用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型及生物毒性檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型和檢測(cè)方法，所述肺組織模型包括：氣管，所述氣管內(nèi)限定有氣體通道，所述氣管的兩端設(shè)有分別與所述氣體通道導(dǎo)通的進(jìn)氣口和出氣口；血管，所述血管內(nèi)限定有血液通道，所述血管的兩端設(shè)有分別與所述血液通道導(dǎo)通的進(jìn)液口和出液口；和肺泡單元，所述肺泡單元內(nèi)限定有腔室，所述肺泡單元的壁形成為彈性透氣膜，所述肺泡單元設(shè)在所述血液通道內(nèi)且所述腔室與所述氣體通道導(dǎo)通。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的肺組織模型，實(shí)現(xiàn)了模擬體內(nèi)肺部血液的氣體交換功能以及呼吸應(yīng)變作用；通過(guò)在肺泡單元部分種植細(xì)胞，在后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)肺泡單元的結(jié)構(gòu)和功能的仿生以及模擬免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
【專利說(shuō)明】用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型及生物毒性檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型及生物毒性檢測(cè)方法，更具體地，涉及肺組織模型的體外仿生構(gòu)建以及利用該模型進(jìn)行環(huán)境PM2.5生物毒性以及藥物生物毒性的檢測(cè)。

【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)北京市環(huán)保局公布的數(shù)據(jù)，2013年北京市優(yōu)良天數(shù)僅為176天，不足50%。而五、六級(jí)重污染天數(shù)累計(jì)達(dá)58天?？諝馕廴?“霧霾”)已經(jīng)成為中國(guó)面臨的嚴(yán)重問(wèn)題?？諝馕廴究梢砸鸺毙院吐院粑兰膊。呐K病和肺癌等疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。2014年3月25日，世界衛(wèi)生組織公布的最新數(shù)據(jù)顯示2012年全球因空氣污染死亡的人數(shù)高達(dá)700萬(wàn)。其中，室外空氣污染導(dǎo)致約370萬(wàn)人過(guò)早死亡。其主要原因是暴露于PMlO中。
[0003]PMlO (particulate matter 10)是指空氣中直徑小于10微米的顆粒物。短期的暴露于PMlO中會(huì)造成呼吸系統(tǒng)疾病，但長(zhǎng)期致死的原因主要是由于直徑更小的PM2.5?？諝庵蠵M2.5的來(lái)源復(fù)雜，其中包括物質(zhì)燃燒、汽車尾氣、塵土等。同樣，PM2.5的顆粒成分也非常復(fù)雜，既有有機(jī)物質(zhì)，也有金屬等物質(zhì)。不同來(lái)源和成分的PM2.5顆粒的致病機(jī)理也不盡相同。
[0004]目前，針對(duì)PM2.5毒性的檢測(cè)方法，主要是利用物理方法檢測(cè)空氣中粒子的數(shù)量，然后再根據(jù)數(shù)量范圍估算出其生物毒性。但如前文所述，PM2.5成分的復(fù)雜性，決定了同濃度的不同成分的顆粒物的生物毒性具有差異，物理的檢測(cè)方法已經(jīng)不能準(zhǔn)確表征PM2.5的生物毒性。
[0005]在生物體中，肺是承擔(dān)呼吸作用的重要器官，包含上呼吸道和下呼吸道，由40余種細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)和組成極為復(fù)雜。與血液直接進(jìn)行氣體交換的是肺泡。人肺中具有肺泡300多萬(wàn)個(gè)，面積約70m2，平均直徑200 μ m。PM2.5等有害氣體主要影響的是肺泡，肺泡主要有三種細(xì)胞組成，I型肺泡細(xì)胞，II型肺泡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。I型肺泡細(xì)胞，在肺泡內(nèi)表面展開形成緊密連接，占肺泡約95%的面積，而II型肺泡細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞活性劑，主要起分泌和祖細(xì)胞的功能。巨噬細(xì)胞則存在于肺間質(zhì)，吞噬、清除外來(lái)的塵?；虿≡?br> [0006]研究者對(duì)納米粒子引發(fā)肺及相關(guān)疾病的機(jī)制仍舊缺乏足夠的了解。這是因?yàn)檫@些關(guān)于粒子生物毒性的研究工作多是基于傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)模型和動(dòng)物模型。而傳統(tǒng)的動(dòng)物模型涉及免疫準(zhǔn)確、成本和倫理等問(wèn)題，不是PM2.5毒性研究的理想模型。二維細(xì)胞培養(yǎng)模型缺乏體內(nèi)肺組織的三維特征，使之也不能準(zhǔn)確的表征納米粒子的生物毒性。因此,后續(xù)的研究者利用三維體外肺模型研究肺病機(jī)理，環(huán)境毒性，藥物安全等領(lǐng)域。但面對(duì)體內(nèi)復(fù)雜的肺部組織結(jié)構(gòu)，如何構(gòu)建一個(gè)高度仿生的三維體外肺模型，是一個(gè)重要且困難的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明提出了一種用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型，所述用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)肺組織的仿生。
[0008]本發(fā)明還提出了一種PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法。
[0009]本發(fā)明還提出了一種藥物生物毒性以及吸入式藥物生物毒性的檢測(cè)方法。
[0010]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型，包括:氣管，所述氣管內(nèi)限定有氣體通道，所述氣管的兩端設(shè)有分別與所述氣體通道導(dǎo)通的進(jìn)氣口和出氣口 ；血管，所述血管內(nèi)限定有血液通道，所述血管的兩端設(shè)有分別與所述血液通道導(dǎo)通的進(jìn)液口和出液口 ；和肺泡單元，所述肺泡單元內(nèi)限定有腔室，所述肺泡單元的壁形成為彈性透氣膜，所述肺泡單元設(shè)在所述血液通道內(nèi)且所述腔室與所述氣體通道導(dǎo)通。
[0011]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的肺組織模型，實(shí)現(xiàn)了模擬體內(nèi)肺部血液的氣體交換功能以及呼吸應(yīng)變作用；通過(guò)在肺泡單元部分種植細(xì)胞，在后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)肺泡單元的結(jié)構(gòu)和功能的仿生以及模擬免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
[0012]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型還可以具有如下附加的技術(shù)特征:
[0013]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述肺泡單元形成為空心球狀，所述肺泡單元與所述氣管之間設(shè)有連接管，所述連接管導(dǎo)通所述腔室和所述氣體通道。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述連接管包括兩個(gè)，其中一個(gè)所述連接管與所述進(jìn)氣口連通且另一個(gè)所述連接管與所述出氣口導(dǎo)通。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述血管中部設(shè)有容納腔，所述容納腔與所述血液通道導(dǎo)通且所述容納腔的徑向尺寸大于所述血液通道的徑向尺寸，所述肺泡單元設(shè)在所述容納腔內(nèi)。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型還包括:基底層；血管層，所述血管層設(shè)在所述基底層上，所述血管設(shè)在所述血管層內(nèi)；氣管層，所述氣管層設(shè)在所述血管層上，所述氣管設(shè)在所述氣管層內(nèi)；和封蓋層，所述封蓋層設(shè)在所述氣管層上方并覆蓋所述氣管層。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述氣管、血管和肺泡單元分別由天然生物材料、合成生物材料、聚合物、金屬和非金屬中的一種或多種制成。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述肺泡單元的壁形成為多孔膜。
[0019]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法，包括以下步驟:S1:提供根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型；S2:在所述氣管內(nèi)灌注含有第一細(xì)胞的第一培養(yǎng)基，在所述血管內(nèi)灌注含有第二細(xì)胞的第二培養(yǎng)基；S3:待所述第一細(xì)胞在肺泡單元內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)，且所述第二細(xì)胞在血管內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行灌流培養(yǎng)；S4:停止向所述氣管灌注所述第一培養(yǎng)基，向所述氣管內(nèi)通入含有PM2.5顆粒物的空氣并保持氣壓脈沖；S5:將所述第二培養(yǎng)基更換為第三培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)；S6:檢測(cè)所述肺組織模型的細(xì)胞毒性。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第一細(xì)胞為上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，所述第二細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，所述第二培養(yǎng)基為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，所述第三培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)基，第三培養(yǎng)基中包含游離的免疫細(xì)胞。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型通過(guò)微制造方法、軟光刻方法、3D打印方法中的一種或多種制備而成。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述肺泡單元的制造方法包括:S11:制造內(nèi)芯；S12:通過(guò)電噴在所述內(nèi)芯的表面制造膜結(jié)構(gòu)；S13:去除所述內(nèi)芯，得到所述肺泡單元。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述步驟SI與所述步驟S2通過(guò)細(xì)胞打印技術(shù)集成實(shí)現(xiàn)。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法包括檢測(cè)細(xì)胞活性、納米粒子滲透率和炎癥反應(yīng)。
[0025]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物生物毒性的檢測(cè)方法，包括以下步驟:S1:提供根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型；S2:在所述氣管內(nèi)灌注含有第一細(xì)胞的第一培養(yǎng)基，在所述血管內(nèi)灌注含有第二細(xì)胞的第二培養(yǎng)基；S3:待所述第一細(xì)胞在肺泡單元內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)，且所述第二細(xì)胞在血管內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行灌流培養(yǎng)；S4:停止向所述氣管灌注所述第一培養(yǎng)基，向所述氣管內(nèi)通入空氣并保持氣壓脈沖；S5:將所述第二培養(yǎng)基更換為第三培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)；S6:將藥物加入到第三培養(yǎng)基內(nèi)，并持續(xù)培養(yǎng)；S7:檢測(cè)所述肺組織模型的細(xì)胞毒性。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第一細(xì)胞為上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，所述第二細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，所述第二培養(yǎng)基為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，所述第三培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)基，第三培養(yǎng)基中包含游離的免疫細(xì)胞。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法包括檢測(cè)細(xì)胞活性、納米粒子滲透率和炎癥反應(yīng)。
[0028]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的吸入式藥物生物毒性的檢測(cè)方法，包括以下步驟:S1:提供根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型；S2:在所述氣管內(nèi)灌注含有第一細(xì)胞的第一培養(yǎng)基，在所述血管內(nèi)灌注含有第二細(xì)胞的第二培養(yǎng)基；S3:待所述第一細(xì)胞在肺泡單元內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)，且所述第二細(xì)胞在血管內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行灌流培養(yǎng)；S4:停止向所述氣管灌注所述第一培養(yǎng)基，向所述氣管內(nèi)通入空氣并保持氣壓脈沖；S5:將所述第二培養(yǎng)基更換為第三培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)；S6:將藥物彌散在空氣內(nèi)，并向所述氣管內(nèi)通入含有藥物的空氣并保持氣壓脈沖，并持續(xù)培養(yǎng)；S7:檢測(cè)所述肺組織模型的細(xì)胞毒性。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第一細(xì)胞為上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，所述第二細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，所述第二培養(yǎng)基為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，所述第三培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)基，第三培養(yǎng)基中包含游離的免疫細(xì)胞。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法包括檢測(cè)細(xì)胞活性、納米粒子滲透率和炎癥反應(yīng)。
[0031]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0033]圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型的肺泡單元、氣管以及血管的連接示意圖；
[0034]圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法；
[0035]圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物生物毒性的檢測(cè)方法；
[0036]圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的吸入式藥物生物毒性的檢測(cè)方法。
[0037]附圖標(biāo)記:
[0038]肺組織模型100 ；
[0039]封蓋層I ;氣管層2 ;血管層3 ;基底層4 ;進(jìn)液口 5 ;血管6 ;出液口 7 ;進(jìn)氣口 8 ;氣管9 ;肺泡單元10 ;出氣口 11 ;容納腔12 ;氣體通道13 ;血液通道14 ;連接管15。

【具體實(shí)施方式】
[0040]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0041]在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術(shù)語(yǔ)“中心”、“縱向”、“橫向”、“長(zhǎng)度”、“寬度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底” “內(nèi)”、“外”、“軸向”、“徑向”、“周向”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡(jiǎn)化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0042]此外，術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。
[0043]在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接觸，或第一和第二特征通過(guò)中間媒介間接接觸。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或僅僅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或僅僅表示第一特征水平高度小于第二特征。
[0044]在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術(shù)語(yǔ)“安裝”、“相連”、“連接”、“固定”等術(shù)語(yǔ)應(yīng)做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或成一體；可以是機(jī)械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過(guò)中間媒介間接相連，可以是兩個(gè)元件內(nèi)部的連通或兩個(gè)元件的相互作用關(guān)系。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術(shù)語(yǔ)在本發(fā)明中的具體含義。
[0045]下面結(jié)合附圖詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明第一方面實(shí)施例的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型100。
[0046]參照?qǐng)D1至圖2所示，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型100包括氣管9、血管6和肺泡單元10。
[0047]氣管9內(nèi)限定有氣體通道13，氣管9的兩端設(shè)有進(jìn)氣口 8和出氣口 11，進(jìn)氣口 8和出氣口 11分別與氣體通道13導(dǎo)通。血管6內(nèi)限定有血液通道14，血管6的兩端設(shè)有進(jìn)液口 5和出液口 7，進(jìn)液口 5和出液口 7分別與血液通道14導(dǎo)通。肺泡單元10設(shè)在血液通道14內(nèi)，肺泡單元10內(nèi)限定有腔室，腔室與氣體通道13導(dǎo)通。肺泡單元10的壁形成為彈性透氣膜。氣體可從進(jìn)氣口 8進(jìn)入到氣體通道13內(nèi)，然后經(jīng)過(guò)氣體通道13進(jìn)入到肺泡單元10的腔室內(nèi)，腔室內(nèi)的氣體可與血液通道14內(nèi)的氣體進(jìn)行氣體交換，交換后的氣體從經(jīng)過(guò)氣體通道13后從出氣口 11排出。
[0048]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的肺組織模型100，肺泡單元10的壁形成為彈性透氣膜，肺泡單元10可以隨氣體通道13中氣體壓力的變化而膨脹和收縮，同時(shí)還可以使肺泡單元10的內(nèi)部與外部可以相通，肺泡單元10內(nèi)的氣體可與血液通道14內(nèi)的氣體進(jìn)行交換，實(shí)現(xiàn)了模擬體內(nèi)肺部血液的氣體交換功能。同時(shí)，通過(guò)在肺泡單元10部分種植細(xì)胞，種植細(xì)胞后的肺泡單元10在后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)肺泡的結(jié)構(gòu)和功能的仿生。
[0049]具體而言，可利用氣體通道13模擬體內(nèi)氣管9，可利用血液通道14模擬體內(nèi)的肺部毛細(xì)血管6。肺組織模型100在后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)氣體被壓入肺泡單元10時(shí)，肺泡單元10即可脹大，從而可以模擬體內(nèi)呼吸時(shí)的吸氣過(guò)程；當(dāng)減小氣體壓力后，肺泡單元10可收縮，實(shí)現(xiàn)模擬體內(nèi)呼吸作用時(shí)的呼氣過(guò)程。
[0050]另外，還可以在肺泡單元10處培養(yǎng)免疫細(xì)胞來(lái)模擬體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)肺器官的高度仿生模擬。
[0051]可選地，肺組織模型100的進(jìn)氣口 8可與空氣連通，空氣可從進(jìn)氣口 8進(jìn)入到氣體通道13內(nèi)。其中，空氣成分可以是潔凈的空氣，也可以是人工合成的已知成分和含量的PM2.5納米粒子的空氣，還可以是隨機(jī)產(chǎn)生或采集的含有PM2.5納米粒子的空氣。其中，含PM2.5顆粒物的氣體可為包含各種來(lái)源(金屬、非金屬)和粒子直徑的人工/非人工合成的含顆粒物的氣體。
[0052]空氣從進(jìn)氣口 8進(jìn)入氣體通道13的方式可以是無(wú)壓滲透式，也可以是強(qiáng)迫注入式。其中，強(qiáng)迫注入方式可以包括注射泵、蠕動(dòng)泵、有壓力的氣瓶等。在實(shí)際操作中，可以將注射泵、蠕動(dòng)泵或者壓力氣瓶等連接在進(jìn)氣口 8處，從而使氣體可以容易地進(jìn)入到氣體通道13內(nèi)。
[0053]血管6的進(jìn)液口 5可與營(yíng)養(yǎng)液供應(yīng)裝置相連,營(yíng)養(yǎng)液可通過(guò)進(jìn)液口 5進(jìn)入到血液通道14內(nèi)。營(yíng)養(yǎng)液供應(yīng)裝置可以是注射泵、蠕動(dòng)泵、脈動(dòng)泵等動(dòng)力裝置。
[0054]肺組織模型100在后續(xù)培養(yǎng)時(shí)，可以采用靜態(tài)培養(yǎng)(即不開啟動(dòng)力裝置)，也可以采用動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，即開啟動(dòng)力裝置。
[0055]研究表明:球狀肺泡仿生結(jié)構(gòu)對(duì)構(gòu)建肺組織的準(zhǔn)確性具有重要影響。有利地，如圖2所示，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，肺泡單元10可形成為空心球狀體結(jié)構(gòu)。由此，可以更準(zhǔn)確的模擬生物體的肺組織模型100，實(shí)現(xiàn)了肺泡球狀結(jié)構(gòu)單元的體外仿生構(gòu)建。該仿生單元實(shí)現(xiàn)了模擬體內(nèi)肺部血液的氣體交換功能，呼吸應(yīng)變作用，以及免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的仿生功能，為生物毒性檢測(cè)提供更為有效且可靠的保證。
[0056]研究表明:氣液界面(空氣一血管界面)、免疫細(xì)胞以及呼吸應(yīng)變作用等特征對(duì)構(gòu)建肺組織的準(zhǔn)確性具有重要影響。而根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的肺組織模型100，可在維持肺組織細(xì)胞正常存活的前提下，創(chuàng)新性地構(gòu)建了球狀肺泡仿生結(jié)構(gòu)并且可以與氣液界面(空氣一血管界面)，和/或免疫細(xì)胞，和/或呼吸應(yīng)變作用等肺組織功能集成實(shí)現(xiàn)高度仿生的肺組織模型100。
[0057]同時(shí)還可以根據(jù)需要選擇性地實(shí)現(xiàn)肺組織氣液界面(空氣一血管界面)，免疫細(xì)胞，呼吸應(yīng)變作用及球狀肺泡仿生結(jié)構(gòu)四大特征中一種或多種組合的體外重構(gòu)，為生物毒性檢測(cè)提供更有效可靠的手段。
[0058]可選地，肺泡單元10的直徑可為100微米-200微米，膜厚可為I微米-10微米。
[0059]如圖2所示，肺泡單元10與氣管9之間可設(shè)有連接管15，連接管15可以將腔室和氣體通道13導(dǎo)通。具體地，連接管15的一端可與腔室導(dǎo)通，連接管15的另一端可與氣體通道13導(dǎo)通。由此，從進(jìn)氣口 8進(jìn)入氣體通道13內(nèi)的氣體可通過(guò)連接管15進(jìn)入到肺泡單元10的腔室內(nèi)，同時(shí)腔室內(nèi)的經(jīng)過(guò)交換的氣體可通過(guò)連接管15進(jìn)入到氣體通道13，進(jìn)而從出氣口 11排出肺組織模型100。
[0060]有利地，連接管15可包括兩個(gè)，其中一個(gè)連接管15可與進(jìn)氣口 8連通，另一個(gè)連接管15可與出氣口 11導(dǎo)通。也就是說(shuō)，一個(gè)連接管15可作為氣體進(jìn)入腔室的進(jìn)氣通道，另一個(gè)連接管15則可作為氣體從腔室內(nèi)排出的出氣通道。由此，氣體進(jìn)入和排出腔室分別各占一個(gè)通道，進(jìn)氣和出氣可獨(dú)立開來(lái)，有效避免了進(jìn)氣與出氣發(fā)生混合。
[0061]血管6的中部可設(shè)有容納腔12，容納腔12可與血液通道14導(dǎo)通。同時(shí)容納腔12的徑向尺寸可大于血液通道14的徑向尺寸，肺泡單元10可設(shè)在容納腔12內(nèi)。例如，血液通道14的徑向尺寸可為50微米-200微米。容納腔12可形成為柱狀腔或者其它形狀的腔室。例如，容納腔12可形成為圓柱形腔，容納腔12的徑向尺寸可為300微米，容納腔12的深度(即軸向尺寸)可為300微米。氣體通道13的直徑可為50微米-200微米。
[0062]在肺組織模型100的培養(yǎng)過(guò)程中，血液通道14的內(nèi)壁面上可培養(yǎng)有內(nèi)皮細(xì)胞。肺泡單元10的內(nèi)壁面可培養(yǎng)有肺上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，肺泡單元10的外壁可培養(yǎng)有內(nèi)皮細(xì)胞。由此，可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)肺組織器官的高度仿生。其中，根據(jù)本發(fā)明的一些示例，肺上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞可以包含原代細(xì)胞和/或干細(xì)胞和/或已建系的細(xì)胞和/或去分化后再分化的細(xì)胞。也就是說(shuō)，肺上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均可以包含原代細(xì)胞、干細(xì)胞、已建系的細(xì)胞和去分化后再分化的細(xì)胞中的一種或多種。
[0063]肺泡單元10的壁可形成為多孔膜。即肺泡單元10可為多孔膜結(jié)構(gòu)。該多孔膜結(jié)構(gòu)的肺泡單元10可以使肺泡單元10的內(nèi)部與外部相通，進(jìn)一步模擬了體內(nèi)肺部血液的氣體交換作用。并且可以通過(guò)培養(yǎng)免疫細(xì)胞來(lái)模擬體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)肺器官的高度仿生模擬。
[0064]氣管9可以由天然生物材料、合成生物材料、聚合物、金屬和非金屬中的一種或多種制成。同樣地，血管6和肺泡單元10也可以由以上材料中的一種或多種制成，這可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行合理選擇。另外，肺泡單元10還可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)材料制作形成。
[0065]具體而言，天然生物材料可以為明膠及其衍生物、藻酸鹽及其衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白、纖維連接蛋白等。合成生物材料及聚合物可以為聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等。金屬及非金屬材料可以為硅、鈦及鈦合金、銅及銅合金、鋼、鋁及鋁合金等。
[0066]需要說(shuō)明的是，制造氣管9、血管6或肺泡單元10的材料可以是上述材料中的一種或多種的混合物?？梢岳斫獾氖牵烊簧锊牧?、合成生物材料、金屬及非金屬材料的具體種類不僅限于以上所描述的，還可以是其他物質(zhì)，在此不再詳細(xì)描述。
[0067]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的肺組織模型100的最終實(shí)現(xiàn)形式可以是芯片，也可以是其他類似的模型表現(xiàn)形式，例如生物反應(yīng)器等。例如，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，肺組織模型100為芯片式肺組織模型。具體地，如圖1所示，肺組織模型100除了包括氣管9、血管6、肺泡單元10之外，還包括基底層4、血管層3、氣管層2以及封蓋層I。
[0068]如圖1所示，血管層3可設(shè)在基底層4上，氣管層2可設(shè)在血管層3上，封蓋層I可設(shè)在氣管層2的上方并且覆蓋氣管層2。血管6設(shè)在血管層3內(nèi)，氣管9設(shè)在氣管層2內(nèi)。由此，肺組織模型100由下到上依次為基底層4、血管層3、氣管層2和蓋封層。并且其中夾設(shè)有血管6和氣管9以及肺泡單元10。該肺組織模型100可形成為芯片式的結(jié)構(gòu)，當(dāng)其中培植有細(xì)胞時(shí)，即可實(shí)現(xiàn)在芯片尺度上對(duì)體內(nèi)肺組織的結(jié)構(gòu)和功能的高度仿生，可以更準(zhǔn)確地進(jìn)行生物毒性的檢測(cè)。
[0069]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的肺組織模型100，可以根據(jù)需要選擇性地實(shí)現(xiàn)肺組織氣液界面(空氣一血管6界面)、免疫細(xì)胞、呼吸應(yīng)變作用及球狀肺泡仿生結(jié)構(gòu)四大特征中一種或多種組合的體外重構(gòu)。該模型可用于環(huán)境PM2.5生物毒性的檢測(cè)，也可應(yīng)用于研究肺病機(jī)理以及藥物安全等領(lǐng)域。
[0070]下面結(jié)合附圖詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明第二方面實(shí)施例的PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法。
[0071]如圖3所示，根據(jù)本發(fā)實(shí)施例的PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法可包括以下步驟:
[0072]S1:提供上面所描述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型。
[0073]S2:在肺組織模型的氣管內(nèi)灌注含有第一細(xì)胞的第一培養(yǎng)基，在肺組織模型的血管內(nèi)灌注含有第二細(xì)胞的第二培養(yǎng)基。
[0074]S3:待第一細(xì)胞在肺泡單元內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)并且第二細(xì)胞在血管內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行灌流培養(yǎng)。
[0075]S4:停止向氣管灌注第一培養(yǎng)基，然后向氣管內(nèi)通入含有PM2.5顆粒物的空氣并保持氣壓脈沖。
[0076]S5:將第二培養(yǎng)基更換為第三培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)，檢測(cè)肺組織模型的細(xì)胞毒性。
[0077]其中，在步驟S2中，第一細(xì)胞可為上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，第一培養(yǎng)基可為上皮細(xì)胞培養(yǎng)基。第二細(xì)胞可為內(nèi)皮細(xì)胞，第二培養(yǎng)基可為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。第三培養(yǎng)基可為上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)基，第三培養(yǎng)基中包含游離的免疫細(xì)胞，比如血液中的游離免疫細(xì)胞，白細(xì)胞等。在實(shí)際制備中也可以通過(guò)細(xì)胞打印技術(shù)將SI與S2集成在一起實(shí)現(xiàn)，即將模型的制備和細(xì)胞的灌注集成在一起實(shí)現(xiàn)。由此，在模型的制造過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在通道內(nèi)的可控分布。
[0078]其中，肺組織模型可通過(guò)微制造方法、軟光刻方法、3D打印方法中的一種或多種制備而成。其中，3D打印方法可包括直接3D打印方法和間接3D打印方法等。直接3D打印方法是指芯片和/或細(xì)胞一體打印完成。間接3D打印方法指利用3D打印方法制造通道和/或模具以輔助模型的制造。肺組織模型的制造方法可以是上述方法的一種，也可以是上述多種方法的組合。
[0079]進(jìn)一步地，肺組織模型中的肺泡單元的制造方法可包括以下步驟:
[0080]Sll:制造內(nèi)芯。
[0081]S12:通過(guò)電噴在內(nèi)芯的表面制造膜結(jié)構(gòu)。
[0082]S13:去除內(nèi)芯，得到肺泡單元。
[0083]具體地，肺泡單元的制造可以為利用可去除材料(比如糖)制造內(nèi)芯，再通過(guò)電噴在內(nèi)芯表面制造膜結(jié)構(gòu)，最后去除掉內(nèi)芯來(lái)即可。當(dāng)然，肺泡單元也可以是通過(guò)3D打印方法直接制造。
[0084]在步驟S5中，細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法可以包括檢測(cè)細(xì)胞活性、納米粒子滲透率和炎癥反應(yīng)?？梢岳斫獾氖牵陨纤枋龅纳锒拘缘臋z測(cè)方法僅作為示例進(jìn)行描述，細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法不僅限于此，還可以是其他可以評(píng)估肺細(xì)胞和/或組織生物學(xué)性能的方法，在此不再詳細(xì)描述。
[0085]下面結(jié)合附圖詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明第三方面實(shí)施例的藥物生物毒性的檢測(cè)方法。
[0086]如圖4所示，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物生物毒性的檢測(cè)方法可包括以下步驟:
[0087]S1:提供上面所描述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型。
[0088]S2:在肺組織模型的氣管內(nèi)灌注含有第一細(xì)胞的第一培養(yǎng)基，在肺組織模型的血管內(nèi)灌注含有第二細(xì)胞的第二培養(yǎng)基。
[0089]S3:待第一細(xì)胞在肺泡單元內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)并且第二細(xì)胞在血管內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行灌流培養(yǎng)。
[0090]S4:停止向氣管灌注第一培養(yǎng)基，然后向氣管內(nèi)通入空氣并保持氣壓脈沖。
[0091]S5:將第二培養(yǎng)基更換為第三培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)。
[0092]S6:將待檢測(cè)的藥物加入到第三培養(yǎng)基內(nèi)，并持續(xù)培養(yǎng)。
[0093]S7:檢測(cè)肺組織模型的生物毒性。
[0094]其中，在步驟S2中，第一細(xì)胞可為上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，第一培養(yǎng)基可為上皮細(xì)胞培養(yǎng)基。第二細(xì)胞可為內(nèi)皮細(xì)胞，第二培養(yǎng)基可為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。第三培養(yǎng)基可為上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)基，第三培養(yǎng)基中包含游離的免疫細(xì)胞，比如血液中的游離免疫細(xì)胞，白細(xì)胞等。
[0095]在步驟S7中，細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法可以包括檢測(cè)細(xì)胞活性、納米粒子滲透率和炎癥反應(yīng)。可以理解的是，以上所描述的細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法僅作為示例進(jìn)行描述，細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法不僅限于此，還可以是其他可以評(píng)估肺細(xì)胞和/或組織生物學(xué)性能的方法，在此不再詳細(xì)描述。
[0096]下面結(jié)合附圖詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明第四方面實(shí)施例的吸入式藥物生物毒性的檢測(cè)方法。
[0097]如圖5所示，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的吸入式藥物生物毒性的檢測(cè)方法可包括以下步驟:
[0098]S1:提供上面所描述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型。
[0099]S2:在肺組織模型的氣管內(nèi)灌注含有第一細(xì)胞的第一培養(yǎng)基，在肺組織模型的血管內(nèi)灌注含有第二細(xì)胞的第二培養(yǎng)基。
[0100]S3:待第一細(xì)胞在肺泡單元內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)并且第二細(xì)胞在血管內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行灌流培養(yǎng)。
[0101]S4:停止向氣管灌注第一培養(yǎng)基，然后向氣管內(nèi)通入空氣并保持氣壓脈沖。
[0102]S5:將第二培養(yǎng)基更換為第三培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)。
[0103]S6:將待檢測(cè)的藥物彌散在空氣內(nèi)，并向氣管內(nèi)通入含有藥物的空氣并保持氣壓脈沖，并且持續(xù)培養(yǎng)。
[0104]S7:檢測(cè)肺組織模型的細(xì)胞毒性。
[0105]其中，在步驟S2中，第一細(xì)胞可為上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，第一培養(yǎng)基可為上皮細(xì)胞培養(yǎng)基。第二細(xì)胞可為內(nèi)皮細(xì)胞，第二培養(yǎng)基可為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。第三培養(yǎng)基可為上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)基，第三培養(yǎng)基中包含游離的免疫細(xì)胞，比如血液中的游離免疫細(xì)胞，白細(xì)胞等。
[0106]在步驟S7中，細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法可以包括檢測(cè)細(xì)胞活性、納米粒子滲透率和炎癥反應(yīng)?？梢岳斫獾氖牵陨纤枋龅募?xì)胞毒性的檢測(cè)方法僅作為示例進(jìn)行描述，細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法不僅限于此，還可以是其他可以評(píng)估肺細(xì)胞和/或組織生物學(xué)性能的方法，在此不再詳細(xì)描述。
[0107]實(shí)施例1
[0108]本實(shí)施是通過(guò)構(gòu)建肺組織模型進(jìn)行PM2.5肺毒性評(píng)價(jià)。
[0109]一、肺組織模型介紹
[0110]本實(shí)施例中的肺組織模型為芯片式結(jié)構(gòu)。肺芯片裝置主要由氣管、血管和肺泡單元三部分組成，其中氣管為直徑200微米的通道，與肺泡單元的內(nèi)部相連。血管為直徑200微米的通道，與肺泡單元的外部相連。在與肺泡單元相連的位置為直徑300微米及深度300微米的圓柱腔體結(jié)構(gòu)。其內(nèi)壁培養(yǎng)有內(nèi)皮細(xì)胞。肺泡單元為直徑200微米的空心球狀體結(jié)構(gòu)，膜厚為10微米。并且肺泡單元膜為多孔結(jié)構(gòu)，膜內(nèi)表面培養(yǎng)有肺上皮細(xì)胞，外表面培養(yǎng)有內(nèi)皮細(xì)胞。
[0111]肺芯片裝置的主體材料為明膠-甲基丙烯酸(GelMA)，只有基底層為玻璃。氣管的進(jìn)氣口與含有人工合成的已知成分和含量的PM2.5納米粒子的空氣泵相連，氣管的出氣口與空氣閥相連。血管的進(jìn)液口與裝有培養(yǎng)基的注射泵相連，血管的出液口與廢液收集裝置相連。
[0112]二、肺組織模型的制造及使用
[0113]1.芯片制造與培養(yǎng)工藝
[0114]3D可打印肺組織芯片模型的數(shù)據(jù)產(chǎn)生。具體操作如下:利用三維制圖軟件(Solidworks)設(shè)計(jì)肺芯片的三維結(jié)構(gòu)圖，并保存為STL格式，再利用分層軟件(自開發(fā)軟件)將肺芯片的三維結(jié)構(gòu)圖轉(zhuǎn)化成可被打印機(jī)識(shí)別的文件格式(cli)。
[0115]2.材料的制備
[0116]A)芯片材料(明膠-甲基丙烯酸)的制備
[0117]按照如下方法制備明膠-甲基丙烯酸甲酯:lg明膠(G1890，Sigma，美國(guó))粉末加AlOmL DPBS溶液中，70°C水浴加熱，均勻攪拌至完全融化后，以0.5mL/min緩慢加入ImL甲基丙烯酸甲酯(276685，Sigma,美國(guó))，反應(yīng)2h后取下，待溶液冷卻至室溫，加入40mLDPBS溶液稀釋，用截留分子量12000-14000的透析袋在去離子水中60°C透析3天，冷凍干燥2天，形成白色蓬松泡沫狀固體，為明膠-甲基丙烯酸甲酯聚合物，_80°C干燥保存。
[0118]將上述制備好的明膠-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培養(yǎng)液(11965092，Invitrogen，美國(guó))中，60°C助溶3小時(shí)，形成濃度為0.lg/ml明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，再添加0.005g/ml的光引發(fā)劑(12959，2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮，106797-53-9，英力，中國(guó))粉末溶于0.1 g/ml明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中，Votex振蕩混勻，用0.2 μ m濾膜過(guò)濾后分裝成Iml/管備用，避光4°C低溫保存。并且之后的相關(guān)操作均在避光的條件下進(jìn)行。
[0119]B)犧牲層材料(明膠)的制備
[0120]0.5g明膠(G1890, Sigma,美國(guó))粉末加入1mL DPBS溶液中，70°C水浴加熱，均勻攪拌至完全融化后，用0.2 μ m濾膜過(guò)濾后分裝成Iml/管備用，4°C低溫保存。
[0121]3.芯片打印工藝
[0122]開啟3D細(xì)胞打印機(jī)，將成形室的溫度設(shè)定為10°C，將噴頭溫度設(shè)置為25攝氏度。將制備的兩種打印墨水在37度融化30分鐘后，分別吸入打印機(jī)的兩個(gè)噴頭中。再將構(gòu)建的含有將打印芯片數(shù)據(jù)信息的cli文件導(dǎo)入3D細(xì)胞打印機(jī)中，運(yùn)行程序使3D細(xì)胞打印機(jī)自動(dòng)完成設(shè)計(jì)芯片的打印。值得說(shuō)明的是，芯片的主體材料為GelMA，而明膠被打印在設(shè)計(jì)的通道中，在打印過(guò)程中，起到支撐作用，避免GelMA的懸空打印。兩種材料均在25度及以上為溶膠態(tài)，10度為凝膠態(tài)，而GelMA可以被紫外線交聯(lián)，明膠不能交聯(lián)。
[0123]芯片封閉后，紫外線(5mW/cm2)固化60s后，將成形室溫度升高到37度，3分鐘后，將已經(jīng)融化了的明膠犧牲層通過(guò)通道口吸出來(lái)，而GelMA芯片主體得到保留，完成對(duì)所設(shè)計(jì)芯片結(jié)構(gòu)的制造。
[0124]4.灌注細(xì)胞構(gòu)建肺組織模型
[0125]將芯片進(jìn)行紫外線滅菌30分鐘后，將氣體通道和血液通道分別灌注3 μ g/ml的膠原溶液進(jìn)行包被，通過(guò)氣管的進(jìn)氣口(8)灌注含有肺上皮細(xì)胞NCI H441的培養(yǎng)基RPM1-1640(含10%血清及添加物)，并通過(guò)血管的進(jìn)液口(5)灌注含有人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基EBM-2 (含5%血清及生長(zhǎng)因子)，待培養(yǎng)基充滿通道后，靜置培養(yǎng)2小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行5天灌流培養(yǎng)，以讓細(xì)胞充分融合形成緊密連接。
[0126]5.對(duì)PM2.5空氣的生物毒性進(jìn)行檢測(cè)
[0127]撤掉氣體通道的培養(yǎng)基供應(yīng)，改為通含有PM2.5顆粒物的空氣，并保持有0.3HZ的氣壓脈沖，以讓肺泡單元實(shí)現(xiàn)有規(guī)律地機(jī)械地收縮和膨脹，將血液通道的培養(yǎng)基改為EBM-2和RPM1-1640培養(yǎng)基的1:1混合培養(yǎng)基，再進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)兩周。利用CCK-8試劑盒評(píng)估細(xì)胞毒性。以上所述培養(yǎng)均在37攝氏度，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
[0128]實(shí)施例2
[0129]本實(shí)施是在實(shí)施例1構(gòu)建的肺組織模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物肺毒性評(píng)價(jià)。
[0130]一、肺組織模型介紹
[0131 ] 本實(shí)施例中的肺組織模型與實(shí)施例1中的肺組織模型相同，在此不再詳細(xì)描述。
[0132]二、肺組織模型的制造及使用
[0133]本實(shí)施例中的1、芯片制造和培養(yǎng)工藝，2、材料制備工藝，3、芯片打印工藝，4、灌注細(xì)胞構(gòu)建肺組織模型的步驟與實(shí)施例1中的步驟1，2，3和4相同，在此不再詳細(xì)描述。
[0134]5.對(duì)藥物的生物毒性進(jìn)行檢測(cè)
[0135]撤掉氣體通道的培養(yǎng)基供應(yīng)，改為通含有正?？諝?，并保持有0.3HZ的氣壓脈沖，以讓肺泡單元實(shí)現(xiàn)有規(guī)律地機(jī)械地收縮和膨脹；將血液通道的培養(yǎng)基改為EBM-2和RPM1-1640培養(yǎng)基的1:1混合培養(yǎng)基，再進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)一周。將待檢測(cè)藥物A按所需劑量溶入EBM-2和RPM1-1640培養(yǎng)基的1:1混合培養(yǎng)基，并替代血液通道的培養(yǎng)基，再持續(xù)培養(yǎng)I周。利用CCK-8試劑盒評(píng)估細(xì)胞毒性。以上所述培養(yǎng)均在37攝氏度、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
[0136]實(shí)施例3
[0137]本實(shí)施是在實(shí)施例1構(gòu)建的肺組織模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行吸入式藥物肺毒性評(píng)價(jià)。
[0138]一、肺組織模型介紹
[0139]本實(shí)施例中的肺組織模型與實(shí)施例1中的肺組織模型相同，在此不再詳細(xì)描述。
[0140]二、肺組織模型的制造及使用
[0141]本實(shí)施例中的1、芯片制造和培養(yǎng)工藝，2、材料制備工藝，3、芯片打印工藝，4、灌注細(xì)胞構(gòu)建肺組織模型的步驟與實(shí)施例1中的步驟1，2，3和4相同，在此不再詳細(xì)描述。
[0142]5.對(duì)吸入式藥物的生物毒性進(jìn)行檢測(cè)
[0143]撤掉氣體通道的培養(yǎng)基供應(yīng)，改為通含有正常空氣，并保持有0.3HZ的氣壓脈沖，以讓肺泡單元實(shí)現(xiàn)有規(guī)律地機(jī)械地收縮和膨脹，將血液通道的培養(yǎng)基改為EBM-2和RPM1-1640培養(yǎng)基的1:1混合培養(yǎng)基，再進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)一周。將待檢測(cè)藥物B按所需劑量彌散分布在正?？諝庵?，并替代氣體通道的空氣并保持有0.3HZ的氣壓脈沖，再持續(xù)培養(yǎng)I周。利用CCK-8試劑盒評(píng)估細(xì)胞毒性。以上所述培養(yǎng)均在37攝氏度，5% C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
[0144]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型的其他構(gòu)成以及使用該模型進(jìn)行PM2.5空氣、藥物以及吸入式藥物生物毒性的檢測(cè)方法的其他操作對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可知的，在此不再詳細(xì)描述。
[0145]在本說(shuō)明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。
[0146]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型，其特征在于，包括: 氣管，所述氣管內(nèi)限定有氣體通道，所述氣管的兩端設(shè)有分別與所述氣體通道導(dǎo)通的進(jìn)氣口和出氣口； 血管，所述血管內(nèi)限定有血液通道，所述血管的兩端設(shè)有分別與所述血液通道導(dǎo)通的進(jìn)液口和出液口 ；和 肺泡單元，所述肺泡單元內(nèi)限定有腔室，所述肺泡單元的壁形成為彈性透氣膜，所述肺泡單元設(shè)在所述血液通道內(nèi)且所述腔室與所述氣體通道導(dǎo)通。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型，其特征在于，所述肺泡單元形成為空心球狀，所述肺泡單元與所述氣管之間設(shè)有連接管，所述連接管導(dǎo)通所述腔室和所述氣體通道。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型，其特征在于，所述連接管包括兩個(gè)，其中一個(gè)所述連接管與所述進(jìn)氣口連通且另一個(gè)所述連接管與所述出氣口導(dǎo)通。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型，其特征在于，所述血管中部設(shè)有容納腔，所述容納腔與所述血液通道導(dǎo)通且所述容納腔的徑向尺寸大于所述血液通道的徑向尺寸，所述肺泡單元設(shè)在所述容納腔內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型，其特征在于，還包括: 基底層； 血管層，所述血管層設(shè)在所述基底層上，所述血管設(shè)在所述血管層內(nèi)； 氣管層，所述氣管層設(shè)在所述血管層上，所述氣管設(shè)在所述氣管層內(nèi)；和 封蓋層，所述封蓋層設(shè)在所述氣管層上方并覆蓋所述氣管層。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型，其特征在于，所述氣管、血管和肺泡單元分別由天然生物材料、合成生物材料、聚合物、金屬和非金屬中的一種或多種制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型，其特征在于，所述肺泡單元的壁形成為多孔膜。
8.一種PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: S1:提供根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型； S2:在所述氣管內(nèi)灌注含有第一細(xì)胞的第一培養(yǎng)基，在所述血管內(nèi)灌注含有第二細(xì)胞的第二培養(yǎng)基； 53:待所述第一細(xì)胞在肺泡單元內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)，且所述第二細(xì)胞在血管內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行灌流培養(yǎng)； 54:停止向所述氣管灌注所述第一培養(yǎng)基，向所述氣管內(nèi)通入含有PM2.5顆粒物的空氣并保持氣壓脈沖； 55:將所述第二培養(yǎng)基更換為第三培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)； 56:檢測(cè)所述肺組織模型的細(xì)胞毒性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一細(xì)胞為上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞培養(yǎng)基， 所述第二細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，所述第二培養(yǎng)基為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，所述第三培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)基，第三培養(yǎng)基中包含游離的免疫細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型通過(guò)微制造方法、軟光刻方法、3D打印方法中的一種或多種制備而成。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述肺泡單元的制造方法包括: 511:制造內(nèi)芯； 512:通過(guò)電噴在所述內(nèi)芯的表面制造膜結(jié)構(gòu)； 513:去除所述內(nèi)芯，得到所述肺泡單元。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟SI與所述步驟S2通過(guò)細(xì)胞打印技術(shù)集成實(shí)現(xiàn)。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PM2.5生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法包括檢測(cè)細(xì)胞活性、納米粒子滲透率和炎癥反應(yīng)。
14.一種藥物生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: S1:提供根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型； S2:在所述氣管內(nèi)灌注含有第一細(xì)胞的第一培養(yǎng)基，在所述血管內(nèi)灌注含有第二細(xì)胞的第二培養(yǎng)基； 53:待所述第一細(xì)胞在肺泡單元內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)，且所述第二細(xì)胞在血管內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行灌流培養(yǎng)；54:停止向所述氣管灌注所述第一培養(yǎng)基，向所述氣管內(nèi)通入空氣并保持氣壓脈沖； 55:將所述第二培養(yǎng)基更換為第三培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)； 56:將藥物加入到第三培養(yǎng)基內(nèi)，并持續(xù)培養(yǎng)； 57:檢測(cè)所述肺組織模型的細(xì)胞毒性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一細(xì)胞為上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞培養(yǎng)基， 所述第二細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，所述第二培養(yǎng)基為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，所述第三培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)基，第三培養(yǎng)基中包含游離的免疫細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法包括檢測(cè)細(xì)胞活性、納米粒子滲透率和炎癥反應(yīng)。
17.一種吸入式藥物生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: S1:提供根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的用于生物毒性檢測(cè)的肺組織模型； S2:在所述氣管內(nèi)灌注含有第一細(xì)胞的第一培養(yǎng)基，在所述血管內(nèi)灌注含有第二細(xì)胞的第二培養(yǎng)基； 53:待所述第一細(xì)胞在肺泡單元內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)，且所述第二細(xì)胞在血管內(nèi)壁上貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行灌流培養(yǎng)；54:停止向所述氣管灌注所述第一培養(yǎng)基，向所述氣管內(nèi)通入空氣并保持氣壓脈沖； 55:將所述第二培養(yǎng)基更換為第三培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)； S6:將藥物彌散在空氣內(nèi)，并向所述氣管內(nèi)通入含有藥物的空氣并保持氣壓脈沖，并持續(xù)培養(yǎng)； S7:檢測(cè)所述肺組織模型的細(xì)胞毒性。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的吸入式藥物生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一細(xì)胞為上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞培養(yǎng)基， 所述第二細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，所述第二培養(yǎng)基為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，所述第三培養(yǎng)基為上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)基，第三培養(yǎng)基中包含游離的免疫細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的吸入式藥物生物毒性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法包括檢測(cè)細(xì)胞活性、納米粒子滲透率和炎癥反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】G01N33/48GK104316661SQ201410524951
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月8日
【發(fā)明者】姚睿, 趙雨, 孫偉, 林峰 申請(qǐng)人:清華大學(xué)