一種檢測(cè)血紅蛋白結(jié)合alpha-突觸核蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)與血液中紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白結(jié)合的總突觸核蛋白含量的方法，所述方法包括利用抗人血紅蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體，利用抗人突觸核蛋白單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，利用抗原-抗體反應(yīng)原理檢測(cè)帕金森病人和正常健康人與血紅蛋白結(jié)合的突觸核蛋白的含量并進(jìn)行比較。
【專利說明】-種檢測(cè)血紅蛋白結(jié)合alpha-突觸核蛋白的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)與血液紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白結(jié)合的α-突觸核蛋白含量的方 法，該方法可用于帕金森病的診斷。

【背景技術(shù)】：
[0002] 帕金森病是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為靜止振顫、運(yùn) 動(dòng)遲緩、肌肉僵直和姿勢(shì)不穩(wěn)定等運(yùn)動(dòng)癥狀。引起這些癥狀的原因是中腦黑質(zhì)多巴胺 神經(jīng)元大量死亡和由此引起的紋狀體部位的多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的大幅度減少。帕金森病 的主要病理特征是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體--路易體（Lewy body)和路易神經(jīng) 索（Lewy neurite)構(gòu)成路易體和路易神經(jīng)索的主要成分是纖維化的α-突觸核蛋白 (α-synuclein)。大量研究表明，α-突觸核蛋白是在帕金森病的發(fā)病中起關(guān)鍵作用的蛋 白質(zhì)。a-突觸核蛋白基因點(diǎn)突變和多倍體變異可以引起家族性早發(fā)性帕金森病，其基因 啟動(dòng)子多態(tài)性與帕金森病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。已經(jīng)證明，帕金森病人腦組織中的α-突觸核 蛋白存在改變，表現(xiàn)為該蛋白的表達(dá)量異常增高，磷酸化、硝基化、泛素化和糖基化的修飾 體增加。異常表達(dá)和修飾的α-突觸核蛋白引起該蛋白異常聚集成寡聚體，并進(jìn)而形成纖 維而沉積在路易體中。大量證據(jù)表明，異常表達(dá)、修飾的α-突觸核蛋白促進(jìn)其聚集成對(duì) 神經(jīng)元具有毒性作用的蛋白寡聚體，是各種原因?qū)е律窠?jīng)元退變和帕金森病的關(guān)鍵。鑒于 a -突觸核蛋白在帕金森病發(fā)病和病理生理過程中的關(guān)鍵作用，檢測(cè)該蛋白在體液中的變 化被認(rèn)為對(duì)帕金森病具有診斷意義。目前對(duì)腦脊液的檢測(cè)表明，帕金森病人腦脊液中的總 的α-突觸核蛋白含量降低和寡聚化α-突觸核蛋白含量增高，具有較高的診斷特異性和 敏感性。目前對(duì)帕金森病人血液中的突觸核蛋白的檢測(cè)主要限于血清和血漿。然而， 受限于檢測(cè)技術(shù)的敏感性和穩(wěn)定性以及其它干擾因素的影響，血清和血漿中的a -突觸核 蛋白的檢測(cè)結(jié)果及其在帕金森病的診斷意義尚不能定論。不同研究者報(bào)道的正常值相差數(shù) 百甚至上千倍。帕金森病人血漿和血清中的α-突觸核蛋白含量有報(bào)道高于正常對(duì)照、低 于正常對(duì)照和沒有明顯變化等不同結(jié)果。
[0003] 研究表明，血液中的α-突觸核蛋白99%存在于紅細(xì)胞中。由于紅細(xì)胞是無核細(xì) 胞，不能表達(dá)a -突觸核蛋白，其胞漿的主要成分是血紅蛋白，由此推測(cè)，紅細(xì)胞中的a -突 觸核蛋白含量較高的原因很可能與血紅蛋白有關(guān)?；谏鲜鐾茰y(cè)，我們證明了血紅蛋白可 以與α-突觸核蛋白結(jié)合成復(fù)合體。由于α-突觸核蛋白可以以被動(dòng)擴(kuò)散的方式通過細(xì)胞 膜，因此，血紅蛋白可以將胞漿中的α-突觸核蛋白富集到紅細(xì)胞中，導(dǎo)致紅細(xì)胞中α-突 觸核蛋白含量明顯高于血液中的其它組分。因此，檢測(cè)紅細(xì)胞中血紅蛋白結(jié)合突觸核 蛋白含量將有可能反應(yīng)不同生理病理情況下該蛋白的變化情況。
[0004] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)與血紅蛋白結(jié)合的α-突觸核蛋白的方法，該方 法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可以顯著區(qū)分帕金森病人和正常健康人的血紅蛋白結(jié)合 a -突觸核蛋白含量，是篩選帕金森病高危人群和臨床診斷帕金森病的重要手段。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)與血紅蛋白結(jié)合的總α -突觸核蛋白含量的方法， 利用該方法所獲得的結(jié)果，有助于對(duì)帕金森病以及其它突觸核蛋白病進(jìn)行診斷和判定治療 效果。
[0006] 本發(fā)明所述方法，利用抗人血紅蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體，利用抗人α-突 觸核蛋白單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，利用抗原-抗體反應(yīng)原理檢測(cè)帕金森病人、其它突觸 核蛋白病人和正常健康人與血紅蛋白結(jié)合的總α-突觸核蛋白的含量并進(jìn)行比較。
[0007] 為此，本發(fā)明提供一種檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)與血紅蛋白結(jié)合總α-突觸核蛋白含量的方 法，所述方法，包括以下步驟：
[0008] (1)分離紅細(xì)胞中的胞漿蛋白；
[0009] (2)用抗人血紅蛋白單克隆抗體捕獲胞漿蛋白中的血紅蛋白；
[0010] (3)用生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體檢測(cè)與血紅蛋白結(jié)合的α -突 觸核蛋白；
[0011] (4)加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶和顯色劑，進(jìn)行顯色；
[0012] (5)用分光光度法對(duì)顯色的樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中與血紅 蛋白結(jié)合的總α-突觸核蛋白的含量。
[0013] 以下對(duì)本發(fā)明所用名稱術(shù)語(yǔ)進(jìn)行解釋：
[0014] (1)抗人血紅蛋白單克隆抗體：識(shí)別血紅蛋白Α亞基，抗原為純化人血紅蛋白Α亞 基，與靈長(zhǎng)類動(dòng)物，大鼠，小鼠發(fā)生反應(yīng)。
[0015] (2)血紅蛋白結(jié)合總α-突觸核蛋白：與血紅蛋白發(fā)生相互作用的所有的α-突 觸核蛋。
[0016] (3)血紅蛋白-α-突觸核蛋白復(fù)合體：在紅細(xì)胞胞漿中，血紅蛋白與α-突觸核 蛋白發(fā)生相互作用形成的復(fù)合物，稱為血紅蛋白-α-突觸核蛋白復(fù)合體。
[0017] (4)抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體：為任何特異性識(shí)別人α -突觸核蛋白的單 克隆抗體。
[0018] (5)鏈霉親和素標(biāo)記堿性磷酸酶：在ELISA測(cè)定中，鏈霉親和素標(biāo)記堿性磷酸酶復(fù) 合物中的鏈霉親和素可以與生物素化的α -突觸核蛋白的單克隆抗體結(jié)合，而復(fù)合物中的 堿性磷酸酶可以催化色原底物對(duì)硝基苯磷酸鹽（ΡΝΡΡ)生成黃色的對(duì)硝基酚（ρΝΡ)，其在入 =405nm處有最大光吸收。
[0019] (6)顯色劑：為對(duì)硝基苯磷酸鹽二鈉鹽，或4硝基苯磷酸鹽，英文名稱 p-nitrophenyl phosphate disodium 或 4_nitrophenyl phosphate disodium,縮寫為 pNPP。用于ELISA的化學(xué)顯色底物，可在堿性磷酸酶的催化下形成對(duì)硝基酚（pNP)，后者是 黃色水溶產(chǎn)物，該產(chǎn)物在405nm處有最大光吸收。
[0020] (7) ELISA 酶標(biāo)板：在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)中，作為載體的固相聚苯乙烯（Polystyrene)表面對(duì)抗原、抗體或抗原抗體復(fù)合物 的吸附起重要作用?？乖?、抗體和其它生物分子通過多種機(jī)制吸附至載體表面，這包括通過 疏水鍵、流水/離子鍵的被動(dòng)吸附，通過引入其它活性基團(tuán)如氨基和碳基的共價(jià)結(jié)合，以及 通過表面改性后的親水鍵結(jié)合。
[0021] (8)PBS :憐酸緩沖液（phosphate buffered saline)，濃度為 0· 01mol/L。NaHC03 緩沖液：碳酸氫鈉緩沖液，濃度為200mmol/L，pH 9. 6。
[0022] (9)封閉液：明膠含量為2. 5 %的PBST溶液，作用為封閉非特異結(jié)合，降低ELISA 背景。
[0023] (10)PBST :在0· 01mol/L PBS中含有0· 05% Tween-20即為磷酸鹽吐溫緩沖液， PBST。
[0024] (11)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法如下：每次試驗(yàn)時(shí)將血紅蛋白_α -突觸核蛋白復(fù)合物 標(biāo)準(zhǔn)蛋白根據(jù)其中的α-突觸核蛋白的摩爾濃度進(jìn)行系列稀釋，與樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，讀 取相對(duì)應(yīng)405nm處吸光值，做出其與α -突觸核蛋白濃度之間的關(guān)系曲線。
[0025] 優(yōu)選的本發(fā)明的檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白結(jié)合總α-突觸核蛋白含量的方法，步驟 如下：
[0026] 步驟 1，
[0027] 取靜脈血，必要時(shí)可以加入EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝，分離紅細(xì)胞，經(jīng)過離心即得 紅細(xì)胞胞漿蛋白；
[0028] 步驟 2，
[0029] 抗人血紅蛋白單克隆抗體包被ELISA酶標(biāo)板，并加入封閉液進(jìn)行封閉，隨后加入 上步得到的紅細(xì)胞胞漿蛋白，或血紅蛋白-α -突觸核蛋白復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)蛋白；步驟3，
[0030] 向上步ELISA酶標(biāo)板中加入生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體，親和素 標(biāo)記的堿性磷酸酶，對(duì)硝基苯磷酸顯色液；
[0031] 步驟 4，
[0032] 在405nm處測(cè)定酶標(biāo)板各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白結(jié) 合α-突觸核蛋白含量。
[0033] 特別優(yōu)選的本發(fā)明的檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白結(jié)合總α -突觸核蛋白含量的方法， 步驟如下：
[0034] 步驟 1，
[0035] 取5-10ml抗凝血，混勻，貼壁加入至離心管中，記錄全血的體積，1:1加入PBS，充 分混勻。
[0036] 將稀釋后的全血緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液上，離心，分離紅細(xì)胞層。將紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移 到新的離心管中，加PBS，離心，_80°C保存。
[0037] 凍存紅細(xì)胞在室溫融化后放入離心機(jī)，離心，上層即為紅細(xì)胞胞漿蛋白。
[0038] 步驟 2，
[0039] 包被：用NaHC03緩沖液稀釋抗人血紅蛋白抗體至終濃度為0. 1-4 μ g/mL。向酶標(biāo) 板各孔加入該抗體稀釋液，孵育過夜。沖洗。
[0040] 封閉：向酶標(biāo)板各孔加入封閉液，孵育1?2小時(shí)。沖洗。加入紅細(xì)胞胞漿樣品， 或血紅蛋白- α -突觸核蛋白復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)蛋白，孵育1?2小時(shí)。沖洗。
[0041] 步驟 3，
[0042] 用封閉液稀釋生物素化的抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度為〇. 1? 2 yg/mL。向酶標(biāo)板的各孔加入該抗體稀釋液，孵育1?2小時(shí)。沖洗。
[0043] 用封閉液稀釋親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶，向酶標(biāo)板的各孔加入該酶的稀釋液，孵 育0.5?2小時(shí)。沖洗。
[0044] 向酶標(biāo)板的各孔加入對(duì)硝基酚磷酸顯色液，顯色10?50分鐘。
[0045] 步驟 4，
[0046] 在紫外分光光度計(jì)405nm處測(cè)定酶標(biāo)板各孔的吸光度值。
[0047] 根據(jù)體外制備的血紅蛋白-α-突觸核蛋白復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)蛋白中α-突觸核蛋白的 濃度與405nm處吸光值之間的關(guān)系曲線，計(jì)算樣品中與血紅蛋白結(jié)合總α -突觸核蛋白的 含量。
[0048] 本發(fā)明所述的方法，其中，抗人血紅蛋白單克隆抗體可以是任何一種特異性識(shí)別 人血紅蛋白的單克隆抗體，市場(chǎng)上可以買到。
[0049] 本發(fā)明所述的方法，其中，其中抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體可以是任何一種 特異性識(shí)別人突觸核蛋白的單克隆抗體，市場(chǎng)上可以買到，如：1Β2小鼠抗人α-突觸 核蛋白單克隆抗體。
[0050] 本發(fā)明所述的方法，其中，其中血紅蛋白_α -突觸核蛋白復(fù)合體標(biāo)準(zhǔn)蛋白的制備 方法如下：
[0051] 1，用500μ L的0. Olmol/L PBS溶解α -突觸核蛋白和血紅蛋白分別至終濃度為 2mol/L 與 lmol/L，于 37°C、230rpm、振蕩孵育 24h ;
[0052] 2,孵育樣品在lOOOOXg離心5min，吸取上清，以PBS為流動(dòng)相，HiPr印 26/60Sephacryl S_200High Resolution 層析柱凝膠過濾；
[0053] 3,分離血紅蛋白- α -突觸核蛋白復(fù)合物；
[0054] 4,用SWATH定量蛋白組方法，確定平均每個(gè)血紅蛋白結(jié)合的α -突觸核蛋白分子 數(shù)，從而計(jì)算出α-突觸核蛋白占復(fù)合物的重量百分比和摩爾百分比。
[0055] 本發(fā)明所述的方法，其中，1Β2抗人α -突觸核蛋白抗體其制備方法如下：
[0056] 步驟1，抗原的制備：本實(shí)驗(yàn)室制備并純化人全長(zhǎng)α -突觸核蛋白作為抗原。
[0057] 步驟2,免疫小鼠：使用Freund' s完全佐劑（第一次免疫）與不完全佐劑（隨后 的免疫）乳化人α -突觸核蛋白，每隔2周對(duì)BALB/c雌性小鼠進(jìn)行免疫（50 μ g抗原/只 小鼠）。抽取動(dòng)物血清，利用ELISA與Western blot方法檢測(cè)其效價(jià)與特異性。
[0058] 步驟3,篩選雜交瘤細(xì)胞株：選取血清效價(jià)高的小鼠，分離其脾細(xì)胞，在聚乙二醇 (PEG) 3000 - 3700存在的條件下與小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2融合，隨后使用HAT培養(yǎng)基篩選融合 細(xì)胞，最后用ELISA方法篩選可以產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。ELISA陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn) 一步利用免疫組化與免疫印跡來檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞是否產(chǎn)生特異性抗體。經(jīng)篩選，1B2雜交瘤 細(xì)胞可以產(chǎn)生特異性抗人α-突觸核蛋白抗體。
[0059] 步驟4,抗體制備：大量擴(kuò)增1Β2雜交瘤細(xì)胞，將其注射入BALB/c裸鼠腹膜腔內(nèi)， 產(chǎn)生腹水。然后利用protein A親和層析純化腹水中的1B2抗人α-突觸核蛋白抗體。
[0060] 本發(fā)明所述的方法，其中，其中生物素化抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體制備方 法如下：
[0061] 1)用無水DMS0配制10mg/mL生物素Ν-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。
[0062] 2)用硼酸鹽緩沖液（0· lmol/L，pH 8. 8)配制濃度至少為1?3mg/mL的抗體溶液， 若抗體儲(chǔ)存時(shí)加入了疊氮鈉，則標(biāo)記前須先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉。
[0063] 3)按25?100 μ g的比率將生物素酯加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4h。 在完成結(jié)合反應(yīng)之前，DMS0的終濃度不能低于5%，否則生物素酯會(huì)出現(xiàn)沉淀。高濃度的生 物素酯會(huì)導(dǎo)致多個(gè)生物素分子結(jié)合在抗體上，因此可能會(huì)使所有抗體都被標(biāo)記。較低的比 率則會(huì)是使生物素化保持在最低限度（25μ g生物素酯抗體的最初摩爾比為10 :1)。
[0064] 4)每250 μ g生物素酯內(nèi)加入20 μ L的lmol/L的氯化銨，室溫孵育lOmin。
[0065] 5)將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素。由于生 物素分子較大，故透析比預(yù)料中的要慢，或者用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體。按純 化抗體的儲(chǔ)存方法保存標(biāo)記抗體。本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0066] 1、在現(xiàn)有方法中，針對(duì)腦脊液總α-突觸核蛋白和寡聚化α-突觸核蛋白的檢測(cè) 雖然獲得較高的診斷特異性和敏感性（最高90. 6%和89. 3 % )，但由于腦脊液采集需要 比較專業(yè)技術(shù)，不易被一些患者所接受，因此很難用于大規(guī)模篩查。此外，腦脊液樣本的 α-突觸核蛋白測(cè)試結(jié)果有時(shí)也會(huì)受溶血等因素的影響。本發(fā)明所用方法是檢測(cè)血液樣本 中的α-突觸核蛋白，與檢測(cè)腦脊液樣本中的α-突觸核蛋白相比較,血液樣本的采集技術(shù) 簡(jiǎn)單，便于操作，容易為患者所接受，因此適合大規(guī)模篩查。
[0067] 2、迄今針對(duì)血液樣本中α-突觸核蛋白的檢測(cè)，主要針對(duì)血漿或血清中總α-突 觸核蛋白、磷酸化α-突觸核蛋白和寡聚化α-突觸核蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果不一致，其診斷 特異性和敏感性也較低。導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果不穩(wěn)定的重要原因之一是溶血引起的血漿樣本的污 染。因?yàn)榧t細(xì)胞中的α-突觸核蛋白含量占全血的99%，因此，即使是少量溶血也能夠影響 測(cè)試結(jié)果。本發(fā)明所述方法是檢測(cè)紅細(xì)胞中血紅蛋白結(jié)合α-突觸核蛋白含量，避免了溶 血對(duì)檢測(cè)的影響。
[0068] 3、本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有方法相比較，還有如下優(yōu)點(diǎn)：1)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白樣本 量大，提取與保存樣本較便捷；2)血紅蛋白結(jié)合α-突觸核蛋白含量較高，測(cè)試結(jié)果穩(wěn)定； 3)具有較高的診斷值：迄今獲得的特異性和敏感性數(shù)值分別為87. 3%和89. 0%。這是目 前基于血液樣本α-突觸核蛋白測(cè)試的診斷值最高的方法。
[0069] 以下為目前診斷方法的主要文獻(xiàn)及其結(jié)果：
[0070] 1. Park MJ, Cheon SM, Bae HR, Kim SH, Kim JW. Elevated levels of a-synuclein oligomer in the cerebrospinal fluid of drug-naive patients with Parkinson's disease.J Clin NeuiOl.2011;7(4):215-522.(腦脊液a-突觸核蛋白檢測(cè)，腦脊液寡聚 化α-突觸核蛋白增高，總α-突觸核蛋白無顯著改變，沒有診斷特異性、敏感性數(shù)據(jù)）。
[0071] 2. Tokuda T，Qureshi MM，Ardah MT，Varghese S，Shehab SA，Kasai T，Ishigami N，Tamaoka A，Nakagawa M，El-Agnaf 0M. Detection of elevated levels of a -synuclein oligomers in CSF from patients with Parkinson disease. Neurology.2010 ； 75(20):1766-1772.(腦脊液a-突觸核蛋白檢測(cè)，寡聚化和總a-突觸核蛋白比率在帕金 森病診斷特異性和敏感性分別為90. 6%和89. 3% )。
[0072] 3. Mo 11 enhauer B,Locascio JJ, Schulz-Schaeffer W, Sixcl-Doring F,Trenkwalder C，Schlossmacher MG. a -Synuclein and tau concentrations in cerebrospinal fluid of patients presenting with parkinsonism:a cohort study. Lancet Neurol. 2011 ;10(3) :230-240.(腦脊液a-突觸核蛋白檢測(cè)，腦脊液總a-突觸核 蛋白水平降低，診斷特異性和敏感性分別為52. 83%和70. 72% )。
[0073] 4. Kang JH, Irwin DJ, Chen-Plotkin AS, Siderowf A,Caspell C, Coffey CS, Waligorska T,Taylor P，Pan S，F(xiàn)rasier M，Marek K，Kieburtz K，Jennings D，Simuni T，Tanner CM, Singleton A, Toga AW, Chowdhury S，Mollenhauer B,Trojanowski JQ, Shaw LM ；Parkinson, s Progression Markers Initiative. Association of cerebrospinal fluid β -amyloid 1-42, T_tau，P_taul81，and a -synuclein levels with clinical features of drug-naive patients with early Parkinson disease. JAMA Neurol. 2013 ； 70(10):1277-1287.(腦脊液a-突觸核蛋白檢測(cè)，腦脊液總a-突觸核蛋白水平降低并與 總tau以及磷酸化tau有相關(guān)性）。
[0074] 5. Parnetti L，Chiasserini D, Bellomo G，Giannandrea D，De Carlo C，Qureshi MM, Ardah MT,Varghese S，Bonanni L，Borroni B，Tambasco N, Eusebi P，Rossi A，Onofrj M, Padovani A，Calabresi P，El_Agnaf 0. Cerebrospinal fluid Tau/a -synuclein ratio in Parkinson's disease and degenerative dementias. Mov Disord.2011 ； 26(8):1428-1435.(腦脊液a-突觸核蛋白檢測(cè)，腦脊液總a-突觸核蛋白水平降低，總 tau/a -synuclein比值在帕金森病的診斷特異性和敏感性分別為61 %和89% )。
[0075] 6. Shi M, Bradner J, Hancock AM, Chung KA, Quinn JF, Peskind ER, Galasko D, Jankovic J, Zabetian CP, Kim HM, Leverenz JB, Montine TJ, Ginghina C, Kang UJ, Cain KC, Wang Y, Aasly J，Goldstein D，Zhang J. Cerebrospinal fluid biomarkers for Parkinson disease diagnosis and progression. Ann Neurol. 2011 ;69 (3) : 570-580.(腦 脊液a -突觸核蛋白檢測(cè)，腦脊液總a -突觸核蛋白水平降低，在帕金森病的診斷特異性和 敏感性分別為38%和92% )。
[0076] 7. Duran R，Barrero FJ，Morales B，Luna JD, Ramirez M, Vives F. Plasma alpha-synuclein in patients with Parkinson' s disease with and without treatment. Mov Disord. 2010 ;25 (4) :489-493.(血液a-突觸核蛋白檢測(cè)，證明帕金森病 人血漿a -突觸核蛋白水平增高，沒有診斷特異性、敏感性數(shù)據(jù)）。
[0077] 8. Lee PH, Lee G, Park HJ, Bang 0Y, Joo IS, Huh K. The plasma alpha-synuclein levels in patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy. J Neural Transm. 2006 ;113 (10) :1435-1439.(血液a-突觸核蛋白檢測(cè)，證明帕金森病人血 漿a -突觸核蛋白水平增高，沒有診斷特異性、敏感性數(shù)據(jù)）。
[0078] 9. Li QX, Mok SS, Laughton KM, McLean CA, Cappai R, Masters CL, Culvenor JG，Horne MK. Plasma alpha-synuclein is decreased in subjects with Parkinson's disease. Exp Neurol. 2007 ;204 (2) :583-588.(血液a-突觸核蛋白檢測(cè)，證明帕金森病人 血漿a -突觸核蛋白水平降低，沒有診斷特異性、敏感性數(shù)據(jù)）。
[0079] 10.El-Agnaf 0M, Salem SA,Paleologou KE,Curran MD,Gibson MJ,Court JA，Schlossmacher MG，Allsop D.Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 2006 ;20(3) :419-425.(血液a-突觸核蛋白檢測(cè)，證明帕金森病人血漿a-突觸核蛋白 寡聚體水平增高，診斷特異性85。2%、敏感性52.9% )。
[0080] 11. Gorostidi A, Bergareche A, Ruiz-Marti nez J, Mart i-Masso JF, Cruz M,Varghese S，Qureshi MM, Alzahmi F，Al-Hayani A,Lopez de Munain A,El-Agnaf 0M. Alpha-synuclein levels in blood plasma from LRRK2mutation carriers. PLoS One. 2012 ;7 (12): e52312.(血液a-突觸核蛋白檢測(cè)，證明帕金森病人血漿a-突觸核蛋 白水平降低，沒有診斷特異性、敏感性數(shù)據(jù)）。
[0081] 12.Foulds PG, Diggle P, Mitchell JD, Parker A, Hasegawa M, Masuda-Suzukake M, Mann DM, Allsop D. A longitudinal study on a -synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 2013 ;3:2540.(血液 a-突觸核蛋白檢測(cè)， 證明帕金森病人血漿磷酸化a -突觸核蛋白水平增高，沒有診斷特異性、敏感性數(shù)據(jù)）。
[0082] 13. Shi M, Liu C, Cook TJ, Bullock KM, Zhao Y, Ginghina C, Li Y, Aro P, Dator R, He C, Hipp MJ, Zabetian CP, Peskind ER, Hu SC, Quinn JF, Galasko DR, Banks WA, Zhang J. Plasma exosomala -synuclein is likely CNS-derived and increased in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 2014Jul 6. [Epub ahead of print] PubMed PMID:24997849.(血液a-突觸核蛋白檢測(cè)，證明帕金森病人血漿來自于腦的 exsosomal a -突觸核蛋白水平增高，診斷特異性53. 5%、敏感性76. 8% )。
[0083] 通過上述文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在腦脊液中總a-突觸核蛋白水平在帕金森病人中普遍降 低，而寡聚化a-突觸核蛋白水平則增高，腦脊液中的a-突觸核蛋白變化對(duì)帕金森病具有 一定的診斷價(jià)值。但是腦脊液難以取得，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)帕金森病的大規(guī)模檢查。血液樣本容 易獲得，適用于大規(guī)模健康檢查。但以往針對(duì)血漿或血清中的突觸核蛋白的檢測(cè)，由于 易受溶血的影響，使檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。
[0084] 由于血液中99%以上的a-突觸核蛋白都存在于紅細(xì)胞中，故本發(fā)明可以直接檢 測(cè)紅細(xì)胞中與血紅蛋白結(jié)合的a -突觸核蛋白的含量，不受溶血影響，并且具有較高的特 異性和敏感性。
[0085] 由于本發(fā)明效果的優(yōu)越性，本發(fā)明人根據(jù)上述方法制備了一種檢測(cè)試劑盒，所述 試劑盒包括以下試劑：
[0086] 抗人血紅蛋白單克隆抗體 [0087] 抗人a-突觸核蛋白單克隆抗體
[0088] 根據(jù)需要，所述試劑盒還可包括以下輔助試劑：
[0089] 堿性磷酸酶，或親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶
[0090] 對(duì)硝基苯磷酸顯色液
[0091] ELISA 酶標(biāo)板
[0092] PBS
[0093] NaHC03 緩沖液
[0094] 封閉液
[0095] PBST
[0096] 其中，
[0097] PBS的濃度為0· 01mol/L，配制方法為
[0098] Na2HP04 2.72 g NaH2P04 0.28 g NaCl 9.00 g DDW (雙蒸水） 1000 ml
[0099] NaHC03緩沖液的濃度為200mmol/L，pH 9. 6,配制方法為
[0100] NaHC03 0.84g
[0101] 20%疊氮鈉（似吧） 50 μ 1
[0102] DDW 50ml
[0103] 封閉液的濃度為2. 5%，配制方法為
[0104] 明膠 2. 5g
[0105] PBST 100ml
[0106] PBST 為含 0· 05% Tween20 的 0· 01mol/L PBS，配制方法為
[0107] Na2HP04 2.72 g NaH2P04 0.28 g Nad 9.00 g DDW 1000 ml Tween-20 500 μ?
[0108] 上述試劑盒的使用是以血紅蛋白-重組人α-突觸核蛋白復(fù)合體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白， 以該復(fù)合體濃度與吸光度值的關(guān)系曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測(cè)定樣本中的與血紅蛋白結(jié)合 的a-突觸核蛋白的濃度達(dá)到診斷帕金森病的目的。
[0109] 本發(fā)明的試劑盒，各試劑分別包裝，優(yōu)選使用包裝管，每個(gè)包裝管中裝入試劑的量 以夠一個(gè)樣本使用量為基本量，可以擴(kuò)大到10個(gè)，100個(gè)，1000個(gè)樣本的使用量。
[0110] 本發(fā)明的試劑盒的使用是根據(jù)上述檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)與血紅蛋白結(jié)合的突觸核 蛋白含量的方法進(jìn)行的，使用時(shí)將試劑盒中的試劑根據(jù)需要配制成相應(yīng)的濃度，按照所述 方法測(cè)定即可。
[0111] 為研究本發(fā)明，還進(jìn)行了以下重復(fù)性試驗(yàn)，精密度試驗(yàn)，檢測(cè)方法的篩選等試驗(yàn)。
[0112] 將實(shí)施例3中制備的試劑盒分別取三批進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。以實(shí)施例3中所抽取的 試劑盒測(cè)定三份高、中、低值樣本〇. 5mmol/L、0. 125mmol/L和0. 03125mmol/L各8次。計(jì)算 測(cè)定濃度的變異系數(shù)。實(shí)施例3中的三批試劑盒的結(jié)果表明變異系數(shù)小于8. 0%。
[0113] 相同樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果顯示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD為0. 60%。
[0114] 采用棋盤滴定試驗(yàn)確定抗體包被濃度、樣本稀釋倍數(shù)以及生物素化抗體濃度。根 據(jù)初步確定的濃度縮小間距，再做進(jìn)一步棋盤滴定，確定最佳試驗(yàn)條件。最終確定人血紅蛋 白抗體包被濃度為2 μ g/mL,樣本稀釋倍數(shù)為1 :4,生物素化抗體濃度為1 μ g/mL為最佳實(shí) 驗(yàn)條件。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0115] 圖1紅細(xì)胞胞漿蛋白分離過程示意圖
[0116] 圖2血紅蛋白結(jié)合總a-突觸核蛋白在帕金森病患者明顯高于健康受試者（左 圖，Ρ〈0· 01)。受試者工作曲線（Receiver operating characteristic curve, R0C)分析 表明，血紅蛋白結(jié)合α -突觸核蛋白在帕金森病診斷的特異性和敏感性分別為89. 0 %和 87. 3%。CTL :健康對(duì)照；PD :帕金森病人

【具體實(shí)施方式】：
[0117] 以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0118] 實(shí)施例1，
[0119] 紅細(xì)胞胞漿蛋白的制備（圖1)
[0120] 步驟 1，
[0121] 取5-10ml抗凝血（EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝）。將抗凝血上下顛倒輕輕混勻，貼壁 加入至50ml離心管中，記錄全血的體積，1 :1加入PBS，充分混勻。步驟2，
[0122] 將稀釋后的全血緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液上，400Xg，離心20min。此時(shí)管內(nèi)液體 由上至下的順序依次為血漿層、白膜層（外周血單個(gè)核細(xì)胞）、分離液層以及紅細(xì)胞層。
[0123] 步驟 3，
[0124] 吸去血漿層、白膜層和分離液層，將底層的紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的50ml離心管中，力口 PBS至40ml，2000rpm，離心lOmin，如此反復(fù)3次。分裝，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0125] 步驟 4，
[0126] 凍存紅細(xì)胞在室溫融化后放入4°C離心機(jī)，13000rpm，離心lOmin，抽提紅細(xì)胞胞 楽蛋白備用。
[0127] 實(shí)施例2，
[0128] 血紅蛋白結(jié)合α-突觸核蛋白的ELISA檢測(cè)過程
[0129] 步驟 1，
[0130] 包被：用NaHC03緩沖液稀釋抗人血紅蛋白抗體至終濃度為約0. 1- 2 μ g/mL。向 酶標(biāo)板各孔加入1〇〇 μ L該抗體稀釋液，4°C孵育過夜。用PBST (其為含有吐溫的PBS)沖洗 酶標(biāo)板各孔，根據(jù)需要確定沖洗次數(shù)和時(shí)間。
[0131] 步驟 2，
[0132] 封閉：向酶標(biāo)板各孔加入100 μ L封閉液（其為含有明膠和Tween-20的PBS)，在 37°C孵育1?2小時(shí)。用PBST沖洗酶標(biāo)板各孔，根據(jù)需要確定沖洗次數(shù)和時(shí)間。
[0133] 步驟 3，
[0134] 加樣：向各孔加入100 μ L已制備好的紅細(xì)胞胞漿樣品，濃度為8?10 μ g/mL，在 37°C孵育1?2小時(shí)。用PBST沖洗酶標(biāo)板各孔，根據(jù)需要確定沖洗次數(shù)和時(shí)間。
[0135] 步驟 4，
[0136] 加檢測(cè)抗體：用封閉液稀釋生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度 為0. 1?2 μ g/mL。向酶標(biāo)板的各孔加入100 μ L該抗體稀釋液，在37°C孵育1?2小時(shí)。 用PBST沖洗酶標(biāo)板各孔，根據(jù)需要確定沖洗次數(shù)和時(shí)間。
[0137] 步驟 4，
[0138] 加標(biāo)記酶和顯色液：用封閉液稀釋親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶（由Sigma公司出 售），向酶標(biāo)板的各孔加入100 μ L該標(biāo)記酶的稀釋液，在37°C孵育0. 5?2小時(shí)。用PBST 沖洗酶標(biāo)板各孔，根據(jù)需要確定沖洗次數(shù)和時(shí)間。
[0139] 向酶標(biāo)板的各孔加入100 μ L pNPP(對(duì)硝基苯磷酸顯色液，由Sigma公司出售）， 37 °C顯色10?50分鐘。
[0140] 步驟 5，
[0141] 測(cè)定吸光度值：用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處酶標(biāo)板各孔的吸光度值。
[0142] 根據(jù)體外制備的血紅蛋白-人α-突觸核蛋白復(fù)合體標(biāo)準(zhǔn)蛋白中α-突觸核蛋白 的濃度與405nm處吸光值之間的關(guān)系曲線，計(jì)算樣品中與血紅蛋白結(jié)合總α -突觸核蛋白 的量。
[0143] 實(shí)施例3，
[0144] 真實(shí)樣品的檢測(cè)（圖2)
[0145] 采用相對(duì)定量ELISA法，對(duì)100例臨床診斷的帕金森病人和100例健康對(duì)照人群 血液紅細(xì)胞胞漿中與血紅蛋白結(jié)合的突觸核蛋白的量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示帕金森病人 紅細(xì)胞中與血紅蛋白結(jié)合的α -突觸核蛋白的量為〇. 83 μ mol/L，帕金森病人紅細(xì)胞中與 血紅蛋白結(jié)合的α-突觸核蛋白的最高值為1.025 μ mol/L;而正常健康對(duì)照紅細(xì)胞中與血 紅蛋白結(jié)合的α-突觸核蛋白的量為0.454 μ mol/L，最高值為0.597 μ mol/L。帕森病人紅 細(xì)胞中與血紅蛋白結(jié)合的α -突觸核蛋白的量明顯高于正常健康對(duì)照（P < 〇. 01)。
[0146] 實(shí)施例4，
[0147] 試劑盒成分舉例（1塊ELISA酶標(biāo)版，可用于24個(gè)人樣本檢測(cè)）
[0148] 抗人血紅蛋白單克隆抗體20 μ g
[0149] 生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體1〇 μ g
[0150] 堿性磷酸酶，或親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶5 μ L
[0151] 對(duì)硝基苯磷酸顯色液10mL
[0152] ELISA 酶標(biāo)板
[0153] PBS 0. 01mol/L, 10mL
[0154] NaHC03 緩沖液 200mmol/L，lOmL
[0155] 封閉液 lOmL
[0156] PBST 300mL。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)與血紅蛋白結(jié)合的總α-突觸核蛋白含量的試劑盒，試劑盒中包括 以下試劑：抗人血紅蛋白單克隆抗體，生物素化抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體，血紅蛋 白-α -突觸核蛋白復(fù)合體標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，根據(jù)需要，所述試劑盒還可包括以下輔助試劑：堿 性磷酸酶，或親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶，對(duì)硝基苯磷酸二鈉顯色液，ELISA酶標(biāo)板，磷酸緩沖 液，NaHC03緩沖液，封閉液，PBST。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中 磷酸緩沖液的濃度和pH值為0. Olmol/L，pH7. 4， NaHC03緩沖液的濃度和pH值為200mmol/L, ρΗ9· 6， PBST 的濃度為含 0· 05% Tween-20 的 0· 01mol/L PBS， 封閉液的成分為含2. 5%明膠的PBST。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中各試劑分別包裝，每個(gè)包裝裝入試劑的量以夠 一個(gè)樣本使用量為基本量，可以擴(kuò)大到10個(gè)，1〇〇個(gè)，1〇〇〇個(gè)樣本的使用量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，抗人血紅蛋白單克隆抗體可以是任何一種特異性識(shí) 別人血紅蛋白的單克隆抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體可以是任何一 種特異性識(shí)別人α-突觸核蛋白的單克隆抗體，如：1Β2小鼠抗人α-突觸核蛋白單克隆抗 體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中血紅蛋白-α-突觸核蛋白復(fù)合體標(biāo)準(zhǔn)蛋白的制 備方法如下： 1) 用500yL的0.01m〇l/L PBS溶解α-突觸核蛋白和血紅蛋白分別至終濃度為2mol/ L 與 lmol/L，于 37°C、230rpm、振蕩孵育 24h ; 2) 孵育樣品在l〇〇〇〇Xg離心5min，吸取上清，以PBS為流動(dòng)相，HiPrep 26/60Sephacryl S_200High Resolution 層析柱凝膠過濾； 3) 分離血紅蛋白_α -突觸核蛋白復(fù)合體； 4) 用SWATH定量蛋白組方法，確定平均每個(gè)血紅蛋白分子結(jié)合的α-突觸核蛋白分子 數(shù)，從而計(jì)算出α-突觸核蛋白占復(fù)合體的重量百分比和摩爾百分比。
8. -種用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)與血紅蛋白結(jié)合的總α-突觸核蛋白 含量的方法，包括以下步驟： 1) 分離紅細(xì)胞中的胞漿蛋白； 2) 用抗人血紅蛋白單克隆抗體捕獲胞漿蛋白中的血紅蛋白； 3) 用生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體檢測(cè)與血紅蛋白結(jié)合的α -突觸核蛋 白； 4) 加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶和顯色劑，進(jìn)行顯色； 5) 用分光光度法對(duì)顯色的樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中與血紅蛋白結(jié) 合的α-突觸核蛋白的含量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，步驟如下： 步驟1， 取靜脈血，必要時(shí)可以加入EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝，分離紅細(xì)胞，凍融破碎紅細(xì)胞，再 經(jīng)過離心即得紅細(xì)胞胞漿蛋白； 步驟2， 抗人血紅蛋白單克隆抗體包被ELISA酶標(biāo)板，并加入封閉液進(jìn)行封閉，隨后加入步驟1 得到的紅細(xì)胞胞漿蛋白，或不同濃度的血紅蛋白-α-突觸核蛋白復(fù)合體標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用于標(biāo) 準(zhǔn)曲線的繪制； 步驟3， 向步驟2的ELISA酶標(biāo)板中加入生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體，親和素 標(biāo)記的堿性磷酸酶，對(duì)硝基苯磷酸顯色液； 步驟4， 在405nm處測(cè)定酶標(biāo)板各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血紅蛋白結(jié)合α -突觸核 蛋白含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，步驟如下： 步驟1， 取5-10ml抗凝血，混勻，貼壁加入至離心管中，記錄全血的體積，1:1加入PBS，充分混 勻， 將稀釋后的全血緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液上，離心，分離紅細(xì)胞層。將紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新 的離心管中，加PBS，離心，-80°C保存， 凍存紅細(xì)胞在室溫融化后放入離心機(jī)，離心，上層即為紅細(xì)胞胞漿蛋白， 步驟2,包被：用NaHC03緩沖液稀釋抗人血紅蛋白抗體至終濃度為0. 1-4 μ g/mL。向酶 標(biāo)板各孔加入該抗體稀釋液，孵育過夜。沖洗， 封閉：向酶標(biāo)板各孔加入封閉液，孵育1?2小時(shí)，沖洗，加入紅細(xì)胞胞漿樣品，或不同 濃度的血紅蛋白- α -突觸核蛋白復(fù)合體標(biāo)準(zhǔn)蛋白，孵育1?2小時(shí)，沖洗， 步驟3， 用封閉液稀釋生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度為0. 1?2μ g/mL。 向酶標(biāo)板的各孔加入該抗體稀釋液，孵育1?2小時(shí)，沖洗， 用封閉液稀釋親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶，向酶標(biāo)板的各孔加入該酶的稀釋液，孵育 0. 5?2小時(shí)，沖洗， 向酶標(biāo)板的各孔加入對(duì)硝基苯磷酸顯色液，顯色10?50分鐘， 步驟4， 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定405nm處的酶標(biāo)板各孔的吸光度值， 根據(jù)體外制備的血紅蛋白- α -突觸核蛋白復(fù)合體標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度與405nm處吸光值 之間的關(guān)系曲線，計(jì)算樣品中與血紅蛋白結(jié)合的人α-突觸核蛋白的量。鑒于包被的捕獲 抗體的濃度在不同測(cè)試組間是一致的，因此捕獲到的血紅蛋白的含量也是一致的。因此，不 同組別之間的吸光度的差異取決于與血紅蛋白結(jié)合的α-突觸核蛋白數(shù)量的不同。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104215779SQ201410477971
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】于順, 楊巍巍, 李昕 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院