N-乙酰氨基葡萄糖在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了N-乙酰氨基葡萄糖在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案對很多腫瘤的檢出率都在90％以上，腫瘤特異性在95％以上。這必將大大提高腫瘤的早期診斷率。本發(fā)明適于在正常人群中做腫瘤早期普查。
【專利說明】N-乙酰氨基葡萄糖在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種N-乙酰氨基葡萄糖在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]自20世紀(jì)80年代，專家利用雜交瘤技術(shù)獲得了能識別腫瘤特異性大分子糖蛋白抗原(carbohydrate antigen, CA),并研制了單克隆抗體識別系統(tǒng)。發(fā)展至今在目前腫瘤體外早期診斷試劑領(lǐng)域，存在競爭性分析和非競爭性夾心分析兩種分析方法。從實驗室檢測的角度，腫瘤標(biāo)志物分為血清/血漿腫瘤標(biāo)志物與組織細(xì)胞腫瘤標(biāo)志。血清/血漿腫瘤標(biāo)志物大致分為三類:1)胚胎抗原。胚胎期表達(dá)、正常成人不表達(dá)、伴隨腫瘤發(fā)生又重新表達(dá)的抗原，如AFP、CEA。2)腫瘤相關(guān)糖脂及糖蛋白。CA199、CA50、CA242、CA724、CA125、CA153等。3)激素肽、酶、蛋白。這些在正常組織中有表達(dá)，但是在腫瘤組織中只是過量表達(dá)的抗原。PSA、NSE、TPA等。對這些腫瘤標(biāo)志物的檢測也發(fā)展出很多微量免疫檢測技術(shù)，比如:1959年Berson與Yalow創(chuàng)立了放射免疫測定(rad1immunoassay, RIA), 1971年瑞典的 Engvall 建立了酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以及近期的化學(xué)發(fā)光免疫測定(chemluminescence immunoassay, CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫測定(electrochemiluminesence immunoassay, ECLI)、時間分辨突光免疫測定(time-resolvedf luoroimmunoassay, TRFIA)。目前對于任何一個腫瘤標(biāo)志物不管采用那種測定技術(shù),鑒定腫瘤和非腫瘤患者不是100%準(zhǔn)確的。比如AFP對原發(fā)性肝癌的特異性為70% ；CEA對結(jié)腸癌特異性為60%、胰腺癌為80%、胃癌為60%、肺癌為75%和乳腺癌為60% ；CA125對卵巢癌為82% ;CA153對乳腺癌早期為75% ;CA724對胃癌為42%，NSE對小細(xì)胞肺癌為70%。以上的標(biāo)志物并不是廣譜的，大都只能診斷一種或幾種腫瘤，并且以CEA為例，其對胰腺癌診斷效果最好，為80%，雖然對結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌也有效，但最低的特異性僅有60%，換句話說，40%是會漏診的。腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)與診斷，對于提高患者治愈率、延長患者生命是至關(guān)重要的，致力于腫瘤研究的學(xué)者在探索和尋找有效的腫瘤標(biāo)志從未松懈。
[0003]腫瘤早期診斷至今仍然是世界性難題，現(xiàn)用的腫瘤標(biāo)志物只能檢出約70%的腫瘤，且絕大多數(shù)已屬晚期?，F(xiàn)行腫瘤標(biāo)志物大都確切結(jié)構(gòu)尚不明確，難于復(fù)制。
[0004]現(xiàn)行商品試劑盒的模式分為兩類，夾心模式和競爭模式，且在腫瘤標(biāo)志物領(lǐng)域只有雙結(jié)合體的夾心模式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]基于上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供N-乙酰氨基葡萄糖在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明確立的新血清標(biāo)志物N-乙酰氨基葡萄糖是首個可以寫出分子式和結(jié)構(gòu)式的腫瘤抗原，結(jié)構(gòu)的明確使結(jié)合體的制備難題迎刃而解，意義非凡。
[0006]本發(fā)明提供的N-乙酰氨基葡萄糖在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用；其中，所述檢測腫瘤的試劑盒為以血清為檢測樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
[0007]所述應(yīng)用中，所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和賁門癌的一種或幾種。
[0008]N-乙酰氨基葡萄糖分子式=C8H15NO6，分子量:221.21，化學(xué)代號-GlcNAc，其結(jié)構(gòu)如圖1A所示它可以與載體蛋白偶聯(lián)得到抗原，制備可以檢測腫瘤的特異性結(jié)合體，如抗體、核酸適配體、凝集素等，這些特異性結(jié)合體可以與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合。
[0009]上述載體蛋白可以為常用的載體蛋白，如卵白蛋白(0VA)、牛血清白蛋白(BSA)與多管式載體血藍(lán)蛋白(KLH)，也可以為糖蛋白，如粘蛋白及其他的蛋白中的一種或幾種。
[0010]例如，在本發(fā)明的實施例中， 申請人:在血清中分離出了 N-乙酰氨基葡萄糖鏈接粘蛋白I (Mucinl,代號Mu)形成的本專利所提純的腫瘤抗原Mu-GIcNAc (代號MA153)，它鏈接的位置在粘蛋白I內(nèi)糖鏈的暴露端，見圖1B，粘蛋白I(Mu)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列為(-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-) x N,即粘蛋白I (Mu-)的氨基酸序列為:-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-的多次重復(fù)排列。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。
[0012]其中，所述檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)是能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì)。
[0013]所述檢測N-乙酰-D-氨基葡萄糖的物質(zhì)是能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體、適配體或凝集素。
[0014]所述能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體是以N-乙酰氨基葡萄糖為抗原的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0015]所述檢測腫瘤的試劑盒為以血清為檢測樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
[0016]所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和賁門癌的一種或幾種。
[0017]本發(fā)明利用N-乙酰氨基葡萄糖的特異結(jié)合體包括提純的新的高靈敏血清腫瘤標(biāo)志物抗原即 2-deoxy-N-acetyl-D-glucosamine-mucinl (簡稱 Mu-GlcNAc,也稱為 MA153)和N-乙酰氨基葡萄糖的特異結(jié)合體:適配體(核酸，如MA153-A)和其它結(jié)合體如單克隆抗體，多克隆抗體，植物凝集素(PHA)和/或受體，相關(guān)配體，以及檢測早期腫瘤的方法。直接檢測N-乙酰氨基葡萄糖的方法包括兩個模式:I)Ma695 - Mu-GlcNAc -MA153-A夾心式，2)單結(jié)合體式，由N-乙酰氨基葡萄糖的特異結(jié)合體直接識別GlcNAc。用此方法可以檢測出97 %的肺癌，腫瘤特異度96 %。
[0018]本發(fā)明提供上述檢測腫瘤的方法，是檢測待測患者血清中的N-乙酰氨基葡萄糖的濃度，以lU/mL為正常界值的上限值，其中，U為N-乙酰氨基葡萄糖活性單位。
[0019]臨床血清學(xué)檢測表明，本發(fā)明的技術(shù)方案對很多腫瘤的檢出率都在90%以上，腫瘤特異性在95%以上。這必將大大提高腫瘤的早期診斷率。本發(fā)明適于在正常人群中做腫瘤早期普查。
[0020]本發(fā)明開辟了一種新模式，命名為單結(jié)合體模式(Single binder assay),由N-乙酰氨基葡萄糖的特異結(jié)合體直接識別N-乙酰氨基葡萄糖。它節(jié)省抗體，可降低成本80%，提高靈敏度而不降低特異度。在本發(fā)明中，單結(jié)合體模式比夾心模式將肺癌的檢出率提高了 22%:前者靈敏度97%，特異度96% ;后者靈敏度75%，特異度95%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1A表示N-乙酰氨基葡萄糖的結(jié)構(gòu)圖；
[0022]圖1B表示N-乙酰氨基葡萄糖與粘蛋白I的關(guān)系；N-乙酰氨基葡萄糖與適配體MA153-A的關(guān)系；粘蛋白I與單抗Ma695的關(guān)系；Mu_GlcNAc模擬結(jié)構(gòu)；
[0023]圖2表示Mu-GIcNAc夾心測定分析的原理；
[0024]圖3表示Mu-GIcNAc夾心式測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]圖4A表示N-乙酰氨基葡萄糖單結(jié)合體測定原理
[0026]圖4B與圖4A相似，不同的是待測血清中與N-乙酰氨基葡萄糖鏈接的蛋白部分中沒有-PDTR-肽段。表明在MA153中可能存在mucinl以外其它攜帶-GlcNAc的糖蛋白。
[0027]圖5為N-乙酰氨基葡萄糖單結(jié)合體測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實施方式】
[0028]下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0029]基于本發(fā)明，提供N-乙酰氨基葡萄糖在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用；其中，所述檢測腫瘤的試劑盒為以血清為檢測樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
[0030]所述應(yīng)用中，所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和噴門癌的一種或幾種。
[0031]N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)腫瘤抗原的特性:
[0032]N-乙酰氨基葡萄糖分子式=C8H15NO6，分子量:221.21，化學(xué)代號-GlcNAc，其結(jié)構(gòu)如圖1A所示，它可以用于篩選、制備可以檢測腫瘤的特異性結(jié)合體，如抗體、核酸適配體、凝集素等，這些特異性結(jié)合體可以與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合。N-乙酰氨基葡萄糖可以作為半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到抗原，用于制備檢測其的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0033]上述載體蛋白可以為常用的載體蛋白，如卵白蛋白(0VA)、牛血清白蛋白(BSA)與多管式載體血藍(lán)蛋白(KLH)，也可以為糖蛋白，如粘蛋白及其他的蛋白中的一種或幾種。
[0034]例如，在本發(fā)明的實施例中， 申請人:在血清中分離出了 N-乙酰氨基葡萄糖鏈接粘蛋白I (Mucinl,代號Mu)形成的本專利所提純的腫瘤抗原Mu-GIcNAc (代號MA153)，它鏈接的位置在粘蛋白I內(nèi)糖鏈的暴露端，見圖1B，粘蛋白I(Mu)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列為(-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-) x N,即粘蛋白I (Mu-)的氨基酸序列為:-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-(序列2)的多次重復(fù)排列。本發(fā)明N-乙酰氨基葡萄糖鏈接粘蛋白I得到的腫瘤抗原，可以從腫瘤細(xì)胞或者腫瘤患者血清中分離純化得到，其主要特點如下:
[0035]A、Mu-GIcNAc的模擬結(jié)構(gòu)及與相關(guān)結(jié)合體的關(guān)系:Mu_GlcNAc通過決定簇-PDTR-掛到單抗Ma695親和層析柱上，從而得到純化的腫瘤抗原Mu-GlcNAc (見圖1B)；
[0036]B、Mu-GlcNAc 分子量約 140kd ；
[0037]C、由腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生；
[0038]D、在粘蛋白I上有-PDTR-肽段抗原決定簇；此決定簇可被Ma695單抗識別(見圖1B)；
[0039]GlcNAc抗原可被N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體所識別；
[0040]F、存在于乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌、賁門癌患者的血清中；
[0041]G、不存在于正常人的血清中；
[0042]H、不存在于良性疾病患者血清中；
[0043]1、用0.05M pH9.2磷酸緩沖液可以將此抗原包被于聚苯乙烯材料表面成為固相化抗原；
[0044]J、此抗原可與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體反應(yīng)，而形成血清腫瘤標(biāo)志物測定;
[0045]K>Mu-GIcNAc抗原可與Ma695單抗，以及N-乙酰氨基葡萄糖的特異性結(jié)合體形成夾心模式測定；
[0046]N、此抗原可與N-乙酰氨基葡萄糖的特異性結(jié)合體反應(yīng)，形成單結(jié)合體測定(Single binder assay)；
[0047]N-乙酰氨基葡萄糖還可以鏈接其他糖蛋白形成腫瘤抗原，即-GlcNAc也可以和其它糖蛋白鏈接形成Glycoprotein-N-acetyl-glucosamine (糖蛋白-N-乙酰-氨基葡萄糖)結(jié)構(gòu)，可又名Gp-GlcNAc ;其特征是:
[0048]A、通過單結(jié)合體測定的靈敏度高于夾心模式測定的事實說明在腫瘤抗原中與N-乙酰氨基葡萄糖鏈接的可能還含有Mucinl以外的少部分糖蛋白；
[0049]B、A所述的此糖蛋白帶有-GlcNAc，而不帶有-PDTR-肽段；
[0050]C、此糖蛋白可與結(jié)合體A、B、C、D中的任何一個反應(yīng)，而不與Ma695單抗反應(yīng)；
[0051]通過本發(fā)明的實驗表明，N-乙酰氨基葡萄糖(-GlcNAc)的特異性結(jié)合體對比-PDTR-的特異性結(jié)合體而言，前者的腫瘤識別率更高；因此，N-乙酰氨基葡萄糖(-GlcNAc)可以被稱為一個新的血清腫瘤標(biāo)志物，用于篩選檢測腫瘤的物質(zhì)(適配體、抗體、凝集素)。
[0052]本發(fā)明提供檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。
[0053]其中，所述檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)是能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì)(N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體)。
[0054]所述檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)是能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體、適配體或凝集素。
[0055]所述能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體是以N-乙酰氨基葡萄糖為抗原的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0056]所述檢測腫瘤的試劑盒為以血清為檢測樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
[0057]所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和賁門癌的一種或幾種。
[0058]上述檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)分列如下:
[0059]A適配體，MA153-A，核苷酸序列為Pl (18) -N60-P2 (18)通式，本實驗所用MA153-A屬克隆 Al 其序列:5 ‘-b1tin-CGTAC GGTCG ACGCT AGC-3’-gggtt cagtg gtcga cgactttgtt tgtgt cctca catgc attac taacg gtcat ccctg-5’-GGATC CGAGC TCCAC GTG_3’，Kd20nM，起始靶的(“抗原”):N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，所用技術(shù):SELEX。
[0060]B 單克隆抗體，MA153-B:Mab Elll, IgGl7Ka 1010L/M,抗原決定簇 GlcNAc，鼠抗，雜交瘤技術(shù)。
[0061]C 多克隆抗體，MA153-C ;Pab ant1-GlcNAc，Ka 1010L/M，所對應(yīng)的半抗原 GlcNAc，兔抗，皮下多點注射免疫技術(shù)。
[0062]D新植物凝集素/或受體，MA153-D:生物素-植物凝集素TriticumVulgaris,ATV, Sigma USA, Catalogue No 9604。
[0063]N-乙酰氨基葡萄糖檢測方法有下列特點:
[0064]N-乙酰氨基葡萄糖測定有兩種模式，夾心模式和單結(jié)合體模式；
[0065]A、在夾心模式中，Ma695是撲捉體，MA153是中心抗原，N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合(上述檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)中A.B.C.D之一，下同)是報告體；任何“GlcNAc-結(jié)合體”聯(lián)接式分析,用以檢測腫瘤；如Ma695-Mu-GlcNAc -適配體夾心式分析，做腫瘤檢測。
[0066]B、單結(jié)合體式分析又名為“單結(jié)合體非競爭性分析”或“直接識別式分析”以區(qū)別于現(xiàn)行的競爭性分析；單結(jié)合體式分析是只用N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體做識別體；單結(jié)合體分析是用N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體直接識別檢測對象中的的N-乙酰氨基葡萄糖；.單結(jié)合體分析的本質(zhì)是結(jié)合體與-GlcNAc形成的特異性結(jié)合。如-GlcNAc -MA153-A聯(lián)接做成單結(jié)合體測定，做腫瘤檢測；-GlcNAc-MA153-B(Mab Elll)聯(lián)接做成單結(jié)合體測定，做腫瘤檢測；_GlcNAc -MA153-C(Pab)聯(lián)接做成單結(jié)合體測定，做腫瘤檢測；_GlcNAc - MA153-D (b1tin-ATV新植物凝集素Triticum Vulgaris)聯(lián)接做成單結(jié)合體測定，做腫瘤檢測。
[0067]本發(fā)明以-GlcNAc用作初始抗原、靶標(biāo)、配體，來制備、尋找、培育、篩選特異結(jié)合體，如:適配體、單克隆抗體、多克隆抗體、植物凝集素、凝集素、受體，以建立腫瘤標(biāo)志物檢測分析。以-GlcNAc為目的分析物，做腫瘤標(biāo)志物測定；
[0068]由于在腫瘤患者的血清中，N-乙酰氨基葡萄糖經(jīng)常與糖蛋白鏈接，因此，在檢測腫瘤的物質(zhì)中，可以使用N-乙酰氨基葡萄糖與糖蛋白鏈接產(chǎn)物作為抗原，如高度純化的MA153 (Mu-GIcNAc)抗原作為起始抗原、靶標(biāo)、配體、來制備、尋找、篩選、培育特異結(jié)合體如:適配體、單克隆抗體、多克隆抗體、植物凝集素、凝集素、受體，以便建立腫瘤檢測方法；以MA153 (Mu-GIcNAc)為目的分析物，做腫瘤標(biāo)志物測定；
[0069]抗原結(jié)構(gòu)(Mu-GlcNAc)為指導(dǎo)，或以這些路線為線索，來獲得結(jié)合體，做成腫瘤標(biāo)志物檢測；
[0070]又如，糖蛋白-N-乙酰-氨基葡萄糖Gp-GlcNAc用作初始抗原、靶標(biāo)、配體，來制備、尋找、培育、篩選特異結(jié)合體，如:適配體、單克隆抗體、多克隆抗體、植物凝集素、凝集素、受體，以建立腫瘤標(biāo)志物檢測分析；以-Gp-GlcNAc為目的分析物，做腫瘤標(biāo)志物測定；
[0071]基于上述方法，本發(fā)明利用N-乙酰氨基葡萄糖作為腫瘤檢測的標(biāo)志物進(jìn)行腫瘤檢測物質(zhì)的篩選應(yīng)用有下述幾種方式:
[0072]a、l)Mu_GlcNAc、或者Gp-GlcNAc作為整體純靶標(biāo)制備適配體；2)小分子的GlcNAc可以單獨做靶標(biāo)直接篩選、制備適配體，用于腫瘤檢測；
[0073]b、l)Mu_GlcNAc、或者Gp-GlcNAc作為整體純抗原制備單克隆抗體；2)小分子GlcNAc作為半抗原(hapten)聯(lián)接載體蛋白成為有效抗原，制備單克隆抗體，用于腫瘤檢測；
[0074]c、l)Mu_GlcNAc、或者Gp-GlcNAc作為整體純抗原制備多克隆抗體；2)小分子GlcNAc作為半抗原(hapten)聯(lián)接載體蛋白成為有效抗原，制備多抗，用于腫瘤檢測。
[0075]實施例
[0076]實施例1、N-乙酰氨基葡萄糖用于腫瘤檢測的發(fā)現(xiàn)和鑒定
[0077]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者的血液中有一種N-乙酰氨基葡萄糖的含量與健康人的血液中的含量相比具有顯著的差異。
[0078]本發(fā)明用腫瘤患者的血液在體外直接做SELD1、MELDI質(zhì)譜分析，得到腫瘤患者特別的糖結(jié)構(gòu)圖譜，找到腫瘤的特異譜線，從而從兩種類型質(zhì)譜儀的檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)腫瘤特異糖結(jié)構(gòu)、糖蛋白，目前我們發(fā)現(xiàn)的就是GlcNAc (N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖)特殊糖基，進(jìn)而以聚丙酰胺電泳、高壓液相層析、凝集素親和層析分離純化得到的目標(biāo)糖蛋白。
[0079]我們試用親和層析的方法(Mu-GlcNAc通過決定簇-PDTR-掛到單抗Ma695親和層析柱上，從而得到純化的腫瘤抗原Mu-GlcNAc)從MCF-7腫瘤細(xì)胞株Mucinl (粘蛋白I, 一個糖蛋白)。我們用凝集素芯片技術(shù)證實，上述新提取的Mucinl恰巧攜帶有密集的-GlcNAc，我們判斷這正是我們尋找的新標(biāo)志物，并在本發(fā)明的實驗中得到了證實。
[0080]將上述提取的這種糖蛋白命名為MA153，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中N-乙酰氨基葡萄糖鏈接粘蛋白I (Mucinl,代號Mu)它鏈接的位直在粘蛋白I內(nèi)糖鏈的暴露端，見圖1B,粘蛋白I(Mu)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列為(-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-)xN，即粘蛋白I (Mu-)的氨基酸序列為:-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-的多次重復(fù)排列。并且發(fā)現(xiàn)它可以與單克隆抗體Ma695和相關(guān)Aptamer (適配體)形成Ma695 - Mu-GlcNAc - Aptamer的夾心反應(yīng)。因此,可以通過對N-乙酰氨基葡萄糖的檢測，來鑒定腫瘤。新腫瘤標(biāo)志物-GlcNAc (N-乙酰氨基葡萄糖)結(jié)構(gòu)(見圖1A)及其與所在糖蛋白的關(guān)系，和與相關(guān)結(jié)合體的關(guān)系(見圖1B)。其中，其連接的粘蛋白I (Mu-)的氨基酸序列為:-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-的多次重復(fù)排列。
[0081]新標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)后建立N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體是第二個關(guān)鍵步驟。明確的結(jié)構(gòu)，純化的抗原為制備特異結(jié)合體，提供了極為便利的條件。SELEX新技術(shù)制備適配體(aptamer)是我們的首選，它既可用于腫瘤診斷也可用于腫瘤治療，它的分子較小，在腫瘤靶向治療方面具有比抗體更多的優(yōu)越性。其后是單克隆抗體、多克隆抗體、植物凝集素(PHA)和/或受體及其他配體。最后我們得到了 4種針對-GlcNAc抗原/決定簇的最適結(jié)合體:適配體MA153-A、單克隆抗體MA153-B (Elll)、多克隆抗體MA153-C、新植物凝集素MA153-D(b1tin-ATV, b1tin-phyto-Agglutinin from Triticum Vulgaris):具體如下A-D所述:
[0082]A適配體,在B1search 8600DNA合成儀上合成含有百萬億以上個不同結(jié)構(gòu)的單鏈DNA片段構(gòu)成的核酸文庫。PCR擴(kuò)增，成為DNA雙鏈。解離雙鏈，標(biāo)記其一，用做同位素實驗。分離互補(bǔ)鏈進(jìn)入篩選。起始靶的(“抗原”):N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，所用技術(shù):SELEX0用固相Mu-GIcNAc撲捉候補(bǔ)Aptamer,形成Mu_GlcNAc_DNA單鏈復(fù)合物。從復(fù)合物中解離DNA單鏈。再次進(jìn)入PCR擴(kuò)增(步驟2)。如此往復(fù)循環(huán)11周，得到想要的Aptamer。共獲得Al -A3030個克隆，核苷酸序列為Pl(18)-N60-P2(18)通式；本實驗所用MA153-A屬克隆Al為篩選獲得的特異性效果最好的克隆，其序列:5‘-CGTAC GGTCG ACGCT AGC_3’_gggttcagtg gtcga cgact ttgtt tgtgt cctca catgc attac taacg gtcat ccctg-5’ -GGATCCGAGC TCCAC GTG-3，(序列 I 所示)，Kd 20nM。
[0083]生物素標(biāo)記適配體
[0084]將適配體(序列I所示)Img在0.1M PH8.8硼酸緩沖液中透析12小時以上，取出后放置在干凈的玻璃瓶中，配制NH-B1tin lmg/mL,取50微升快速加入到適配體溶液中，室溫(25攝氏度)震蕩2小時，在含0.05M PH 7.5PBS中透析兩天，取出備用。
[0085]B 單克隆抗體，MA153-B:Mab Elll, IgGl7Ka 1010L/M,抗原決定簇 GlcNAc，鼠抗，雜交瘤技術(shù)。
[0086]C 多克隆抗體，MA153-C ；Pab ant1-GlcNAc，Ka 1010L/M,所對應(yīng)的半抗原 GlcNAc，兔抗，皮下多點注射免疫技術(shù)。
[0087]D新植物凝集素/或受體，MA153-D:生物素-植物凝集素TriticumVulgarisjATV, Sigma USA, Catalogue No 9604。
[0088]實施例2、利用N-乙酰氨基葡萄糖篩選特異性結(jié)合體檢測腫瘤的方法(夾心法)
[0089]夾心模式測定Mu-GIcNAc抗原,其原理如圖2所示。
[0090](一 )材料和方法
[0091]I試劑和腫瘤患者血清標(biāo)本
[0092]1.1 試劑Ma695 單克隆抗體(Mab), CanAg Diagnostics AB,瑞典，生物素(b1tin)聯(lián)結(jié)的Aptamer (如實施例1制備的序列I所示的適配體，生物素標(biāo)記)，Mu-GIcNAc抗原，自行親和層析提取(見實施例1);也可購自北京永瀚星港生物科技有限公司。
[0093]1.2癌癥患者血清標(biāo)本腫瘤患者血請來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院和解放軍301醫(yī)院，患者診斷均經(jīng)病理證實。
[0094]2 方法
[0095]2.1固相抗體制備將2mg Ma695單抗溶解在200mL pH9.2的磷酸緩沖液中，分裝于聚苯乙烯小試管內(nèi)，每管0.2mL，4°C放置過夜，棄去磷酸緩沖液，加入0.2mL 6 %的牛血清白蛋白溶液進(jìn)行飽和包被，4°C放置5小時，棄牛血清白蛋白溶液，放置4°C備用。
[0096]2.21251標(biāo)記鏈酶親和素(Streptavidin)的制備取1dogen涂管一支(陳智周，范振符.腫瘤相關(guān)抗原CA-50的免疫放射分析.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，1988,4(1):60-64.)，加入0.05mol/L pH7.5含有100 μ g streptavidin的磷酸緩沖液100 μ L,, 一邊攪拌一邊加Λ 1yL 125I (3.7xl07Bq)，室溫下反應(yīng)5min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至S印hdex G25柱，收集第一個放射性峰，置4°C備用。
[0097]2.3反應(yīng)溶液和洗滌液的配制于？!17.5，0.0511101/1 PBS緩沖液中加入0.05 %CaCl2、0.05% MgCl2,6% BSA，成為反應(yīng)溶液;于反應(yīng)液中加入0.01 %的吐溫20即為洗滌液。
[0098]2.4標(biāo)準(zhǔn)液配制將Mu-GIcNAc原液用反應(yīng)溶液稀釋成O、1、3、10、30、100、300U/mL
不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)。U為N-乙酰氨基葡萄糖活性單位。
[0099]2.5Mu-GlcNAc測定步驟向包被好單抗Ma695的聚苯乙烯小試管內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)液、被測血清樣品各0.1mL,然后加入b1tin-Aptamer (生物素(b1tin)聯(lián)結(jié)的Aptamer) 0.1mL (約0.01 μ g)，4°C反應(yīng)過夜(不少于12小時)，棄反應(yīng)液，用洗滌液洗3次，加入1251-streptavidin 0.1mL (約15萬cpm),室溫反應(yīng)2h,棄反應(yīng)液,用洗漆液洗3次，測定放射性計數(shù)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品中Mu-GlcNAc含量，以U/mL表示。
[0100]2.6臨床測定結(jié)果判定取100例正常人血清，Mu-GIcNAc抗原測定結(jié)果i士2s =lU/mL (該公式中s是指標(biāo)準(zhǔn)差)，設(shè)定為正常值上限。
[0101](二)結(jié)果
[0102]I標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0103]Mu-GIcNAc測定標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表I和圖3。
[0104]表I不同濃度Mu-GlcNAc抗原的放射性計數(shù)
[0105]
標(biāo)準(zhǔn)濃度
O I 3 10 30 100 300
(IJZmL)
放射性計數(shù)

1300 5011 10321 21394 41129 61208 73053
(cpm)
[0106]2臨床測定
[0107]正常人和不同腫瘤患者血清Mu-GlcNAc臨床測定結(jié)果見表2。
[0108]表2.Mu-GIcNAc測定對不同腫瘤患者、正常人的檢測靈敏度和特異性
[0109]
分類例數(shù)檢測靈敏度腫瘤特異度正常人1005%95%
乳腺癌5082%95%
宮頸癌3074%95%
子宮癌2065%95%
[0110]
卵巢癌5472%95%
食道癌3078%95%
胰腺癌3069%95%
肝癌3867%95%
肺癌6075%95%
結(jié)腸癌3063 3/95%
膽管癌2060%95%
[0111](三)討論
[0112]從臨床檢測結(jié)果可以看出，Mu-GlcNAc抗原在10種以上受試腫瘤患者血清中呈現(xiàn)陽性,腫瘤特異性高達(dá)95 %，是個良好的新腫瘤標(biāo)志物。從其對腫瘤的廣譜性來看,它可能與腫瘤共有的惡性本質(zhì)密切相關(guān)，而不是僅對個別腫瘤。對它進(jìn)一步研究意義重大。
[0113]已知單克隆抗體Ma695識別的是Mucinl (粘蛋白I)蛋白上的-PDTR-肽段，而上述所用的適配體識別的表位，經(jīng)凝集素芯片(Tateno H, Uchiyama N, Kuno A, et al.A novelstrategy for mammalian cell surface glycome profiling using lectin microarray.Glycob1logy 2007, 17(10): 1138-1146.)核定為 GlcNAc (N-acetyl-Glucosamine, N-乙酸氨基葡萄糖)，因此，反應(yīng)中的夾心抗原基本結(jié)構(gòu)是本發(fā)明提供的Mu-GlcNAc。
[0114]蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵因素，癌變過程伴有糖基化異常(范振符，陳智周，范飛舟.糖基化改變與腫瘤的基礎(chǔ)研究.標(biāo)記免疫分析與臨床，2010，17(2):122-126.),所形成的異常糖基構(gòu)成了腫瘤單抗的免疫決定簇。迄今，糖類抗原(carbohydrate antigen,簡稱為CA)已在臨床腫瘤檢測中占有突出重要地位,糖生物學(xué)的研究是新腫瘤標(biāo)志物開發(fā)的重要源泉，本研究預(yù)期在不遠(yuǎn)的將來還可能產(chǎn)生新的抗癌疫苗。
[0115]實施例3、單結(jié)合體測定方法檢測腫瘤
[0116]單結(jié)合體測定方法原理如圖4A和圖4B，利用N-乙酰氨基葡萄糖的特異性結(jié)合體適配體(序列I所示)。單結(jié)合體式分析是只用N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體做識別體；單結(jié)合體分析是用N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體直接識別檢測對象中的的N-乙酰氨基葡萄糖；.單結(jié)合體分析的本質(zhì)是結(jié)合體與-GlcNAc形成的特異性結(jié)合。
[0117]具體方法如下所示:
[0118](一)材料和方法:
[0119]I試劑和腫瘤患者血清標(biāo)本
[0120]1.1試劑:適配體b1tin-MA153-A，北京永瀚星港生物科技股份有限公司；MA153抗原，北京永瀚星港生物科技股份有限公司；Streptavidin, Sigma USA。
[0121]1.2癌癥患者血清標(biāo)本腫瘤患者血清來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院和解放軍301醫(yī)院，患者診斷均經(jīng)病理證實。
[0122]2 方法
[0123]2.1125I標(biāo)記鏈酶親和素(Streptavidin)的制備:取1dogen涂管一支，力口A 0.05M ρΗ7.5含有10ug streptavidin的磷酸緩沖液10uL,,—邊攪拌一邊加入1uL125I (3.7xl07Bq)，室溫下反應(yīng)5分鐘，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至S印hdex G25柱，收集第一個放射性峰，置4°C備用。
[0124]2.2反應(yīng)溶液和洗滌液的配制:于pH7.5,0.05Μ PBS緩沖液中，加入0.05%CaC12,0.05%MgC12,6% BSA，成為反應(yīng)溶液；于反應(yīng)液中加入0.01 %的吐溫20即為洗滌液。
[0125]2.3標(biāo)準(zhǔn)配制:將Mu-GIcNAc原液用反應(yīng)溶液稀釋成0，1,3,10，30，100,300u/mL, U為N-乙酰氨基葡萄糖活性單位。標(biāo)準(zhǔn)和血清樣品的稀釋:測定前用0.05M pH9.2的磷酸緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)和血清樣品做10倍稀釋。
[0126]2.4-GlcNAc抗原測定步驟:向聚苯乙烯小試管內(nèi)依次加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)、被測血清樣品各0.lmL，4°C過夜，形成固相抗原，棄去反應(yīng)液。加入0.1mL 6% BSA，室溫反應(yīng)此，以飽和包被,棄反應(yīng)液。加入b1tin-Aptamer (生物素(b1tin)聯(lián)結(jié)的Aptamer) 0.1mL,約0.0lug,室溫反應(yīng)3h,棄反應(yīng)液,用洗漆液洗3次,加入125-1-streptavidin 0.1mL,約15萬cpm，室溫反應(yīng)2h，棄反應(yīng)液，用洗滌液洗3次，測定放射性，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品中-GlcNAc含量,表示為u/mL。
[0127]2.5臨床測定結(jié)果判定:取100例正常人血清GlcNAc抗原測定結(jié)果X+2SD = Iu/mL，設(shè)定為正常值上限。
[0128](二)結(jié)果
[0129]I標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0130]Mu-GIcNAc測定標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表3和圖5。
[0131]表3不同濃度Mu-GlcNAc抗原的放射性計數(shù)
[0132]

【權(quán)利要求】
1.N-乙酰氨基葡萄糖在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述檢測腫瘤的試劑盒為以血清為檢測樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和賁門癌的一種或幾種。
4.檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)在制備檢測腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)是能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述檢測N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)是能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體、適配體或凝集素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的單克隆抗體和多克隆抗體的抗原為以N-乙酰氨基葡萄糖作為半抗原偶聯(lián)載體蛋白制備的抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述檢測腫瘤的試劑盒為以血清為檢測樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和賁門癌一種或幾種。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述適配體為序列表中序列I所示的核酸。
【文檔編號】G01N33/574GK104198707SQ201410465689
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】范振符 申請人:范飛舟, 張昊巖