乃至肝癌病人的早期診斷有了較為有效的依據(jù)，臨床診斷意義非常大。
[0003] 早在上世紀(jì)70年代，挪威科明公司采用3 α -羥基類(lèi)固醇脫氫酶（3 a -HSD)成功 的生產(chǎn)出第一代酶法膽汁酸試劑，使膽汁酸的測(cè)定真正的進(jìn)入了臨床領(lǐng)域。隨后總膽汁酸 測(cè)定的方法發(fā)展較快，目前臨床上應(yīng)用的是第五代酶法測(cè)定試劑。其反應(yīng)原理如下：膽汁 酸會(huì)被3 α -羥甾醇脫氫酶(亦為類(lèi)固醇脫氫酶，3 a-HSD)以及β -硫代煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸氧化型(簡(jiǎn)稱(chēng)硫代輔酶：Thio-NAD)特異性地氧化，生成3-酮類(lèi)固醇以及β -硫代煙 酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型（Thio-NADH)。此外生成的3-酮類(lèi)固醇在3 α -羥留醇脫氫酶 (3 a -HSD)及β -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型（NADH)存在下，生成膽汁酸及β -煙酰胺 腺嘌呤二核苷酸氧化型（NAD)。如上所述，依據(jù)循環(huán)酶而放大微量的膽汁酸量，測(cè)定單位時(shí) 間內(nèi)生成的β -硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型（Thio-NADH)在405nm處的吸光度變 化，以求得膽汁酸的濃度。
[0004] 目前使用的絕大部分總膽汁酸試劑的穩(wěn)定性都較差，產(chǎn)品在冷藏條件下的有效期 絕大多數(shù)都在10個(gè)月以下，37度熱穩(wěn)定性在5天以下，試劑開(kāi)瓶穩(wěn)定在兩周之內(nèi)（測(cè)定值不 斷下降）；并且多數(shù)品牌總膽汁酸試劑膽紅素負(fù)干擾明顯，且試劑的回收率低，多數(shù)試劑回 收率在80%左右，有的甚至低達(dá)60%，以致臨床樣本經(jīng)常出現(xiàn)負(fù)值。因此，目前多數(shù)廠家試劑 在應(yīng)用上存在很多的局限性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是提供一種穩(wěn)定性好，抗干擾能力強(qiáng)，回收率高的總膽汁酸測(cè)定 試劑。
[0006] -種總膽汁酸的測(cè)定試劑，該試劑由試劑1和試劑2組成，其特征在于，試劑1由 磷酸鹽緩沖液、Thio-NAD、EMULGEN B-66、CTAB、NaCl 2-羥基吡啶-N-氧化物組成； 試劑2由甘氨酸鹽緩沖液、硫酸葡聚糖、EGTA、3a-HSD、EMULGEN B-66、NADH2-羥基吡 啶-N-氧化物組成。
[0007] 其中該試劑的組份濃度為： 試劑1 : 磷酸鹽緩沖液 2-6g/L Thio-NAD 1· 3-1. 7 g /L EMULGEN B-66 0· 3_2ml/L CTAB 0. 1-1. 5g/L NaCl 3-25g/L 2-羥基吡啶-N-氧化物 0. 1-1. 2g/L 試劑2 : 甘氨酸鹽緩沖液 10-20g/L 硫酸葡聚糖 1. 2-7g/L EGTA l-5g/L 3 a -HSD 10KU/L EMULGEN B-66 l_3ml/L NADH 3g/L 2-羥基吡啶-N-氧化物 0. 1-1. 2g/L。
[0008] 為了解決總膽汁酸的試劑穩(wěn)定性不好的問(wèn)題，本發(fā)明在試劑2組份中添加了穩(wěn)定 劑硫酸葡聚糖、EGTA以及聚氧乙烯基衍生物類(lèi)表面活性劑來(lái)增強(qiáng)3 a -HSD及NADH的穩(wěn)定 性；為了消除膽紅素的干擾，本發(fā)明通過(guò)在試劑1中添加非離子表面活性劑EMULGEN Β-66 和陽(yáng)離子表面活性劑CTAB的組合來(lái)提高試劑的抗干擾能力；本發(fā)明研究表明，提高試劑 1中Thio-NAD的含量及加入電解質(zhì)，能顯著的提高試劑的回收率，因此我們把試劑1中 Thio-NAD的含量由以前文獻(xiàn)報(bào)道的lg/L左右提高到1.5g/L，并加入了較多的NaCl，有效的 解決了總膽汁酸的測(cè)定試劑回收率低的問(wèn)題。
[0009] 上述添加劑的濃度范圍為： 硫酸葡聚糖：1.2-7g/L EGTA ：l-5g/L EMULGEN B-66 :0· 3-3ml/L CTAB ：0. 1-1. 5g/L NaCl ：3-25g/L Thio-NAD 1. 3-1. 7 g /L 。 上述試劑的使用方法： (1)樣品準(zhǔn)備：樣本為及時(shí)分離的空腹血清(或肝素抗凝血漿)。樣本收集后應(yīng)盡快測(cè) 定，必須避光保存，避免溶血和污染；血清中總膽汁酸在4°C可穩(wěn)定一周，冷凍可保存3個(gè) 月。
[0010] (2)采用全自動(dòng)生化儀對(duì)步驟（1)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，步驟如下： 試驗(yàn)條件：

【權(quán)利要求】
1. 一種總膽汁酸的測(cè)定試劑，該試劑由試劑1和試劑2組成，其特征在于，試劑1由 磷酸鹽緩沖液、Thio-NAD、EMULGEN B-66、CTAB、NaCl 2-羥基吡啶-N-氧化物組成； 試劑2由甘氨酸鹽緩沖液、硫酸葡聚糖、EGTA、3a-HSD、EMULGEN B-66、NADH2-羥基吡 啶-N-氧化物組成。
2. 如權(quán)利要求1所述的總膽汁酸的測(cè)定試劑，其特征在于，所述的試劑組成的各組份 濃度為： 試劑1 : 磷酸鹽緩沖液 2-6g/L Thio-NAD 1· 3-1. 5g/L EMULGEN B-66 0· 3_2ml/L CTAB 0. 1-1. 5g/L NaCl 3-25g/L 2-羥基吡啶-N-氧化物 0. 1-1. 2g/L ; 試劑2 : 甘氨酸鹽緩沖液 10-20g/L 硫酸葡聚糖 1. 2-7g/L EGTA l-5g/L 3 a -HSD 10KU/L EMULGEN B-66 l_3ml/L NADH 3g/L 2-羥基吡啶-N-氧化物 0. 1-1. 2g/L。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的總膽汁酸的測(cè)定試劑，其特征在于，所述的試劑組成的各組 份濃度為： 試劑1 : 磷酸鹽緩沖液 3g/L Thio-NAD 1.6g/L EMULGEN B-66 1ml/L CTAB lg/L NaCl 15g/L 2-羥基吡啶-N-氧化物 0. 3g/L ; 試劑2 : 甘氨酸鹽緩沖液 15g/L 硫酸葡聚糖 5g/L EGTA 2g/L 3 a -HSD 10KU/L EMULGEN B-66 2ml/L NADH 3g/L 2-羥基吡啶-N-氧化物 0. 3g/L。
【文檔編號(hào)】G01N33/52GK104155438SQ201410454839
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】黃俊潮, 李希文 申請(qǐng)人:湖北科技學(xué)院