液質聯(lián)用儀同時檢測柑橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢驗檢疫技術，尤其涉及一種液質聯(lián)用儀同時檢測柑橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法。該發(fā)明采用QuEChERS凈化技術-超高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)四級桿質譜檢測，優(yōu)化分析程序和參數(shù)，對常用于柑橘保鮮的多種保鮮劑殘留檢測進行定性和定量方法研究，分別是多菌靈、噻菌靈、咪酰胺、抑霉唑、甲基硫菌靈、咪酰胺和2,4-D。從而建立高靈敏度、準確、快速、能同時檢測多種防腐保鮮劑殘留的檢測技術。
【專利說明】液質聯(lián)用儀同時檢測柏橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢驗檢疫技術，尤其涉及一種液質聯(lián)用儀同時檢測巧橘中多種防腐保 鮮劑殘留的方法。

【背景技術】
[0002] 我國巧橘種植面積和產量分別約占世界巧橘總面積和總產量的39%和31. 6%， 位列世界第一。巧橘富含多種營養(yǎng)成分和獨特的生理活性物質，深受人們的喜愛。巧橘除 用于鮮食外，也可加工成多種副產品。巧橘是我國南方地區(qū)栽培面積最大、經濟地位最重要 的果樹之一，浙江省是我國重要的巧橘生產基地。近年來，隨著巧橘產量的激增，巧橘供求 關系發(fā)生了根本的變化，由賣方市場轉向了買方市場，由數(shù)量型消費轉變?yōu)橘|量型消費。巧 橘產量的連年增長，使得巧橘的國內市場競爭越來越激烈，因此，擴大巧橘出口量是增加巧 橘銷售的重要途徑。浙江省巧橘W出口鮮果和橘子罐頭為主，W歐美、俄羅斯、日本和東南 亞為主要市場。
[0003] 然而，我國出口的一些農產品往往由于有毒有害物質殘留量超過外方的限制標 準，被拒收、扣留、退貨、索賠和終止合同的現(xiàn)象屢屢發(fā)生，部分傳統(tǒng)大宗出口創(chuàng)匯商品被迫 退出國際市場。我國是第一水果生產大國，但在世界水果出口貿易中我國水果所占份額很 小，而且售價低，有毒有害物質含量超標是造成該一局面的原因之一。發(fā)達國家通過設立嚴 格限量標準，一方面保證本國公民的身體健康，一方面為阻礙包括水果在內的農產品進入 國際市場制造技術貿易壁壘。
[0004] 近年來，巧橘中的化學防腐保鮮劑對人體的危害越來越受到人們的關注。由于巧 橘在采摘后的膽藏中由于自身生理活動和有害生物危害等原因，會造成損失。目前我國普 遍使用防腐保鮮劑來降低因病原微生物浸染而導致巧橘在膽藏期的損失，其中化學防腐劑 因其效果好、成本低、使用方便等優(yōu)勢占據(jù)了市場主導地位?；瘜W防腐保鮮劑雖然具有良好 的防腐保鮮的作用，但大多化學防腐保鮮劑有不同程度的毒性，巧橘中的保鮮劑殘留會對 人體健康產生不利影響，甚至出現(xiàn)致癌、致崎、致突變等情況，化學防腐保鮮劑在巧橘膽藏 中的應用造成的高毒高殘留問題因此也越來越受到人們的關注。一些發(fā)達國家修訂的水果 或巧橘中化學防腐保鮮劑限量要求日趨嚴格。例如我國巧橘中咪鮮胺限量為5mg/kg，而加 拿大對其的限量為0. Img/kg。日本2006年實行的農藥、獸藥及相關化學物質"肯定列表制 度"規(guī)定水果中苯菌靈，硫菌靈，甲基硫菌靈和多菌靈總量最低限量不超過2mg/kg等。該些 都有可能成為國外限制我國巧橘出口的技術壁壘，影響我國橘農增收。因此，為幫助出口企 業(yè)降低風險，有效規(guī)避發(fā)達國家對我國出口巧橘的技術壁壘，發(fā)展快速、可靠、靈敏的防腐 保鮮劑殘留檢測技術無疑是控制有毒有害物質殘留、保障進出口食品安全、避免國際間有 關貿易爭端的基礎。本研究具有重要的社會和經濟意義。
[0005] 我國發(fā)布實施的國家標準《食品中農藥最大殘留限量KGB2763-2014)規(guī)定了水果 中殺菌劑的最大殘留限量，其中，多數(shù)殺菌劑可用作食品保鮮劑。多菌靈、喔菌靈、咪醜胺、 抑霉哇、甲基硫菌靈、咪醜胺、2, 4-D等都是常用的化學防腐保鮮劑，廣泛應用于水果等多種 作物生長期和儲存期真菌性病害的防治，若使用不當，會在水果及由水果制成的果汁中殘 留。
[0006] 目前，雖然已有涂膜、減壓處理、高壓處理、天然保鮮劑、生物保鮮劑等巧橘保鮮新 技術的研究與報道，但受到技術、成本等因素影響，我國對于巧橘防腐保鮮處理普遍使用的 仍是化學防腐保鮮劑。針對防腐保鮮劑的檢測分析方法，已報道的主要有高效液相色譜、氣 相色譜、液相色譜一質譜聯(lián)用及酶聯(lián)免疫法等。氣相色譜法或液相色譜法易受雜質干擾，且 靈敏度低；酶聯(lián)免疫方法操作過程繁瑣，且條件要求苛刻；而液相色譜一質譜聯(lián)用法溶劑 消耗量大、耗時長。
[0007] 由于防腐保鮮劑混配使用具有協(xié)同作用，我國巧橘主產區(qū)大多采用混配藥劑來提 高巧橘的防腐保鮮效果。隨著混配防腐保鮮劑的廣泛應用，單個防腐保鮮劑檢測方法已不 能滿足現(xiàn)實需要，迫切需要能夠快速、可靠的高通量檢測方法，該對于保障消費者健康，避 免和減少不必要的農業(yè)損失和國際貿易爭端具有重要的理論和實踐意義。
[0008] QuEQiERS 凈化技術為如cik, Easy, Qieap, Effective, Rugged, Safe 首字母的 縮寫，中文解釋為快速、簡單、經濟、高效、安全的分析前處理方法，2003年由美國農業(yè)部 MAnastassiades等共同研發(fā)，后經過多方面的驗證和改進，正式提出了如E化ERS方法?，F(xiàn) 在如E化邸S已經成為了全球檢測水果、蔬菜中農殘時的標準樣品處理方法。除此W外，其 應用也涉及到越來越多的不同領域，比如肉類、血液樣品、酒、甚至±壤中抗生素、藥物、濫 用藥、還有其他污染物的檢測。
[0009] 在HPLC基礎上發(fā)展起來的超高效液相色譜扣化C)技術采用了 3.5 ym，甚至 1. 7 y m細顆粒固定化比起傳統(tǒng)的HPLC技術，UPLC提供了更大的色譜峰容量、更高的分辨 率和靈敏度W及更快的分析速度。由于巧橘中防腐保鮮劑有些化學結構，性質類似，很難在 短時間內同時分離，因此本研究采用快速高效液相扣PLC)能有效的縮短分析時間、提高色 譜分辨率和分析通量。液相色譜-質譜聯(lián)用檢測法是近幾年興起的新技術，由于液質聯(lián)用 技術具有極高的靈敏度，適合進行痕量分析，同時可提供的分子量和碎片質量等結構信息， 可靠性較高，可同時測定多種物質，歐盟、美國等均將液質聯(lián)用方法列為確證方法。


【發(fā)明內容】

[0010] 為了解決上述的技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種液質聯(lián)用儀同時檢測巧橘中 多種防腐保鮮劑殘留的方法，該方法具有高靈敏度、準確、快速、能同時檢測多種防腐保鮮 劑殘留的特點。
[0011] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了W下的技術方案：
[0012] 液質聯(lián)用儀同時檢測巧橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法，所述的多種防腐保鮮劑 為多菌靈、喔菌靈、咪醜胺、抑霉哇、甲基硫菌靈、咪醜胺和2, 4-滴，該方法包括W下的步 驟：
[0013] 1)標準儲備液的配制
[0014] 用十萬分之一天平準確稱取7種保鮮劑標準品IOmg于燒杯中，精確至0. Img,加己 膳溶解并定容至IOmL容量瓶中，其中喔菌靈用甲醇溶解，多菌靈用5%甲酸己膳溶解，混勻 配制成濃度為IOOOy g/mL的單標儲備液，在冰箱中TC?4C保存；
[001引。標準工作溶液
[0016] 分別準確移取ImL各單標儲備液置于IOOmL蹤色容量瓶中，用己膳定容至刻度， 配成IOy g/mL的混合標準中間液；根據(jù)需要移取適量混合標準中間液，用稀釋成化g/mL、 5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標準工作溶液，所述的己膳-水溶液含 0. 15%甲酸，己膳-水的體積比為1:1，各種標準溶液密封保存于4C冰箱中；
[0017] 3)試樣制備
[0018] 取200g帶皮枯橘樣品經四分法選取一定量的樣本，經粉碎或組織搗碎機勻漿，裝 入樣品袋中，密封、標記、rc?4C冰箱中冷藏待用；
[001引 4)樣品提取
[0020] 稱取試樣IOg于50血具塞離也管中，精確至0. Olg,加入20血5%甲酸-己膳溶液， 縱潤混合2min，加入Ig氯化軸鹽析至少30min，然后W 600化/min離也5min待凈化； [00川 W樣品凈化
[002引稱取900mg無水硫酸鎮(zhèn)、150mg PSA、150mg C18于15血塑料離也管中，混勻作為凈 化試劑；準確移取6血離也后的上清液于凈化管中，潤旋混勻，W 3000r/min離也5min，取 1血凈化后上清液用蒸觸水稀釋一倍后過0. 22 y m濾膜，供液相色譜串聯(lián)質譜儀測定； [002引 6)色譜測定
[0024] a)色譜柱；Hypersil GOLD C18, 1. 9 y m, 2. ImmX 50mm，或相當者；
[00巧]b)梯度洗脫條件：
[0026]

【權利要求】
1.液質聯(lián)用儀同時檢測柑橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法，所述的多種防腐保鮮劑為 多菌靈、噻菌靈、嘧霉胺、抑霉唑、咪酰胺、甲基硫菌靈和2, 4-滴，其特征在于該方法包括以 下的步驟： 1) 標準儲備液的配制 用十萬分之一天平準確稱取7種保鮮劑標準品IOmg于燒杯中，精確至0.lmg，加乙腈溶 解并定容至IOmL容量瓶中，其中噻菌靈用甲醇溶解，多菌靈用5%甲酸乙腈溶解，混勻配制 成濃度為ΙΟΟΟμg/mL的單標儲備液，在冰箱中1°C?4°C保存； 2) 標準工作溶液 分別準確移取ImL各單標儲備液置于IOOmL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度,配成 10μg/mL的混合標準中間液；根據(jù)需要移取適量混合標準中間液，用稀釋成2ng/mL、5ng/ mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標準工作溶液,所述的乙腈-水溶液含0· 15% 甲酸，乙腈-水的體積比為1:1，各種標準溶液密封保存于4°C冰箱中； 3) 試樣制備 取200g帶皮柑橘樣品經四分法選取一定量的樣本，經粉碎或組織搗碎機勻漿，裝入樣 品袋中，S封、標記、IC?4C冰箱中冷減待用； 4) 樣品提取 稱取試樣IOg于50mL具塞離心管中，精確至0. 01g，加入20mL5%甲酸-乙腈溶液，漩 潤混合2min，加入Ig氯化鈉鹽析至少30min，然后以6000r/min離心5min待凈化； 5) 樣品凈化 稱取900mg無水硫酸鎂、150mgPSA、150mgC18于15mL塑料離心管中，混勻作為凈化 試劑；準確移取6mL離心后的上清液于凈化管中，渦旋混勻，以3000r/min離心5min，取ImL 凈化后上清液用蒸餾水稀釋一倍后過0. 22μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質譜儀測定； 6) 色譜測定 a)色譜柱：Hypersil GOLD018，1.94111，2.1111111\5〇111111，或相當者； b) 梯度洗脫條件:_
c) 柱溫：35°C d) 進樣量：2yL; 7) 質譜測定 a) 離子源：電噴霧離子源； b) 掃描方式：正負切換掃描； c) 檢測方式：多反應監(jiān)測； d) 毛細管溫度：350°C; e) 蒸發(fā)溫度：300°C; f) 電噴霧電壓：+3500(-3000)V; g) 鞘氣：30arb; h) 輔助氣：IOarb; i) 碰撞氣：氦氣； j) SRM監(jiān)測離子對、S-Lens電壓、碰撞電壓、掃描模式和保留時間如下：
8) 儀器測定 樣品進樣的程序為：試劑空白、標準工作曲線、樣品空白、樣品添加與實際樣品，重復以 上步驟； 9) 定量方法 按步驟8)進樣，用色譜工作站建立標準工作曲線，樣品采用工作曲線定量。
2.根據(jù)權利要求1所述的液質聯(lián)用儀同時檢測柑橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法，其 特征在于所述的柑橘為蜜桔、櫳柑或胡柚。
【文檔編號】G01N30/02GK104237414SQ201410486081
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權日:2014年9月22日
【發(fā)明者】彭芳, 雷美康, 祝子銅, 吳曉勤, 徐佳文 申請人:衢州出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心