一種基于分光光度法的活芽孢含量高通量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于分光光度法的檢測活芽孢含量的高通量檢測方法，利用芽孢一旦遇到合適的環(huán)境，就會迅速萌發(fā)，從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)生長狀態(tài)后芽孢折光性很強，而在萌發(fā)過程中，這些多層結(jié)構(gòu)吸水膨脹、折光性消失，導(dǎo)致光吸收下降。本發(fā)明以光吸收下降作為芽孢萌發(fā)活性的表征，用于評價芽孢繁殖活力的大小，可以大大簡化活芽孢含量檢測流程，克服傳統(tǒng)方法檢測工作量大、周期長和成本高等問題。
【專利說明】一種基于分光光度法的活芽孢含量高通量檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于分光光度法的檢測活芽孢含量的高通量檢測方法，屬于現(xiàn)代 微生物學技術(shù)和發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 芽孢是某些細菌在生長發(fā)育后期，在細胞內(nèi)形成的圓形或橢圓形的抗逆性內(nèi)生休 眠體。芽孢對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學藥品有很強抗性，可耐受各種不良甚至極端 環(huán)境。
[0003] 芽孢桿菌屬是一個重要的與人類關(guān)系極為密切的微生物類群。芽孢桿菌包含許多 有特殊功能的菌株，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學等科學領(lǐng)域研究中有廣泛的應(yīng)用價值，越來越引起 人們重視和研究。芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，以蠟狀芽孢桿菌為代表的諸多種類可 做飼料用微生物添加劑，提高飼料利用率，降低飼料成本，減少牲畜疾病發(fā)生；很多生物農(nóng) 藥也由芽孢桿菌制成，芽孢桿菌的許多種類是昆蟲的病原菌或者具有殺蟲活性，如蠟狀芽 孢桿菌、巨大芽孢桿菌、球形芽孢桿菌，尤其蘇云金芽孢桿菌及其伴胞晶體是農(nóng)業(yè)上良好的 殺蟲劑，已成為世界上產(chǎn)量最大的生物農(nóng)藥。另外，根據(jù)微生態(tài)學原理，對人體無害甚至有 益的芽孢桿菌還可以作為保健品或藥品服用，促進恢復(fù)菌群平衡，防治疾病和提高人類健 康水平；很多芽孢桿菌尤其是嗜堿性芽孢桿菌在強堿性環(huán)境中具有出色的礦化能力，近年 來還被用于建筑材料裂縫的修復(fù)與自修復(fù)研究。
[0004] 由于芽孢具有對不良環(huán)境的抗逆性，芽孢桿菌生物制劑大都采用芽孢的形式制 備，以確保在長時間內(nèi)具有穩(wěn)定的生物活性。而活芽孢含量是芽孢桿菌生物制劑質(zhì)量的重 要指標。
[0005] 傳統(tǒng)的檢測活芽孢含量的方法是基于濃度梯度稀釋和平板培養(yǎng)的活菌菌落計數(shù) 法。然而，該方法需要進行大量的稀釋、涂板、培養(yǎng)、計數(shù)等工作，存在工作量大、周期長、效 率低和成本高等缺點。
[0006] 芽孢一旦遇到合適的環(huán)境，就會迅速萌發(fā)，從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)生長狀態(tài)。芽孢 可以被諸如肌苷、L-丙氨酸、葡萄糖、十二烷胺等物質(zhì)誘導(dǎo)萌發(fā)。芽孢的含水量低（40%)， 具有厚而致密的多層結(jié)構(gòu)，折光性很強，而在萌發(fā)過程中，這些多層結(jié)構(gòu)吸水膨脹、折光性 消失，導(dǎo)致光吸收下降。因此以光吸收下降作為芽孢萌發(fā)活性的表征，用于評價芽孢繁殖活 力的大小，可以大大簡化活芽孢含量檢測流程，克服傳統(tǒng)方法的固有缺點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服檢測活芽孢含量通常所采用的常規(guī)方法存在的工作量大、周期長和成本 高等問題，本發(fā)明提供了一種基于非培養(yǎng)和酶標儀光吸收檢測的高通量檢測方法。
[0008] 高通量檢測活芽孢含量的方法如下：
[0009] 采用合適的培養(yǎng)條件培養(yǎng)待測菌種，芽孢比率達到95 %以上時，取發(fā)酵液 4000-6000 Xg離心10-20min，加入去離子水，制備高存活率的萌發(fā)芽孢水懸液，通過調(diào)整 加入去離子水的體積，調(diào)整其OD49tl值為0. 5-1. 7 ;采用傳統(tǒng)活菌菌落計數(shù)法檢測該芽孢懸 液的活芽孢濃度；
[0010] 選擇一種在待測菌種芽孢萌發(fā)條件下不能萌發(fā)的產(chǎn)芽孢菌種作為非萌發(fā)芽孢的 來源，采用合適的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，通過4000-6000 X g離心10-20min，加入去離子水，制 備兩種不同芽孢濃度的非萌發(fā)芽孢水懸液：一種的OD49tl與高存活率待測芽孢水懸液相同， 用于制備標準曲線；另一種芽孢濃度高達IX IOici-SXIOici個/ml，用作待測樣品的光密度調(diào) 節(jié)劑。
[0011] 將上述萌發(fā)芽孢水懸液和非萌發(fā)芽孢水懸液分別以0 :1〇，1 :9,2 :8,4 :6,6 :4， 8 :2，10 :0的體積比混勻，制備萌發(fā)芽孢比率占總芽孢比率分別為0%，10%，20%，40%， 60^,80%, 100%的芽孢懸浮液，若（a)步驟中所獲得的萌發(fā)芽孢水懸液活芽孢濃度為A 個/ml，以上梯度濃度芽孢懸液的活芽孢濃度依次為則0，0· 1A，0· 2A，0· 4A，0· 6A，0· 8A， A。將以上芽孢懸浮液放入水浴鍋熱激處理，60-80°C加熱10-30分鐘。熱激處理后分別取 10-190 μ L加入多孔板中，再加入一定體積萌發(fā)緩沖液補足至200-300 μ L，混勻，制成萌發(fā) 反應(yīng)液，利用酶標儀檢測反應(yīng)液的初始OD值，之后將多孔板放于28-37°C恒溫培養(yǎng)箱中反 應(yīng)1. 5-3小時后，檢測終點OD值，計算不同芽孢懸浮液的OD下降值，以O(shè)D下降值為橫坐標， 相應(yīng)的活的萌發(fā)芽孢濃度作為縱坐標，繪制標準曲線，并擬合獲得標準曲線公式。
[0012] 若待測樣品為粉劑，用去離子水在離心管或試管中將芽孢制成水懸液，通過調(diào)整 去離子水的加入量，將芽孢懸液調(diào)至OD 49tl值與步驟高存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD49tl值相等； 若待測樣品為水懸液而且OD 49tl小于0. 5,則向該芽孢懸液中加入光密度調(diào)節(jié)劑使其OD49tl值 與高存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD49tl值相等；若芽孢制品為水懸液而OD 49tl大于1. 7,則向該芽 孢懸液中加去離子水使其OD49tl值與步驟高存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD49tl值相等。將盛有待 測芽孢懸浮液的離心管或試管放入水浴鍋，60-80°C加熱10-30分鐘。
[0013] 分別取與標準曲線制備中芽孢懸浮液相同體積的該待測芽孢懸浮液加入多孔板 中作為實驗組；將剩余芽孢懸液4000-6000g離心5-15min，分別取等體積上清液加入多孔 板中作為對照組；向各孔中加入一定體積芽孢萌發(fā)緩沖液，混勻。
[0014] 光密度值檢測與光密度下降值計算：利用酶標儀檢測實驗組和對照組中芽孢萌發(fā) 反應(yīng)液的初始OD值；檢測完成后，將多孔板放于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1. 5-3小時，期間 每隔30分鐘混勻1次。培養(yǎng)完成后，利用酶標儀檢測實驗組和對照組的芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的 終點OD值。按照以下公式計算OD下降值A(chǔ)0D，將AOD值代入步驟c所獲得的標準曲線公 式，計算獲得活芽孢含量。
[0015] Λ OD =( Λ OD1+ Λ OD2+ Λ OD3) + 3 - ( Λ ODC1+ Λ ODC2+ Λ ODC3) + 3 其中 Λ ODn 為實驗 組第η個孔中芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的初始OD值與終點初始OD的差值；Λ ODen為對照組第η個 孔中芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的初始OD值與終點初始OD的差值。
[0016] 所述待測樣品可以是含有芽孢的發(fā)酵液，也可是粉狀的生物制劑。
[0017] 所述高存活率芽孢的發(fā)酵，根據(jù)待測菌種不同，需采用不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
[0018] 所述非萌發(fā)芽孢菌種，根據(jù)待測菌種不同，需要從不同類群中選擇，如若待測菌株 為嗜堿性芽孢桿菌，則可選擇嗜中性PH芽孢桿菌作為非萌發(fā)芽孢的來源；而若待測菌株為 嗜中性PH芽孢桿菌，則可選擇嗜堿性芽孢桿菌作為非萌發(fā)芽孢桿菌的來源；若待測菌株為 嗜鹽芽孢桿菌，則可選擇不耐鹽的芽孢桿菌作為非萌發(fā)芽孢桿菌來源。若待測菌株為不耐 鹽的芽孢桿菌，則可選擇嗜鹽芽孢桿菌作為非萌發(fā)芽孢桿菌來源；還可以將待測菌株芽孢 以121°C滅菌15min的死芽孢作為非萌發(fā)芽孢；
[0019] 所述芽孢萌發(fā)緩沖劑包括芽孢萌發(fā)劑、滲透調(diào)節(jié)劑、PH緩沖劑。
[0020] 所述芽孢萌發(fā)劑為以下化合物之一，肌苷、黃苷、鳥苷、腺苷、丙氨酸、甘氨酸、丙氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、葡萄糖、果糖、 肽聚糖、甘露醇、蔗糖、十二烷胺、溶菌酶、苔蘚蟲素、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、大 ?蛋白腺、釀蛋白。
[0021] 所述pH緩沖劑，根據(jù)待測菌種芽孢萌發(fā)對不同pH的依賴性，選擇以下緩沖劑 中可以提供最適萌發(fā)PH的緩沖劑：磷酸鹽緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑、草酸 鹽緩沖劑、酒石酸鹽緩沖劑、苯二甲酸氫燕緩沖劑、甘氨酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液、氨-氯 化銨緩沖液、AMP (2-氨基-2甲基-1-丙醇）、AMPD (2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇）、 AMPSO (3- [ (I. 1-二甲基-2-羥乙基氨基]-2-羥基丙磺酸）、BES (N，N-雙（2-羥乙基）-2-氨 基乙磺酸）、TRIS(三羥甲基氨基甲烷）、CAPS(3-(環(huán)己胺）-1-丙磺酸）、CAPS0(3-(環(huán)己 胺）-2-羥基-1-丙磺酸）、CHES (2-(環(huán)已胺）-3-乙磺酸）、HEPPS (4-羥乙基哌嗪丙磺酸）、 HEPPSO (3-(羥乙基哌嗪）-2-羥基丙磺酸）、HEPBS (N- (2-羥乙基）哌嗪-Ν' -4- 丁磺酸）、 MOPS (3-嗎啉丙磺酸）、、MOPSO (3- (Ν-嗎啉基）-2-羥基丙磺酸）TAPS (Ν-三（羥甲基）甲 基-3-氨基丙烷磺酸）、TAPSO (3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸）。
[0022] 滲透調(diào)節(jié)劑可以為以下化合物之一，氯化鈉，氯化鉀。
[0023] 芽孢萌發(fā)劑濃度為1-lOOmM，pH緩沖劑濃度為20-2M，滲透調(diào)節(jié)劑濃度為10mM-6M。
[0024] 所述滲透調(diào)節(jié)劑濃度，根據(jù)待測菌種芽孢萌發(fā)對鹽度的依賴性，選擇10mM_3M范 圍內(nèi)合適的濃度；
[0025] 所述芽孢萌發(fā)光吸收下降的檢測波長為450nm-750nm。
[0026] 所述多孔板包括6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板任意一種。
[0027] 所述芽孢萌發(fā)緩沖劑與待測芽孢懸浮液體積比在1:9到9:1范圍內(nèi)。
[0028] 本方法實現(xiàn)了活芽孢含量的高通量檢測。以芽孢萌發(fā)引起的光吸收下降作為活芽 孢含量的表征的新方法，不依賴培養(yǎng)，不需要無菌操作，而且利用酶標儀可以快速檢測光吸 收值。本發(fā)明新方法的效率高，速度快；反應(yīng)和檢測體系微型化，消耗試劑少，成本低；容易 實現(xiàn)自動化操作，借助自動化高通量篩選工作站可以進一步大幅降低工作量，提高檢測效 率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1.光吸收法檢測活芽孢含量標準曲線；
[0030] 圖2.酵母粉濃度對活芽孢產(chǎn)量的影響；
[0031] 圖3.淀粉濃度對活芽孢產(chǎn)量的影響；
[0032] 圖4.氯化鈉濃度對活芽孢產(chǎn)量的影響；
[0033] 圖5.裝液量對活芽孢產(chǎn)量的影響；
[0034] 圖6. pH對活芽孢產(chǎn)量的影響。
[0035] 在附圖中：·，實心圓為光吸收法獲得的活芽孢檢測結(jié)果；〇，空心圓為傳統(tǒng)活菌 菌落計數(shù)法獲得的活芽孢濃度檢測結(jié)果。

【具體實施方式】
[0036] 以下通過實施例對本發(fā)明進行更為具體的說明，實施例中所提及的內(nèi)容并非對本 發(fā)明的限定。
[0037] 酵母粉濃度對Bacillus sp. H4活芽孢產(chǎn)量的影響，比較常規(guī)菌落計數(shù)方法和本發(fā) 明所述方法獲得的結(jié)果，以驗證分光光度法的可行性。
[0038] 待測菌株Bacillus sp. H4為一株嗜堿芽孢桿菌，選擇嗜中性pH的菌株Bacillus subtilis ATCC6051作為非萌發(fā)芽孢的來源。將Bacillus sp.H4以8mm間距點接種于堿性 全酵母固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7-10天。將Bacillus subtilis ATCC6051以8mm間距點接種 于全酵母固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7-10天。用滅菌牙簽將固體培養(yǎng)基上的Bacillus subtilis ATCC6051菌落挑入滅菌去離子水中，制備成2種不同芽孢濃度的芽孢懸浮液，一種OD49tl為 1. 7的非萌發(fā)芽孢懸浮液，另一種采用YK-Heber型細菌計數(shù)板計數(shù)細胞濃度調(diào)整濃度至 2X IOltl個/ml，作為光密度調(diào)節(jié)劑；用滅菌牙簽將固體培養(yǎng)基上的Bacillus sp. H4菌落 挑入滅菌去離子水中，制備成萌發(fā)芽孢懸浮液，使其OD49tl為1.7,采用熱激處理（60°C水浴 30min)、菌落計數(shù)法和堿性全酵母固體培養(yǎng)基檢測該芽孢懸浮液的活芽孢濃度。
[0039] 按下表將非萌發(fā)芽孢懸浮液（OD49tl為L 7的Bacillus subtilisATCC6051芽孢懸 浮液）和萌發(fā)芽孢懸浮液（OD49tl為I. 7BaciIlus sp. H4芽孢懸浮液），按不同比率配制成含 有不同濃度BacilIus sp.H4芽抱，但BaciIlus subtilis ATCC6051 芽抱與BaciIlus sp.H4 芽孢的總和相同的8種芽孢懸浮液。該表中8種芽孢懸浮液進行熱激處理，60°C水浴加熱 30min，之后每種各取25 μ L分別加入96孔板的5個孔中，再用300 μ L多通道移液器迅速 向每個孔中加入萌發(fā)緩沖劑175 μ L并混勻。利用酶標儀檢測每個孔的OD49tl值，檢測完成 后將96孔板放于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)2小時后，用300 μ L多通道移液器混勻，迅速 放于酶標儀中檢測每個孔的OD49tl值，計算獲得OD49tl下降值，以這8種芽孢懸浮液的OD下降 值為橫坐標，以相應(yīng)的Bacillus sp. Η4活芽孢含量為橫坐標，繪制如圖1所示的活芽孢含 量-OD下降值標準曲線。8種芽孢懸浮液的活芽孢含量分別為各自Bacillus Sp.H4芽孢百 分比與OD為1. 7的萌發(fā)芽孢懸浮液活芽孢含量的乘積。
[0040] 將在堿性1^培養(yǎng)液中150印111301：震蕩培養(yǎng)16小時的8&(^11118 8?.!14按8%接 種量分別接種于含有不同酵母粉濃度的MMN培養(yǎng)基（硝酸鹽無機培養(yǎng)基），如圖2所示，酵 母粉濃度分別為0、0.5、1、2、3、4、6、8、1(^/1，150印111，301：發(fā)酵7-10天 ；如圖3所示，將以 上16小時種子培養(yǎng)物接種于MMN發(fā)酵液裝液量分別為25、50、75、100、125、150ml的250ml 三角瓶中，150rpm，30°C發(fā)酵7-10天；將以上16小時種子培養(yǎng)物按8%接種量接種于不同 pH 的 MMN 發(fā)酵液，如圖 4 所示，pH 分別為 10·95、10·36、9·99、9·64、9· 16，，150rpm，30°C 發(fā) 酵7-10天；將以上16小時種子培養(yǎng)物按8%接種量接種于不同淀粉濃度的MMN培養(yǎng)基，如 圖5所示，淀粉濃度分別為1、2、4、6、10、15、2(^/1，150印111，301：發(fā)酵7-10天 ；將以上16小 時種子培養(yǎng)物按8%接種量接種于不同氯化鈉含量的MMN培養(yǎng)基，如圖6所示，氯化鈉濃度 分別為 0、4、8、16、32、64、128g/L，150rpm，30°C發(fā)酵 7-10 天。
[0041] 采用熱處理-傳統(tǒng)活菌菌落計數(shù)法檢測以上不同MMN培養(yǎng)液中活芽孢含量。
[0042] 采用新發(fā)明方法檢測以上不同MMN培養(yǎng)液中活芽孢含量：發(fā)酵液采用6000Xg離 心15min，加入等體積去離子水，取I. 5ml該芽孢懸浮液加入比色皿中，用721型分光光度計 檢測OD49tl值，向OD49tl低于1. 7的發(fā)酵液中加光密度調(diào)節(jié)劑，使其OD49tl達到1. 7,向OD49tl高 于1. 7的發(fā)酵液中加去離子水，使其OD49tl減小到1. 7 (芽孢發(fā)酵收獲的芽孢懸液OD49tl -般 不會超過1. 7)。將調(diào)整好OD值的芽孢懸浮液進行熱激處理，60°C水浴加熱30min，之后每 種各取25 μ L分別加入96孔板的5個孔中，再用300 μ L多通道移液器迅速向每個孔中加 入萌發(fā)緩沖劑175 μ L并混勻。利用酶標儀檢測每個孔的OD49tl值，檢測完成后將96孔板放 于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)2小時后，用300 μ L多通道移液器混勻，迅速放于酶標儀中檢 測每個孔的OD49tl值，計算獲得OD49tl下降值，將OD 49tl下降值帶入標準曲線公式，求出活芽孢 含量。
[0043] 兩種方法所測得不同濃度酵母粉發(fā)酵液中活芽孢含量如圖2所示；兩種方法所測 得不同裝液量條件下發(fā)酵液中活芽孢含量如圖3所示；兩種方法所測得不同pH條件下發(fā)酵 液中活芽孢含量如圖4所示；兩種方法所測得不同淀粉含量的發(fā)酵液中活芽孢含量如圖5 所示；兩種方法所測得不同濃度氯化鈉發(fā)酵液中活芽孢含量如圖6所示。由圖示可知，兩種 方法所得測試結(jié)果基本保持一致，說明本發(fā)明所述的方法有效且準確。
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于分光光度法的活芽孢含量高通量檢測方法，其步驟是： a) 高存活率萌發(fā)芽孢的制備：針對待測菌種，采用合適的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)并制備高 存活率的萌發(fā)芽孢水懸液，調(diào)整其OD49tl值為0. 5-1. 7 ;采用傳統(tǒng)活菌菌落計數(shù)法檢測該芽 孢懸液的活芽孢濃度； b) 非萌發(fā)芽孢的制備：選擇一種在待測菌種芽孢萌發(fā)條件下不能萌發(fā)的產(chǎn)芽孢菌種 作為非萌發(fā)芽孢的來源，采用合適的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，制備兩種不同芽孢濃度的非萌發(fā) 芽孢水懸液：一種的OD 49tl與高存活率待測芽孢水懸液相同，用于制備標準曲線；另一種芽 孢濃度高達I X 101(|-5 X IOltl個/ml，用作待測樣品的光密度調(diào)節(jié)劑。 c) 標準曲線的制備：將上述萌發(fā)芽孢水懸液和非萌發(fā)芽孢水懸液以不同體積比混勻， 制備含有梯度濃度萌發(fā)芽孢的芽孢懸浮液，其活的萌發(fā)芽孢濃度根據(jù)體積比與（a)步驟中 所獲得的萌發(fā)芽孢水懸液活芽孢濃度計算獲得。將以上含有梯度濃度萌發(fā)芽孢的不同芽孢 懸浮液放入水浴鍋熱激處理，60-80°C加熱10-30分鐘。熱激處理后分別取50-150 ii L加入 多孔板中，再加入一定體積萌發(fā)緩沖液，混勻，制成萌發(fā)反應(yīng)液。利用酶標儀檢測反應(yīng)液的 初始OD值，之后將多孔板放于28-37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)1. 5-3小時后，檢測終點OD值。 計算不同濃度萌發(fā)芽孢的芽孢懸浮液的OD下降值，以O(shè)D下降值為橫坐標，相應(yīng)的活的萌發(fā) 芽孢濃度作為縱坐標，繪制標準曲線，并擬合獲得標準曲線公式。 d) 待測樣品的預(yù)處理：若待測樣品為粉劑，用去離子水在離心管或試管中將芽孢制成 水懸液，通過調(diào)整去離子水的加入量，將芽孢懸液調(diào)至OD 49tl值與步驟（a)中高存活率萌發(fā) 芽孢水懸液OD49c!值相等；若待測樣品為水懸液而且OD 49c!小于0. 5,則向該芽孢懸液中加入 光密度調(diào)節(jié)劑使其OD49tl值與步驟（a)中高存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD 49tl值相等；若芽孢制 品為水懸液而OD49tl大于1. 7,則向該芽孢懸液中加去離子水使其OD49tl值與步驟（a)中高 存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD49tl值相等。將盛有待測芽孢懸浮液的離心管或試管放入水浴鍋， 60-80°C加熱 10-30 分鐘。 e) 待測樣品的萌發(fā)反應(yīng)：分別取與標準曲線制備中芽孢懸浮液相同體積的該待測芽 孢懸浮液加入多孔板中作為實驗組；將剩余芽孢懸液4000-6000g離心5-15min，分別取等 體積上清液加入多孔板中作為對照組；向各孔中加入一定體積芽孢萌發(fā)緩沖液，混勻。 f) 光密度值檢測與光密度下降值計算：利用酶標儀檢測實驗組和對照組中芽孢萌發(fā) 反應(yīng)液的初始OD值；檢測完成后，將多孔板放于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1. 5-3小時，期間 每隔30分鐘混勻1次。培養(yǎng)完成后，利用酶標儀檢測實驗組和對照組的芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的 終點OD值。按照以下公式計算OD下降值A(chǔ)0D，將AOD值代入步驟c所獲得的標準曲線公 式，計算獲得活芽孢含量。 A OD =( A OD1+ A OD2+ A OD3) + 3 - ( A ODci+ A ODc2+ A ODc3) + 3 其中 A ODn 為實驗組第 n個孔中芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的初始OD值與終點初始OD的差值；△ ODen為對照組第n個孔中芽 孢萌發(fā)反應(yīng)液的初始OD值與終點初始OD的差值。
2. 如權(quán)利要求1所述活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于采用加入芽孢光密度 調(diào)節(jié)劑的方法調(diào)節(jié)待測芽孢懸浮液樣品OD值至某一定值。
3. 如權(quán)利要求2所述的活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于使用芽孢作為芽孢 光密度調(diào)節(jié)劑。
4. 如權(quán)利要求1所述的活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于芽孢萌發(fā)緩沖液包 括芽孢萌發(fā)劑、pH緩沖劑、滲透調(diào)節(jié)劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于芽孢萌發(fā)劑濃度為 1-lOOmM，pH緩沖劑濃度為20-100mM，滲透調(diào)節(jié)劑濃度為50-600mM。
6. 如權(quán)利要求4所述的活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于所述芽孢萌發(fā)劑為 肌苷、黃苷、鳥苷、腺苷、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨 酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷 氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、葡萄糖、果糖、肽聚糖、甘露醇、蔗糖、十二烷胺、溶菌酶、苔蘚 蟲素、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白其中任意一種。
7. 如權(quán)利要求5所述的活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于pH緩沖劑為磷酸 鹽緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑、草酸鹽緩沖劑、酒石酸鹽緩沖劑、苯二甲酸氫燕緩 沖劑、甘氨酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液、氨 -氯化銨緩沖液、AMP (2-氨基-2甲基-1-丙醇）、 AMPD (2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇）、AMPSO(3-[(l. 1-二甲基-2-羥乙基氨基]-2-羥 基丙磺酸）、BES(N，N-雙（2-羥乙基）-2_氨基乙磺酸）、TRIS(三羥甲基氨基甲烷）、 CAPS (3-(環(huán)己胺）-1-丙磺酸）、CAPSO (3-(環(huán)己胺）-2-羥基-1-丙磺酸）、CHES (2-(環(huán)已 胺）-3-乙磺酸）、HEPPS (4-羥乙基哌嗪丙磺酸）、HEPPSO (3-(羥乙基哌嗪）-2-羥基丙磺 酸）、HEPBS (N- (2-羥乙基）哌嗪-N' -4- 丁磺酸）、M0PS (3-嗎啉丙磺酸）、、M0PS0 (3- (N-嗎 啉基）-2-羥基丙磺酸）TAPS (N-三（羥甲基）甲基-3-氨基丙烷磺酸）、TAPSO (3-三羥甲 基甲胺-2-羥基丙磺酸）其中任意一種。
8. 如權(quán)利要求4所述的活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于滲透調(diào)節(jié)劑為氯化 鈉、氯化鉀其中任意一種。
9. 如權(quán)利要求1所述的活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于檢測芽孢萌發(fā)的光 吸收波長為450nm-750nm。
10. 如權(quán)利要求1所述的活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于多孔板包括6孔 板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板其中任意一種。
11. 如權(quán)利要求1所述的活芽孢含量的高通量檢測方法，其特征在于芽孢萌發(fā)緩沖劑 與待測芽孢懸浮液體積比在1:9到9:1范圍內(nèi)。
【文檔編號】G01N21/31GK104316475SQ201410459641
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】張金龍, 鄧旭, 邢鋒, 盧靖坤, 柳秋月, 張妙君, 靳帆 申請人:深圳大學