一種檢測玉米細(xì)菌性枯萎病菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法
【專利摘要】一種檢測玉米細(xì)菌性枯萎病菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法，屬于免疫分析領(lǐng)域。本發(fā)明用玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB449（來自湖南省進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局）免疫BALB/c小鼠，經(jīng)免疫、融合、篩選得5株玉米細(xì)菌性枯萎病菌單抗。5株抗體分別標(biāo)記HRP并以該菌體進(jìn)行兩兩配對。以11C2（單克隆細(xì)胞株H號）為包被抗體，10B1（單克隆細(xì)胞株I號）為酶標(biāo)抗體，以NCPPB449菌體為標(biāo)準(zhǔn)品建立夾心ELISA法。LOD為1.5×104cfu/mL，線性范圍4.57×105~1.11×108cfu/mL。本發(fā)明用理化性質(zhì)高度均一、特異性好、可大量制備的單克隆抗體，建立的夾心法靈敏度高，成本低，與丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種等無交叉反應(yīng)，為玉米種子中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢測提供了快速高效的分析手段。
CGMCC No.9308
2014.05.28

CGMCC No.9309
2014.05.28
【專利說明】-種檢測玉米細(xì)菌性枯萎病菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及了一種定量檢測玉米種子中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的雙抗體夾也法，屬 于免疫分析領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 玉米細(xì)菌性枯萎?。ǔ??3扣'5 ifecteriay 〇/仿/77)是玉米上的一種 毀滅性的病害，我國尚無該病害發(fā)生。其病原菌玉米細(xì)菌性枯萎病菌，學(xué)名： Stewartii Dye，勞名-.Pawpaw Stewaritii subsp. Stewartii。三巨文!乏紳5lift生本古^巧壽胃（/?占） 屬于腸桿菌科多源菌屬，是一種黃色、不運(yùn)動(dòng)、無內(nèi)生抱子、革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，可W 引起玉米細(xì)菌性枯萎病。1897年首次發(fā)現(xiàn)于美國紐約長島，之后傳播到世界其他地區(qū)。目 前已知發(fā)生地區(qū)有加拿大、墨西哥、己西、秘魯、圭亞那、意大利、波蘭、羅馬尼亞、南斯拉夫、 泰國、越南、馬來西亞等。玉米細(xì)菌性枯萎病菌可W通過帶菌種子遠(yuǎn)距離傳播(種傳)，在病 區(qū)則W昆蟲傳播為主，如玉米跳甲等，玉米在生長的各個(gè)階段均能被玉米細(xì)菌性枯萎病菌 進(jìn)行侵染。在國際貿(mào)易中，帶菌種子是該病遠(yuǎn)距離傳播的主要因素，是傳入無病區(qū)的主要侵 染源。我國目前尚未發(fā)現(xiàn)玉米細(xì)菌性枯萎病的發(fā)生，但傳入風(fēng)險(xiǎn)很高，已經(jīng)列為我國進(jìn)境一 類檢疫對象，只有證實(shí)未染菌的玉米產(chǎn)品才可W入境。在1992年農(nóng)業(yè)部頒布的《中華人民 共和國進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病、蟲、雜草名錄》中，被列為一類危險(xiǎn)性有害生物。
[0003] 對玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢測診斷方法包括野外觀察、生理生化鑒定、免疫學(xué)檢 測和鑒定、W及PCR檢測技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)技術(shù)和生物傳感技術(shù)也被用來檢測 玉米細(xì)菌性枯萎病菌。但生化檢測技術(shù)耗時(shí)過長，且檢測結(jié)果存在不可靠性。PCR檢測技術(shù) 相比具有很好的靈敏性與準(zhǔn)確性，但由于依賴于昂貴的儀器和專業(yè)的檢測人員，不適用于 大量產(chǎn)品的快速檢測。ELISA檢測技術(shù)依賴于高度特異性與靈敏性的抗體，在檢測靈敏度上 雖然不如PCR方法，但是由于檢測快速、批量、便宜，因此十分適合于大批量樣品的粗篩檢 測。
[0004] 由于玉米細(xì)菌性枯萎病菌會對農(nóng)業(yè)帶來巨大威脅與損失，因此快速準(zhǔn)確的檢測方 法顯得尤為重要。ELISA憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點(diǎn)成為致病菌的常規(guī)檢 測方法?？贵w的親和力、交叉反應(yīng)、穩(wěn)定性對于化ISA方法的靈敏度和特異性有著關(guān)鍵性的 決定作用。
[0005] 因此，本發(fā)明制備了高靈敏的玉米細(xì)菌性枯萎病菌的單克隆抗體并W此為基礎(chǔ)建 立了雙抗體夾也化ISA法，對玉米種子中玉米細(xì)菌性枯萎病菌進(jìn)行了檢測，為玉米細(xì)菌性 枯萎病菌的大批量、快速、準(zhǔn)確的檢測奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] (一）要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法 簡單的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，用于玉米種子中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的大批量、快速、準(zhǔn)確 檢測。
[0007] (二）技術(shù)方案 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種基于單克隆抗體的檢測玉米種子中玉米細(xì)菌性枯 萎病菌的雙抗體夾也酶聯(lián)免疫法，該方法包括對檢測方法的優(yōu)化。
[0008] ( 1)玉米細(xì)菌性枯萎病菌單克隆抗體的制備 單克隆抗體是采用玉米細(xì)菌性枯萎病菌（NCPPB 449,來自湖南省進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局） 菌體經(jīng)過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。玉米細(xì)菌性枯 萎病菌NCPPB 449菌體做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下：第一周進(jìn) 行首免，1 X IO8C化玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多 點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，IX IO8C化玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，弗氏不完全 佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行H免，1 X IO7 C化玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌 體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第走周尾部采血測效價(jià)，分別挑選對玉米細(xì) 菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體效價(jià)最高的老鼠；第九周進(jìn)行沖刺免疫，1 X IO7C化玉米細(xì)菌 性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后分別眼眶采血 后進(jìn)行融合、篩選，共篩選到5個(gè)細(xì)胞株。
[0009] (2)單克隆抗體的配對篩選 將純化后的5株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn) 行夾也法配對；配對參數(shù)如下：包被抗體2 y g/mL ;包被液為0. 01M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖 液；標(biāo)品濃度1 X IO8C化/mL ;標(biāo)品稀釋液0. 01M、抑7. 2的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋500倍使用； 在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 5對P/N值巧的配對； 用于配對的抗體是通過優(yōu)化參數(shù)下夾也法配對，并通過多次試驗(yàn)篩選確定的，具有穩(wěn) 定性好、靈敏度高的特點(diǎn)。
[0010] (3)夾也法的建立 選擇檢測限穩(wěn)定、靈敏的配對，即W單克隆細(xì)胞株H號（11C2)為包被抗體，單克隆細(xì)胞 株I號（IOBl)作為酶標(biāo)抗體建立夾也法；具體參數(shù)如下： 包被抗體濃度；2 U g/mL 包被液；〇. 01M、pH 9. 6碳酸鹽緩沖液 標(biāo)品稀釋液；〇. 01M、pH7. 2 PBS+0. 2%Tween 酶標(biāo)抗體濃度；2. 5 y g/mL 反應(yīng)時(shí)間：包被抗體：封閉37°C，2h ;標(biāo)準(zhǔn)品；37°C，lh ;酶標(biāo)抗體；37°C，lh ;顯色 IOmin ； 優(yōu)化后玉米細(xì)菌性枯萎病菌夾也法的LOD ;1. 5 X IO4 C化/mL。
[0011] 建立的夾也法優(yōu)化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)抗體 稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋濃度。LOD達(dá)到了 1.5 X 1〇4 C化/mL。
[0012] 本發(fā)明方法的檢測分析原理是： 酶標(biāo)板上包被了捕獲抗體11C2,合適的濃度下可W最大限度捕獲玉米細(xì)菌性枯萎病 菌；洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液220UL封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn)；洗板3次， 加入樣品和對照，37°C賠育Ih ;洗板3次，加入酶標(biāo)抗體10B1-HRP，37°C賠育Ih ;洗板4次， 加入顯色液顯色12min。如果樣品有足夠的玉米細(xì)菌性枯萎病菌，那么玉米細(xì)菌性枯萎病 菌被捕獲抗體11C2捕獲并與酶標(biāo)抗體lOBl-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值（P/ N > 2. 1)，并被判定為陽性；如果樣品中玉米細(xì)菌性枯萎病菌濃度太低（P/N《2. 1)那么樣 品不被捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足W引起足夠的信號，被判定為陰性。
[001引（S)有益效果 本發(fā)明提供的玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾也檢測方法采用了理化性質(zhì)高度均一、特 異性好、可W大量制備的玉米細(xì)菌性枯萎病菌單克隆抗體，建立的夾也法靈敏度高，穩(wěn)定性 好、成本低，樣品的前處理過程簡單，能同時(shí)檢測大量樣品，適合食品行業(yè)大規(guī)模、高通量、 快速、靈敏的檢測要求，具有推廣和應(yīng)用價(jià)值。
[0014] 生物材料樣品保藏；一株單克隆細(xì)胞株H號（又稱11C2)，已保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中也，簡稱CGMCC，地址；北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學(xué)院微生物研究所，保臧日期2014年5月28日，保臧編號為CGMCC No. 9308。
[0015] 一株單克隆細(xì)胞株I號(又稱IOBl)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中也，簡稱CGMCC，地址；北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研 究所，保藏日期2014年5月28日，保藏編號為CGMCC No. 9309。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾也法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0017] 圖2.玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾也化ISA特異性 1、下香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種；2、水稻白葉枯病菌；3、水稻細(xì)菌性谷枯病菌；4、水 稻細(xì)菌性條斑病菌；5、玉米細(xì)菌性枯萎病菌；6、下香假單胞菌下香致病變種。 具體實(shí)施方案
[0018] W下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[001引一、儀器： TCL - 40B臺式低速離也機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠 KFLOW純水機(jī)，凱佛隆公司 ZD - 9556水平搖床，太倉科教器材廠 96孔8X 12可拆酶標(biāo)板，廈口怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司 MuLtiska Mks 酶標(biāo)儀，Thermo L油systems 公司 可調(diào)試移液器，Thermo L油systems公司 潤旋混合器，上海滬西儀器分析廠 二、試劑： 四甲基聯(lián)苯胺（TMB)，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司 其他試劑均為分析純試劑 H、 步驟 (一）單抗制備 I、 抗原配置：將免疫原(玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449)用生理鹽水稀釋，配成IX 109 CFU/mL的溶液； 2、乳化；將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攬拌法將其乳化，乳化完全 后皮下多點(diǎn)注射小鼠； 3、 免疫；按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用間接競爭法測定效價(jià)，效價(jià)達(dá)到要求 后，進(jìn)行沖刺免疫；沖免3天后眼眶采血后進(jìn)行融合； 4、 采血；第H次免疫后1周進(jìn)行斷尾采血，采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清效 價(jià)； 5、 融合、篩選：采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行融合，采用間接Elisa篩選陽性細(xì)胞孔，采用有限 稀釋法對陽性孔進(jìn)行亞克??； 6、 抗體的純化和保存；采用辛酸-飽和硫酸饋法純化腹水，透析后得到單克隆抗體，采 用微量紫外方法測定其濃度后分裝后放入-2(TC保存。
[0020] (二）ELISA 反應(yīng)過程： 抗體效價(jià)測定步驟： 1、 將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，100 UL/孔，于4 C冰箱過 夜；次日取出酶標(biāo)板回至室溫，每孔注入200 Ul PBST溶液，搖床上振蕩3 min,用力甩掉 洗涂液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗涂2次。W下洗涂方法相同； 2、 充分洗涂后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，220 y L/孔，于37C溫育箱內(nèi)溫育2 h后取 出烘干待用； 3、 將陽性血清系列稀釋對應(yīng)加入到酶標(biāo)板的前7行列，第8行加入陰性血清，100 y L/ 孔，37C賠育1 h后洗涂、拍干； 4、 每孔加入100 U L 1:3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C賠育1 h后洗涂、拍 干； 5、 每孔加入100 U L顯色液（TMB與底物液比例為1:5)，暗處37C反應(yīng)15 min,取出后 每孔加入50 y L終止液（2 mol/L的硫酸)，用酶標(biāo)儀測定吸光值A(chǔ)4W。
[0021] 玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾也法測定步驟： a、 包被；用2 y g/血的11C2包被酶標(biāo)板，100 y L /孔，4°C過夜； b、 洗涂；用PBST洗涂反應(yīng)板H次，每次3min，200 y L /孔，然后甩干反應(yīng)板； C、封閉；含0. 2%明膠的CBS, 220 y L /孔.37°C封閉化； d、 洗涂；同b ; e、 樣品；用PBST將玉米細(xì)菌性枯萎病菌稀釋成1.0Xl〇9、3. 33X 108、1. llXl〇8、 3. 70X107、1.23X107、4. llXl〇6、1.37X 106、4. 57X 105、1.52X 105 cfu/mL 系列濃 度，另設(shè)一個(gè)PBST空白對照。每孔加入100 y L樣品，于37°C溫育Ih ; f、 洗涂；同b ; g、 加酶標(biāo)抗體（10B1-HRP，2. 5yg/mL)，100yL / 孔，37°C反應(yīng)比； K洗涂；同b ; i、 顯色：加底物TMBlOOy L /孔，顯色I(xiàn)Omin ; j、 終止；加終止液50y L /孔； k、 測定；用酶標(biāo)儀檢測0〇4加111。
[002引交叉率的測定 將下香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種，水稻白葉枯病菌，水稻細(xì)菌性谷枯病菌，水稻細(xì)菌性 條斑病菌，下香假單胞菌下香致病變種精確稀釋成IX 108 C化/111以在建立的玉米細(xì)菌性枯 萎病菌雙抗體夾也法體系中檢測吸光值，并設(shè)空白孔和玉米細(xì)菌性枯萎病菌陽性對照，每 個(gè)濃度做6次測定平均值，做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0023] 玉米種子實(shí)際樣品的檢測 取500g超市購買的玉米種子，使用0. 5%的化OCl溶液浸泡5?15min進(jìn)行表面消毒， 然后使用無菌生理鹽水沖洗3次，無菌條件下瞭干。表面消毒后的檢驗(yàn)樣品粉碎，適量無 菌生理鹽水室溫4C條件浸泡過夜。浸泡液轉(zhuǎn)移至離也管中4000 rpm/min條件下離也10 分鐘，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入另外離也管10, 000 rpm/mim條件下離也15 min,棄去上清液， 加2血生理鹽水使之息浮，得到息液。使用國標(biāo)免疫分離方法驗(yàn)證息液為陰性樣品，即取 用的玉米種子未被玉米細(xì)菌性枯萎病菌感染。在息液中添加不同濃度玉米細(xì)菌性枯萎病菌 IXlO 6，5X IO6 ,IXlO7 C化/血）作為陽性質(zhì)控，使用息液作為陰性質(zhì)控，每個(gè)濃度做3個(gè) 重復(fù)。
[0024] 試驗(yàn)結(jié)果如下： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線；本發(fā)明所獲得的抗原檢測的檢測范圍為4.57X 105^1. llXl〇8c化/111以具 體請見說明書附圖1。
[0025] 2、LOD =LOD是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的抗原濃 度，玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾也法LOD為1. 5 X IO4C化/血。
[002引 3、交叉反應(yīng)率（CRo/o) 結(jié)果；玉米細(xì)菌性枯萎病菌正常顯色，而IX 108 C化/mL濃度下的其它測試菌株均為陰 性（P/N<2. 1)。說明建立的玉米細(xì)菌性枯萎病菌夾也法與下香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種，水 稻白葉枯病菌，水稻細(xì)菌性谷枯病菌，水稻細(xì)菌性條斑病菌，下香假單胞菌下香致病變種無 交叉反應(yīng)，具體請見說明書附圖2。
[0027] 4、玉米種子實(shí)際樣品的檢測 結(jié)果；在玉米種子樣品的檢測中，對玉米細(xì)菌性枯萎病菌的回收率為85. 6%、0. 2%，相 對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5. 0%。顯示出所建立的雙抗體夾也化ISA方法在實(shí)際樣品檢測中具有較好 的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，具體請見附表1。
[0028] 表1.雙抗體夾也化ISA對玉米種子中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢測結(jié)果（n=3)

【權(quán)利要求】
1. 一種基于單克隆抗體的檢測玉米種子中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免 疫法，其特征在于 (1) 玉米細(xì)菌性枯萎病菌單克隆抗體的制備 單克隆抗體是采用玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體經(jīng)過特定免疫程序免疫BALB/ c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的； (2) 單克隆抗體的配對篩選 將純化后的5株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn) 行夾心法配對；配對參數(shù)如下：包被抗體2 μ g/mL ;包被液為0. 01M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖 液；標(biāo)品濃度1 X 108cfu/mL ;標(biāo)品稀釋液0. 01M、pH7. 2的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋500倍使用； 在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 5對P/N值>5的配對； (3) 夾心法的建立 選擇檢測限穩(wěn)定、靈敏的配對，即以單克隆細(xì)胞株Η號為包被抗體，單克隆細(xì)胞株I號 作為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下： 包被抗體濃度：2 μ g/mL 包被液：〇. 01M、pH 9. 6碳酸鹽緩沖液 標(biāo)品稀釋液：〇· 〇1Μ、ρΗ7· 2 PBS+0. 2%Tween 酶標(biāo)抗體濃度：2. 5 μ g/mL 反應(yīng)時(shí)間：包被抗體：封閉37°C，2h ;標(biāo)準(zhǔn)品：37°C，lh ;酶標(biāo)抗體：37°C，lh ;顯色 lOmin ； 優(yōu)化后玉米細(xì)菌性枯萎病菌夾心法的LOD :1. 5Χ 104 cfu/mL。
【文檔編號】G01N33/577GK104237519SQ201410510809
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】匡華, 孔德昭, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學(xué)